鄭海霞，周王繼，田欣倫*，劉雅萍

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 麥庫(kù)西克-張孝騫協(xié)和遺傳醫(yī)學(xué)中心疑難重癥及罕見病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院2.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 疑難重癥及罕見病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100730

原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙(primary ciliary dyskinesia,PCD)是一種罕見的遺傳病,主要呈常染色隱性遺傳,少數(shù)呈X連鎖隱性遺傳,其發(fā)病率因地域、人種及數(shù)據(jù)來(lái)源不同差異較大,全球范圍內(nèi)約為1/1萬(wàn)～1/4萬(wàn)[1-2],然而在中國(guó)尚缺乏準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)和報(bào)道。由于漏診率較高,實(shí)際發(fā)病率可能高于文獻(xiàn)報(bào)道。PCD是由動(dòng)纖毛結(jié)構(gòu)或功能異常引起的疾病,涉及多個(gè)器官和系統(tǒng),導(dǎo)致包括慢性呼吸道感染、生育問題等一系列臨床癥狀[3]。此外,約50%的PCD 患者可能伴有內(nèi)臟反位,被稱為Kartagener 綜合征。PCD的診斷標(biāo)準(zhǔn)目前尚不統(tǒng)一,臨床上常采用鼻呼出一氧化氮(nasal nitric oxide, nNO)水平檢測(cè)、高速視頻顯微鏡分析(high-speed video microscopy analysis, HSVA)、透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察和基因檢測(cè)進(jìn)行綜合診斷[4]。PCD具有遺傳異質(zhì)性,目前已發(fā)現(xiàn)50多個(gè)致病基因,但仍有約25%的患者未找到其致病基因[5]。

本研究采用臨床表型分析、全外顯子組測(cè)序技術(shù)(whole exome sequencing, WES)、Sanger測(cè)序以及生物信息學(xué)分析等多種方法,對(duì)2例PCD患者的病因?qū)W展開研究,目的在于為該病的基因診斷、遺傳咨詢和精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

患者1,女,37歲,曾有新生兒呼吸窘迫,自幼反復(fù)呼吸道感染。

患者2,男,32歲,10余年來(lái)反復(fù)咳嗽。

2例患者于2022年至2023年在北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診就診。在告知患者及其家屬知情同意書內(nèi)容后,所有成員均簽署知情同意書。咨詢并記錄患者病史及家族史,進(jìn)行相關(guān)臨床資料收集。該研究獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的審查批準(zhǔn)(I-24PJ0444)。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本DNA的提取:使用EDTA抗凝管采集患者外周靜脈血2 mL,用QIAamp全血細(xì)胞DNA提取試劑盒(Qiagen公司)按照說(shuō)明書中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法提取基因組DNA(gDNA)。

1.2.2 全外顯子組測(cè)序檢測(cè)與致病變異篩選:取2 μg患者gDNA委托給諾禾致源生物科技有限公司,進(jìn)行全外顯子組測(cè)序和注釋工作。使用ANNOVAR進(jìn)行變異注釋,包括千人基因組計(jì)劃、ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)、gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)、 dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)等注釋信息,注釋包括變異位置、等位基因頻率、變異保守性預(yù)測(cè)和致病性預(yù)測(cè)等。致病變異篩選參照以下策略:1)符合常染色體隱性或X染色體隱性遺傳的遺傳模式;2)最小等位基因頻率≤0.01;3)位于基因編碼區(qū)或可能影響剪接的位點(diǎn);4)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)致病性。

1.2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證:應(yīng)用Sanger測(cè)序?qū)蜻x變異進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。從University of California Santa Cruz(UCSC)基因組瀏覽器(https://genome.ucsc.edu/)獲取基因序列,使用Primer3在變異位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物,由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。對(duì)患者DNA樣本和正常對(duì)照樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.2.4 變異致病性的分析:參考人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(The Human Gene Mutation Database,HGMD)數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果,根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南對(duì)候選變異位點(diǎn)進(jìn)行致病性評(píng)估。利用Varcards網(wǎng)站(http://www.genemed.tech/varcards/)得到多個(gè)軟件對(duì)候選變異的致病性預(yù)測(cè)(REVEL、CADD和MutationTaster等)、變異在千人基因組、ExAC及gnomAD等多個(gè)人群數(shù)據(jù)庫(kù)中的頻率。綜合人群頻率、預(yù)測(cè)致病性結(jié)果、家系共分離等證據(jù),利用Intervar網(wǎng)站(https://wintervar.wglab.org/),將這些分析結(jié)果結(jié)合起來(lái)確定變異的致病性。

利用Ensembl網(wǎng)站(https://asia.ensembl.org/index.htmll),得到基因結(jié)構(gòu)圖。利用UCSC基因組瀏覽器對(duì)基因變異位點(diǎn)的保守性進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 臨床表型

患者1,女,37歲,曾有新生兒呼吸窘迫,自幼反復(fù)呼吸道感染,有內(nèi)臟轉(zhuǎn)位,右中葉、左舌段和雙下葉支氣管擴(kuò)張伴感染(圖1左),nNO濃度均值為5 ppb(parts per billion),低于125 ppb的臨界值,被診斷為Kartagener 綜合征?；颊卟辉?試管嬰兒孕育子女,子女體健。家族史:父母近親結(jié)婚,姐姐弟弟體健。

圖1 2例患者的支氣管擴(kuò)張表型Fig1 Phenotype diagrams of the two probands with bronchiectasis

患者2,男,32歲,10余年來(lái)反復(fù)咳嗽、咯黃痰,雙肺彌漫支氣管擴(kuò)張合并感染(圖1右),nNO均值為10 ppb,低于125 ppb的臨界值。不育2年。家族史:否認(rèn)父母近親結(jié)婚史,姐姐體健。

2.2 全外顯子組測(cè)序分析與Sanger測(cè)序驗(yàn)證

分析全外顯子組測(cè)序結(jié)果,并進(jìn)行變異篩選,發(fā)現(xiàn)2例患者分別攜帶外動(dòng)蛋白臂對(duì)接復(fù)合物亞基1(outer dynein arm docking complex subunit 1, ODAD1)(NM_144577)基因純合變異和動(dòng)力蛋白軸絲組裝因子6(dynein axonemal assembly factor 6,DNAAF6)(NM_173494)半合子變異?；颊?攜帶ODAD1:c.702_705dupGCAG (p.P236Afs*11),患者2攜帶DNAAF6: c.532_533delCT (p.L178Sfs*2),這2個(gè)變異均未在千人基因組、ExAC及gnomAD等公共數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄,且在HGMD未見報(bào)道。Sanger測(cè)序結(jié)果表明全外顯子組測(cè)序結(jié)果無(wú)誤(圖2)。

圖2 2例患者與正常對(duì)照的ODAD1和DNAAF6變異位點(diǎn)測(cè)序圖

2.3 變異致病性預(yù)測(cè)分析結(jié)果

在兩例PCD患者中檢出2個(gè)未被報(bào)道過的致病變異,均為移碼變異。ODAD1:c.702_705dupGCAG(p.P236Afs*11)在第7號(hào)外顯子插入了4個(gè)堿基后發(fā)生移碼,在繼續(xù)編碼11個(gè)變異的氨基酸后產(chǎn)生提前終止密碼子,導(dǎo)致蛋白產(chǎn)物缺失下游約2/3的序列(圖3A)。DNAAF6: c.532_533delCT(p.L178Sfs*2)在第7號(hào)外顯子上缺失了2個(gè)堿基后發(fā)生移碼,提前產(chǎn)生終止密碼子,影響了下游保守序列(圖3B)。根據(jù)ACMG指南并結(jié)合文獻(xiàn)提供的致病性判定依據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)了2個(gè)新變異的致病性(表1),合并上述分級(jí)證據(jù)判定這2個(gè)新變異均為致病變異。

表1 2例患者變異致病性判定Table 1 Pathogenicity determination of the variants in 2 patients with PCD

Red arrows indicated the location of the pathogenic variant identified in two patients, respectively, amino acid coding diagram from health control and two patients and conservation of the variant sites of ODAD1 gene and DNAAF6 gene (red rectangles indicated the first codon affected by the frameshift variant).

3 討論

PCD是一種罕見的常染色體隱性或X染色體連鎖隱性遺傳病,其致病機(jī)制主要涉及動(dòng)纖毛的結(jié)構(gòu)和功能缺陷。從1999年發(fā)現(xiàn)DNAI1基因突變開始[6],已經(jīng)有超過50個(gè)PCD致病基因相繼被發(fā)現(xiàn),這凸顯了PCD的遺傳異質(zhì)性[5]。絕大部分PCD致病基因是動(dòng)纖毛“9+2”微管結(jié)構(gòu)的組成成分或與其運(yùn)輸、組裝、調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。動(dòng)纖毛分布在呼吸道上皮、大腦室管膜和輸卵管壁等部位。此外精子鞭毛也與動(dòng)纖毛類似,它們都具有“9+2”微管結(jié)構(gòu):外側(cè)的9組二聯(lián)體微管環(huán)繞2個(gè)中央微管(central pair,CP)。中央微管與外周微管之間通過徑向輻條(radial spokes,RS)連接,相鄰的二聯(lián)體微管通過微管連接蛋白(nexin dynein regulatory complexes,N-DRC)連接。此外,外周微管上還對(duì)接內(nèi)動(dòng)力臂(inner dynein arms,IDA)、外動(dòng)力臂(outer dynein arms,ODA) 控制纖毛擺動(dòng)頻率和彎曲幅度[3-7]。

本研究涉及的2個(gè)基因均與ODA的組裝相關(guān)。ODA通過動(dòng)力蛋白錨定復(fù)合體(outer dynein arm docking complexes,ODA-DCs)錨定在外周微管上。ODA到達(dá)錨定位置前,需要?jiǎng)恿Φ鞍纵S絲組裝因子(dynein axonemal assembly factors,DNAAF)招募熱休克蛋白90(HSP90),輔助ODA與ODA-DCs的預(yù)組裝。DNAAF1、DNAAF2和DNAAF3預(yù)組裝ODA重鏈,DNAAF5和DNAAF6預(yù)組裝ODA中鏈,LRRC6預(yù)組裝遠(yuǎn)端纖毛ODA。

ODAD1(outer dynein arm docking complex subunit 1)基因編碼外動(dòng)力臂對(duì)接復(fù)合體亞基,其缺乏會(huì)導(dǎo)致外動(dòng)力蛋白臂(ODA)無(wú)法正確組裝到微管雙聯(lián)體。ODAD1基因全長(zhǎng)23.62 kb,包含14個(gè)外顯子,編碼670個(gè)氨基酸[8]。ODAD1基因突變通常導(dǎo)致ODA缺失,纖毛幾乎完全不動(dòng),并導(dǎo)致典型的PCD臨床表型,包括新生兒呼吸窘迫、nNO水平低、鼻竇炎、中耳炎、支氣管擴(kuò)張和內(nèi)臟轉(zhuǎn)位等[9]?；颊?的ODAD1:c.702_705dupGCAG (p.P236Afs*11)移碼突變引起閱讀框改變從而導(dǎo)致提前終止密碼子產(chǎn)生,可能引起無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解,或產(chǎn)生截短蛋白質(zhì),導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物無(wú)法行使正常的功能,引起患者的PCD表型。

DNAAF6(dynein axonemal assembly factor 6)基因編碼動(dòng)力蛋白軸絲組裝因子,在ODA和IDA的胞質(zhì)預(yù)組裝中起關(guān)鍵作用,這些蛋白隨后通過鞭毛內(nèi)運(yùn)輸(IFT)運(yùn)輸?shù)嚼w毛或鞭毛軸絲。DNAAF6基因全長(zhǎng)37.64 kb,包含7個(gè)外顯子,編碼214個(gè)氨基酸。DNAAF6基因突變導(dǎo)致ODA和IDA的缺失,影響呼吸道纖毛和精子鞭毛的運(yùn)動(dòng)能力[10]。DNAAF6基因突變通常導(dǎo)致患者出現(xiàn)典型的PCD表型,如慢性鼻竇炎、慢性中耳炎、慢性下呼吸道感染、支氣管擴(kuò)張以及nNO水平低和內(nèi)臟轉(zhuǎn)位等。此外,男性患者常常表現(xiàn)出不育的表型,精子活動(dòng)能力差[11]?；颊?的DNAAF6: c.532_533delCT (p.L178Sfs*2)移碼突變導(dǎo)致提前終止密碼子,可能引起無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解,導(dǎo)致蛋白產(chǎn)物無(wú)法行使正常的功能,引起患者的PCD表型。卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)是目前PCD男性患者不育時(shí)夫妻受孕的唯一途徑。有研究表明,中國(guó)目前已有攜帶DNAAF6變異患者通過ICSI成功生育[12],表明 ICSI 對(duì)于有生育意向的DNAAF6突變患者來(lái)說(shuō)可能是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

本研究在2例散發(fā)的PCD患者中分別檢出已知致病基因ODAD1和DNAAF6的移碼突變。2個(gè)變異均未被HGMD收錄,且根據(jù)ACMG指南被判定為致病變異,支持其PCD診斷。以上結(jié)果豐富了ODAD1基因和DNAAF6基因的突變譜,有助于提高PCD的診斷率,并為PCD患者的精準(zhǔn)治療提供新靶點(diǎn)。