王婷婷，蕭 寧，林佃新，董海濤

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1.臨床生物樣本中心；2.醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心；3.口腔科，北京 100730；4.萊鋼集團(tuán)萊蕪礦業(yè)有限公司職工醫(yī)院 內(nèi)科，山東 濟(jì)南 271100

口腔舌鱗狀細(xì)胞癌(oral tongue squamous cell carcinoma,OTSCC)作為最常見的口腔癌類型,具有生長快、侵襲性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn),預(yù)后相對較差。該病在全球的發(fā)病率持續(xù)增加[1-3]。在臨床實(shí)踐中,化學(xué)治療(化療)已廣泛應(yīng)用于OTSCC患者?；陧樸K的化療經(jīng)常用于OTSCC治療,在殺死癌細(xì)胞和抑制腫瘤生長方面具有顯著療效,但該療法存在一些不良反應(yīng),包括疼痛、惡心、嘔吐等,嚴(yán)重影響了患者生活質(zhì)量和治療效果[4]。因此尋找新的化療藥物或者補(bǔ)充治療藥物就顯得格外重要。

大蒜素(allicin)是從食品大蒜中分離得到的一種天然二烯丙基三硫化物化合物,具有多種藥理作用,尤其是抗腫瘤作用。多項(xiàng)研究表明,大蒜素可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖與遷移,并在多種腫瘤中促進(jìn)細(xì)胞凋亡,包括結(jié)直腸癌、肝癌和人腎透明細(xì)胞癌等[5-7],大蒜素可以抑制口腔癌細(xì)胞系Tca-8113和SCC-25增殖[8],促進(jìn)其凋亡,但其作用機(jī)制目前并不清楚。本研究選取人OTSCC細(xì)胞系CAL27進(jìn)行研究,檢測不同濃度大蒜素對CAL27細(xì)胞增殖的影響,并通過轉(zhuǎn)錄本測序分析進(jìn)一步探索機(jī)制。該研究有助于更深入了解大蒜素抑制口腔癌細(xì)胞作用及機(jī)制,為進(jìn)一步腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑:大蒜素(MedChemExpress公司,純度≥98.0%);CCK-8試劑盒, 反轉(zhuǎn)錄酶,SYBR Green(TaKaRa公司);DMEM培養(yǎng)基, TRIzol試劑,Picocure RNA分離試劑盒(Thermo Fisher公司);Illumina?RNA文庫制備試劑盒(深圳華大基因股份有限公司);NEBNext?Ultra(New England Biolabs公司)。

1.1.2 細(xì)胞:人舌磷狀細(xì)胞癌系CAL27[美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC(CRL-2095)]。CAL27細(xì)胞復(fù)蘇后,培養(yǎng)在含有1.2 g/L碳酸氫鈉、2.5 mmol/L L-谷氨酰胺、15 mmol/L HEPES和0.5 mmol/L丙酮酸鈉、含10%胎牛血清DMEM中。將細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2 方法

1.2.1 分組:不同濃度的大蒜素用DMSO溶解,用終濃度分別為5、10、20、40、60、100、200、400 μmol/L大蒜素作用于CAL27細(xì)胞。對照組用DMSO處理。

1.2.2 CCK8法檢測:將細(xì)胞接種在96孔組織培養(yǎng)板中。CAL27細(xì)胞分別用不同濃度(5、10、20、40、60、100、200、400 μmol/L)的大蒜素作用24、48、72 h。將細(xì)胞加入含有10 μL CCK-8的90 μL培養(yǎng)基中,然后在37 ℃和5% CO2條件下孵育。測定450 nm吸光度,細(xì)胞活力用吸光度(A)值表示。細(xì)胞抑制率通過以下公式計(jì)算:細(xì)胞抑制率=(A空白對照-A實(shí)驗(yàn)組)/A空白對照。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time quantita-tive polymerase chain reaction,RT-qPCR):CAL27細(xì)胞用不同濃度(5、10、20、40、60、100、200、400 μmol/L)的大蒜素分別作用48 h。使用TRIzol試劑提取總RNA,并使用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBR Green進(jìn)行RT-qPCR以檢測目的基因的相對mRNA水平。用actin作內(nèi)參。RT-qPCR反應(yīng)條件:98 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s, 循環(huán)32次。引物序列:ki-67-F: 5′-ACGCCTGGTTACTATCAAA AGG-3′,ki-67-R:5′-CAGACCCATTTACTTGTGTTGG A-3′;actin-F:5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,actin-R:5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。通過2-△△Ct公式計(jì)算ki-67相對表達(dá)量。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄本測序及生物信息學(xué)分析:CAL27細(xì)胞用20 μmol/L 大蒜素刺激48 h。使用Picocure RNA分離試劑盒分離總RNA。使用NEBNext?Ultra生成測序文庫TM,將Illumina?RNA文庫制備試劑盒和索引代碼添加到每個(gè)樣本的屬性序列中。每個(gè)樣品使用3 μg總RNA進(jìn)行mRNA分離,然后進(jìn)行裂解和引發(fā),之后依次進(jìn)行cDNA合成、末端修復(fù)/dA拖尾、銜接子連接和文庫擴(kuò)增。在Illumina Hiseq 2500平臺上對RNA文庫進(jìn)行測序,并產(chǎn)生150 bp的配對末端讀數(shù)。

使用STAR進(jìn)行基因組比對;使用edgeR軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析;當(dāng)|log2Foldchange|≥0.41時(shí),基因被認(rèn)為是差異表達(dá)的,并且調(diào)整后P<0.05。使用Cluster Profiler軟件對上調(diào)和下調(diào)的基因進(jìn)行功能富集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 較低濃度的大蒜素即可抑制CAL27細(xì)胞增殖

本研究采用不同濃度大蒜素(5、10、20、40、60、100、200、400 μmol/L)作用于人OTSCC細(xì)胞系CAL27,并用DMSO作對照,結(jié)果顯示,與對照組相比,較低濃度(20 μmol/L)的大蒜素就能明顯抑制CAL27細(xì)胞增殖(P<0.01)(圖1)。

*P<0.01 compared with Ctrl group.

2.2 大蒜素可以抑制增殖相關(guān)標(biāo)志物ki-67表達(dá)

進(jìn)一步用RT-qPCR檢測增殖相關(guān)標(biāo)志物ki-67表達(dá),發(fā)現(xiàn)大蒜素能明顯抑制CAL27細(xì)胞中增殖相關(guān)標(biāo)志物ki-67表達(dá),且在較低濃度(20 μmol/L)就有明顯抑制作用(P<0.01)(圖2)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group.

2.3 轉(zhuǎn)錄本測序結(jié)果顯示大蒜素能明顯抑制腫瘤相關(guān)microRNA表達(dá)

為了研究大蒜素抑制口腔癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制,進(jìn)一步對大蒜素(20 μmol/L)和對照DMSO刺激的CAL27細(xì)胞做了轉(zhuǎn)錄本測序,用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析,發(fā)現(xiàn)大蒜素能明顯抑制腫瘤相關(guān)microRNA表達(dá)(圖3),尤其是miR-200a和miR-199a1的表達(dá)。

圖3 KEGG分析大蒜素刺激后表達(dá)下調(diào)的相關(guān)通路Fig 3 Down-regulated pathways after allicin treatment in KEGG analysis

3 討論

本研究選取人OTSCC細(xì)胞系CAL27進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)較低濃度(20 μmol/L)的大蒜素即可抑制CAL27細(xì)胞增殖,進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄本測序發(fā)現(xiàn)大蒜素能明顯抑制腫瘤相關(guān)microRNA水平,尤其是miR-200a和miR-199a1。該研究有助于更深入了解大蒜素抑制口腔癌細(xì)胞作用及機(jī)制,為進(jìn)一步腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。

文獻(xiàn)報(bào)道用12.5 μg/mL(約70 μmol/L)、 25 μg/mL(約140 μmol/L) 和50 μg/mL(約280 μmol/L)大蒜素刺激OTSCC細(xì)胞系Tca-8113和SCC-25,可降低腫瘤細(xì)胞增殖[8],但作用機(jī)制不清楚,且大蒜素濃度較高,容易引起細(xì)胞過度凋亡。本研究通過摸索多個(gè)濃度大蒜素刺激CAL27細(xì)胞,并進(jìn)行增殖相關(guān)檢測,發(fā)現(xiàn)較低濃度(20 μmol/L)大蒜素即可抑制CAL27細(xì)胞增殖,并通過轉(zhuǎn)錄本測序進(jìn)行機(jī)制探索,為大蒜素可能的轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。本研究所用的OTSCC細(xì)胞系和大蒜素來源均與已報(bào)道文獻(xiàn)中的不同,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在差異。

在過去的十幾年里,關(guān)于microRNA和腫瘤關(guān)系的研究迅速發(fā)展。MicroRNA與癌類型、分期和其他臨床變量相關(guān)。MicroRNA表達(dá)分析也提示了miRNA的致癌或抑瘤作用。MicroRNA在腫瘤生物學(xué)的多個(gè)方面都發(fā)揮著作用,如增殖、凋亡、侵襲/轉(zhuǎn)移和血管生成[9]。miR-200a可能參與多種腫瘤包括宮頸癌等的發(fā)展[10],miR-199a可能參與睪丸生殖細(xì)胞腫瘤等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11]。本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可抑制CAL27細(xì)胞增殖,可能是通過下調(diào)miR-200a和miR-199a1來實(shí)現(xiàn)。