高競(jìng)溪，趙曉妍，朱星雨，孫 昭，韓 欽*，趙春華*

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院組織工程研究中心，北京 100005；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100730

隨著年齡的增長(zhǎng),外部與內(nèi)部壓力的累積導(dǎo)致人體的生理完整性(physiological integrity)逐漸受損,同時(shí)組織從壓力中恢復(fù)的能力日漸衰弱,致使機(jī)體功能受損和死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加。臨床數(shù)據(jù)表明,老年人自身免疫疾病、感染、腫瘤等發(fā)病率的上升與免疫系統(tǒng)老化具有密切聯(lián)系[1-2]。免疫系統(tǒng)功能減弱導(dǎo)致衰老細(xì)胞無(wú)法即時(shí)被清除,便會(huì)利用衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)幫助衰老細(xì)胞對(duì)抗免疫系統(tǒng)的清除,導(dǎo)致衰老細(xì)胞積累,加速機(jī)體衰老[3-4]。免疫早衰模型小鼠的各器官呈現(xiàn)衰老相關(guān)損傷并伴隨機(jī)體早衰及壽命縮短,而補(bǔ)充年輕的免疫細(xì)胞可以減緩衰老進(jìn)程[5-6],證明免疫細(xì)胞的衰老及功能減退在機(jī)體衰老過(guò)程中扮演重要的角色。

T細(xì)胞老化可能是“免疫衰老”的主要表現(xiàn)之一,即免疫系統(tǒng)活力的時(shí)間依賴性喪失,損害了有害元素(如微生物或惡性細(xì)胞)的清除[7],同時(shí)增加了導(dǎo)致炎癥和自身免疫疾病等不必要的過(guò)度反應(yīng)。探究免疫細(xì)胞,特別是T細(xì)胞的衰老過(guò)程及其機(jī)制,是緩解與衰老相關(guān)的免疫失衡和應(yīng)激信號(hào)反應(yīng)能力喪失的重要途徑。T 淋巴細(xì)胞的年齡依賴性變化,主要包括初始細(xì)胞的免疫多樣性下降和衰老T細(xì)胞數(shù)量的增加等[8]。

前期研究表明,移植年輕來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)可以下調(diào)衰老小鼠的衰老標(biāo)志物表達(dá)和SASP的分泌,緩解胸腺、脾臟、卵巢等組織的衰老,延長(zhǎng)小鼠[9]和大鼠[10]的健康壽命。但是,關(guān)于MSCs延緩細(xì)胞、組織衰老的探索較為宏觀,其中關(guān)鍵細(xì)胞類型變化的研究尚存在較多空缺。因此,本文擬驗(yàn)證BM-MSCs緩解免疫衰老的作用,并探究其主要改善的免疫細(xì)胞群體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑:抗CD28抗體、抗CD3抗體和IL-2(北京科昕生物科技有限公司);RPMI-1640(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心);胎牛血清(Gibco公司);LIVE/DEADTM可固定近紅外死細(xì)胞染色劑試劑盒、eBioscienceTM流式胞內(nèi)固定破膜緩沖液(Thermo Fisher Scientific公司);CD3-PerCP/Cyanine5.5、CD45-PE、CD62L-PE/Cyanine7、CD44-Brilliant Violet 510(BioLegend公司);CD8α-APC、CD4-APC(Cell Signaling Technology公司); p16INK4a抗體、p21Cip1抗體(Abcam公司);山羊抗兔熒光二抗(金普來(lái)生物科技有限公司);40 μm細(xì)胞過(guò)濾器(BD Falcon公司)。

1.1.2 小鼠:6周齡,SPF級(jí),野生型C57BL/6(H-2b)小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司)。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)在特定無(wú)病原體設(shè)施的隔離籠中。所有程序和方案均經(jīng)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng):從6周齡C57小鼠的后腿分離BM-MSCs,具體提取與培養(yǎng)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。

1.2.2 構(gòu)建體外復(fù)制性衰老模型:從6周齡C57小鼠的脾臟分離脾淋巴細(xì)胞,以2×106個(gè)細(xì)胞每孔接種于24孔板中,以anti-CD28(2.5 μg/mL)、anti-CD3(1 μg/mL)、IL-2(100 U/mL)刺激增殖7 d。

1.2.3 小鼠脾臟細(xì)胞與BM-MSCs共培養(yǎng):絲裂霉素(10 mg/mL)2小時(shí)預(yù)處理BM-MSCs抑制其增殖,以2×105個(gè)細(xì)胞每孔接種于24孔板中,過(guò)夜貼壁,脾淋巴細(xì)胞以2×106個(gè)每孔接種于BM-MSCs預(yù)鋪孔中。

1.2.4 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞衰老表型:以1 mL PBS重懸細(xì)胞,PBS洗滌2次;用LIVE/DEAD-APC-Cy7染色,4 ℃孵育30 min,洗滌2次;用CD45-PE、CD3-PC5.5、CD8-APC、CD44-Bv510、CD62L-PE-Cy7抗體混合染色,4 ℃孵育30 min,洗滌2次;分別用固定緩沖液和滲透緩沖液4 ℃孵育10 min,加入p16/p21抗體,4 ℃孵育40 min,洗滌3次;加入熒光二抗,4 ℃孵育40 min,洗滌3次。樣品通過(guò)40 μm細(xì)胞過(guò)濾器,使用Cytoflex流式細(xì)胞儀分析,FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

A.senescence marker expression in young splenic lymphocytes and replicative senescence model constructed after 7 days of stimulated proliferation in vitro; B.gating strategy for mouse splenic T cells; C.flow cytometry analysis of splenic T cells (CD45+CD3+) in young-Ctrl and aging-Ctrl;*P<0.05, **P<0.001 compared with young-Ctrl.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體外復(fù)制性衰老細(xì)胞模型的構(gòu)建

分離原代小鼠脾臟細(xì)胞,體外用CD3抗體刺激T細(xì)胞增殖,持續(xù)刺激7d,構(gòu)建復(fù)制性衰老細(xì)胞模型。持續(xù)刺激7 d進(jìn)行qPCR定量分析,結(jié)果顯示相比于年輕對(duì)照,衰老模型的典型衰老標(biāo)記(p16、p21)、衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)(IL6、IL8)和炎性衰老標(biāo)記(Granzyme K,GZMK)上調(diào),T細(xì)胞功能相關(guān)的CD28下調(diào),指示T細(xì)胞呈現(xiàn)衰老表型且功能受損。進(jìn)一步流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)揭示, CD45+CD3+T淋巴細(xì)胞(圖1A)p16、p21高表達(dá)的衰老細(xì)胞分別占33.22%±3.9%和41.78%±2.3%,顯著高于年輕對(duì)照組的8.37%±1.7%和3.04%±0.4%(圖1B,C)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以刺激1d的細(xì)胞為年輕對(duì)照(young-Ctrl),持續(xù)刺激7 d的細(xì)胞為衰老對(duì)照(aging-Ctrl)。

2.2 CD8+T細(xì)胞衰老更顯著

進(jìn)一步探究T細(xì)胞不同群體的復(fù)制性衰老表型,在T細(xì)胞的基礎(chǔ)上采用流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)劃分CD4+T細(xì)胞(CD3+CD4+)和CD8+T細(xì)胞(CD3+CD8+)(圖2A),分別檢測(cè)p16、p21的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,對(duì)于體外復(fù)制性衰老模型來(lái)說(shuō),CD8+T細(xì)胞p16、p21高表達(dá)的衰老群體比例分別為64.14%±10.3%和71.85%±3.0%,顯著高于 CD4+T細(xì)胞的17.65%±0.8%和36.23%±1.6%(圖2B)。

2.3 BM-MSCs共培養(yǎng)對(duì)CD8+T細(xì)胞抗衰效果更為明顯

為探究BM-MSCs對(duì)脾臟T淋巴細(xì)胞的作用,將BM-MSCs與復(fù)制性T細(xì)胞衰老模型共培養(yǎng)(aging-Msc),觀察其對(duì)衰老T細(xì)胞的影響。發(fā)現(xiàn)與BM-MSCs共培養(yǎng)后,脾來(lái)源T淋巴細(xì)胞的p16陽(yáng)性比例從34.22%±4.4%下調(diào)至24.15%±1.4%(圖3A)、p21陽(yáng)性比例從41.14%±2.2%下調(diào)至27.05%±4.3%(圖3B),均具有顯著差異,其中CD8+T細(xì)胞的p16、p21陽(yáng)性細(xì)胞比例下調(diào)的均值分別為19.75%和27.91%高于CD4+T細(xì)胞的4.55%和7.92%(圖3A, 3B)。這部分結(jié)果提示復(fù)制性衰老模型中,CD8+T細(xì)胞是衰老最顯著的,也是BM-MSCs延緩衰老表型最顯著的細(xì)胞群體。

A,B.flow cytometry analysis of splentic T cells, CD8+T cells and CD4+T cells, stained with p16(A) or p21(B); The corresponding statistics were shown on the right;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with young-Ctrl.

2.4 BM-MSCs通過(guò)維持CD8+初始T細(xì)胞的比例和狀態(tài)延緩衰老

深入分析發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞的衰老并不同步,而是存在較易衰老的細(xì)胞群體(圖4A)。為探究CD8+T細(xì)胞主要衰老和共培養(yǎng)后延緩衰老的亞群,本文劃分了初始(CD62L+CD44-)、效應(yīng)(CD62L-CD44+)和記憶細(xì)胞(CD62L+CD44+)(圖4B)。分析各細(xì)胞亞群占比發(fā)現(xiàn),年輕對(duì)照組初始細(xì)胞占86.53%、效應(yīng)細(xì)胞占13.44%和記憶細(xì)胞占0.03%,衰老對(duì)照組分別占62.55%、37.34%和0.11%,BM-MSCs共培養(yǎng)后分別占88.62%、10.74%和0.64%。體外持續(xù)刺激的復(fù)制性衰老導(dǎo)致效應(yīng) T細(xì)胞比例上調(diào),對(duì)應(yīng)的初始T細(xì)胞比例下調(diào),共培養(yǎng)后初始T細(xì)胞亞群的比例得到恢復(fù)(圖4C)。由于記憶細(xì)胞絕對(duì)細(xì)胞數(shù)量太少,后續(xù)衰老標(biāo)志比例分析只對(duì)效應(yīng)細(xì)胞和初始細(xì)胞進(jìn)行比較分析。

A.representative flow plots of CD8+ T cells from primary splenocytes (young-Ctrl), replicative senescence model (aging-Ctrl) and senescence model cells cocultured with BM-MSCs (aging-Msc),arrowheads indicate p16/p21-positive cells; B.gating strategy for naive(CD62L+CD44-), effector(CD62L-CD44+)and memory(CD62L+CD44+)CD8+T cells; C.histogram of naive, effector and memory cells proportion in CD8+T cells from young-Ctrl, aging-Ctrl and aging-Msc; D.representative flow cytometry analysis of naive and effector CD8+T cells;E.statistical histogram of the proportion of p21 positive cells in aging-Ctrl and aging-Msc; *P<0.05, **P<0.001 compared with aging-Ctrl.

CD8+T細(xì)胞各亞群的p21表達(dá)都隨增殖時(shí)間的延長(zhǎng)而上調(diào),效應(yīng)細(xì)胞p21陽(yáng)性細(xì)胞比例從年輕組的3.36%±2.5%上調(diào)至83.65%±11.4%,初始細(xì)胞從0.01%±0.02%上調(diào)至2.63%±0.4%(圖4D)。BM-MSCs共培養(yǎng)后效應(yīng)細(xì)胞p21陽(yáng)性比例無(wú)明顯變化,而初始細(xì)胞的p21陽(yáng)性細(xì)胞比例在共培養(yǎng)后從2.63%±0.4%下調(diào)至1.59%±0.2%,(圖4E)。結(jié)合前述細(xì)胞亞群比例的變化(圖4C),得出效應(yīng)細(xì)胞衰老占比升高是CD8+T細(xì)胞p21上調(diào)的主要原因;共培養(yǎng)后初始細(xì)胞p21表達(dá)的下調(diào)及其比例的保持是CD8+T細(xì)胞p21表達(dá)回落的主要原因。

3 討論

如何防治衰老相關(guān)疾病從而實(shí)現(xiàn)健康長(zhǎng)壽是衰老研究中長(zhǎng)期存在的問(wèn)題。作為驅(qū)動(dòng)機(jī)體衰老的重要因素,免疫系統(tǒng)的功能減退導(dǎo)致了機(jī)體感染率增加、癌癥易感性增加以及疫苗效力的降低[7]。有充分的證據(jù)表明,T 淋巴細(xì)胞經(jīng)歷了主要的年齡依賴性變化,其質(zhì)與量的變化是導(dǎo)致衰老時(shí)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答異常的主要原因[6]。此前,本課題組發(fā)現(xiàn)MSCs對(duì)T細(xì)胞的免疫功能起支持作用[12]。那么MSCs是否可以起到延緩T細(xì)胞衰老的作用?如果可以,其主要作用于哪些靶細(xì)胞群體? 基于此,本文構(gòu)建了體外復(fù)制性衰老模型,借助流式細(xì)胞術(shù)劃分不同細(xì)胞群體,并以p16和p21的高表達(dá)指示細(xì)胞衰老。

與刺激增殖1 d的對(duì)照組相比,持續(xù)增殖7 d的T細(xì)胞出現(xiàn)了p16、p21高表達(dá)的衰老細(xì)胞群體。進(jìn)行亞群間比較發(fā)現(xiàn),CD8+T細(xì)胞的衰老表型更為顯著。已經(jīng)有研究表明,與CD4+T細(xì)胞相比,CD8+T細(xì)胞在衰老過(guò)程中可能對(duì)表型和功能的變化更敏感,更快地表現(xiàn)出衰老狀態(tài)[13],這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,也反應(yīng)了復(fù)制性衰老模型可一定程度上模擬T細(xì)胞自然衰老的在體狀態(tài)。BM-MSCs共培養(yǎng)可以延緩衰老T細(xì)胞p16、p21的上調(diào),對(duì)CD8+T細(xì)胞效果最佳,這可能與CD8+T細(xì)胞本身比CD4+T細(xì)胞衰老更為顯著有關(guān)。繼續(xù)對(duì)CD8+T細(xì)胞進(jìn)行亞群細(xì)分,三個(gè)亞群中,效應(yīng)細(xì)胞的衰老最為顯著。但BM-MSCs共培養(yǎng)對(duì)衰老的效應(yīng)細(xì)胞沒(méi)有明顯的影響,反而顯著抑制初始細(xì)胞的衰老。結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的T淋巴細(xì)胞的衰老主要表現(xiàn)為初始細(xì)胞的免疫多樣性下降[14],提示BM-MSCs移植可能通過(guò)抑制初始T細(xì)胞衰老,達(dá)到緩解免疫衰老的目的。

本研究目前還存在很多問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。比如目前的數(shù)據(jù)僅以體外復(fù)制性衰老模型模擬小鼠的免疫衰老,缺少體內(nèi)證據(jù),需要進(jìn)一步完成體內(nèi)驗(yàn)證,才能對(duì)BM-MSCs的抗免疫衰老得出可靠的結(jié)論。此外本研究?jī)H探究了MSCs發(fā)揮抗衰作用的主要靶細(xì)胞,具體分子機(jī)制還有待闡述。免疫衰老是多種細(xì)胞和微環(huán)境共同作用的結(jié)果,為還原在體狀態(tài),本研究與BM-MSCs共培養(yǎng)時(shí)并未分選出CD8+T細(xì)胞,因此可能存在中間細(xì)胞參與BM-MSCs對(duì)CD8+T細(xì)胞的抗衰作用。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了T細(xì)胞體外復(fù)制性衰老細(xì)胞模型,證明了其中CD8+T細(xì)胞衰老表現(xiàn)最顯著。BM-MSCs共培養(yǎng)可以緩解T細(xì)胞衰老,對(duì)于CD8+T細(xì)胞的抗衰作用更顯著,主要作用于抑制了CD8+初始T細(xì)胞的衰老。本文為T細(xì)胞衰老的機(jī)制研究提供了體外模型,為理解T細(xì)胞的衰老過(guò)程和MSCs對(duì)其的延緩作用提供更細(xì)化的視角。