何華美，陸 巍

1.貴州醫(yī)科大學(xué) 麻醉學(xué)院，貴州 貴陽 550000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 疼痛科，貴州 貴陽 550000

嗎啡是臨床上治療重度癌痛的“金標(biāo)準(zhǔn)”藥物[1],然而長期使用會形成嗎啡耐受(morphine tolerance,MT),主要表現(xiàn)為隨著嗎啡的使用出現(xiàn)鎮(zhèn)痛效果下降或需要增加劑量才能維持原有的鎮(zhèn)痛效能,這會導(dǎo)致患者使用依從性下降,陷入鎮(zhèn)痛控制不佳及副作用增加的惡性循環(huán)[2]。目前MT的具體機制仍然未知,了解MT的分子機制,尋找新的治療靶點至關(guān)重要。研究顯示MT模型中CXC趨化因子配體12(C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12)水平顯著上調(diào)[3],中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)內(nèi)注射高劑量CXCL12可降低阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用[4]。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一種小的非編碼的內(nèi)源性RNA,可與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)的特定互補序列結(jié)合,從而調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和蛋白編碼翻譯。研究表明miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)MT的發(fā)展[5],長期使用嗎啡會引起某些miRNAs表達(dá)變化,這些miRNAs與μ阿片受體(μ opioid receptor,MOR) mRNA的3′-UTR互補結(jié)合以阻止MOR的翻譯,導(dǎo)致MOR生物合成降低,最終導(dǎo)致嗎啡耐受[5]。既往研究表明miR-135a-5p調(diào)控CXCL12影響心肌梗死后的炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[6],但在MT模型中尚無文獻報道。本研究通過建立嗎啡耐受小鼠模型,以探討miR-135a-5p靶向Cxcl12對MT的影響及機制,為預(yù)防及治療MT提供新見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:SPF級健康雄性6～8周C57BL/6J小鼠64只,體質(zhì)量18～22 g,尾部完好,小鼠均購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證編號:SCXK(京)2019-0010。所有小鼠均飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,飼養(yǎng)條件:12 h循壞燈光,溫度20～24 ℃,濕度50%～70%,給予動物標(biāo)準(zhǔn)飼料并自由飲水。本實驗所有操作均符合動物倫理要求,并通過貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審查表編號:2201404)。

1.1.2 細(xì)胞來源:人胚胎腎母細(xì)胞HEK 293T購自長沙市檀溪生物科技有限責(zé)任公司。

1.1.3 主要試劑:CXCL12-siRNA、NC-siRNA、miR-agomir、miR-NC、LV-CXCL12、LV-control[慢病毒(lentivirus,LV)上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成];CXCL12抗體(Abcam公司,ab275879);β-actin抗體(proteintech公司,81115-1-RR);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(Merck Millipore公司);鹽酸嗎啡注射液(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司);雙熒光素酶檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,RG021S);總RNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司);實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:采用隨機數(shù)字表法將64只小鼠分為:1)對照(NS)組、2)嗎啡耐受(MT)組、3)CXCL12沉默(CXCL12-siRNA)組、4)沉默陰性對照(NC-siRNA)組、5)miR-135a-5p 激動劑(miR-agomir)組、6)激動劑陰性對照(miR-NC)組、7)miR-135a-5p 激動劑+CXCL12過表達(dá)(miR-agomir+LV-CXCL12)組、8)miR-135a-5p 激動劑+過表達(dá)陰性對照(miR-agomir+LV-control)組。處理:1)組全程每日大腿內(nèi)側(cè)皮下注射等體積0.9%氯化鈉溶液給藥,30 min后進行行為學(xué)測試。2)組全程每日大腿內(nèi)側(cè)皮下注射嗎啡(0.1 mg/mL)10 mg/kg 1次,注射完畢后30 min進行行為學(xué)測試。3)組和4)組第1～3日大腿內(nèi)側(cè)皮下注射嗎啡(0.1 mg/mL)10 mg/kg 1次,行為學(xué)測試完成后分別鞘內(nèi)注射CXCL12-siRNA(5 pmol/μL)5 μL、NC-siRNA(5 pmol/μL)5 μL;5)組和6)組第1～3日大腿內(nèi)側(cè)皮下注射嗎啡(0.1 mg/mL)10 mg/kg 1次,行為學(xué)測試完成后分別鞘內(nèi)注射miR-agomir(20 pmol/μL)5 μL、miR-NC(20 pmol/μL)5 μL;7)組和8)組第1～3日大腿內(nèi)側(cè)皮下注射嗎啡(0.1 mg/mL)10 mg/kg 1次,行為學(xué)測試后鞘內(nèi)注射miR-agomir (20 pmol/μL)5 μL,第4～6日行為學(xué)測試后分別鞘內(nèi)注射LV-CXCL12(1×108TU/L)5 μL、LV-control(1×108TU/L,TU:transducing unit)5 μL。所有分組小鼠均于第7日給藥完畢后處死,取L4～L5脊髓組織-80 ℃保存待檢。

1.2.2 鞘內(nèi)注射:小鼠在2%七氟烷麻醉狀態(tài)下,定位L5～L6棘突間隙作為穿刺點,左手拇指和中指握住小鼠髂嵴以定位L6的棘突,同時向外繃緊皮膚,右手持微量注射器插入L5和L6椎骨的凹槽之間,尾部輕彈表明針頭成功進入硬膜下間隙。當(dāng)尾巴輕彈時,用另一只手緩慢地將agomir或siRNA 5 μL遞送到鞘內(nèi)空間。注射完畢后針頭在穿刺點滯留1 min后拔出,用酒精棉球?qū)Υ┐厅c進行消毒。

1.2.3 行為學(xué)測試:參照文獻[7],每次給藥后30 min把小鼠尾部末端1/3放入恒溫的熱水中(52±0.5)℃,用秒表記錄從小鼠尾部入水到開始甩尾的時間(test tail flick latency,TL),連續(xù)測定3次,兩次間隔5 min。取實驗開始前1日的3次潛伏期的平均值作為基礎(chǔ)甩尾潛伏期(basal tail flick latency,BL)。如果小鼠在10 s內(nèi)不甩尾則將尾部拿離熱水,將潛伏期定為10 s(cut-off time)。當(dāng)TL恢復(fù)至基礎(chǔ)水平可認(rèn)為已產(chǎn)生耐受。計算最大效應(yīng)分率%MPE(percent of maximal potential effect)用以表示藥物對疼痛反應(yīng)的影響。%MPE=(TL-BL)/(cut-off time-BL)×100。

1.2.4 RT-qPCR檢測脊髓組織中CXCL12、miR-135a-5p mRNA表達(dá)水平:TrizolTM試劑提取L4～L5脊髓組織中總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA,參照RT-qPCR 試劑盒說明書進行 RT-qPCR 反應(yīng)。根據(jù)2-△△Ct法計算各組CXCL12、miR-135a-5p mRNA 相對表達(dá)量。引物序列(表1)。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primers of RT-qPCR

1.2.5 Western blot 檢測脊髓組織中CXCL12、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62蛋白表達(dá):脊髓組織中加入裂解液提取各組蛋白,使用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)總濃度,依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入適宜濃度的CXCL12、LC3、p62一抗于 4 ℃ 冰箱孵育過夜,PBS 清洗后,再加入二抗室溫孵育 2 h,PVDF膜用增強型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),Image J 軟件測定各顯色條帶的灰度。以β-actin為內(nèi)參,分析目的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,用 LC3-Ⅱ和 LC3-Ⅰ的灰度值比值做為 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值結(jié)果。

1.2.6 生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C miR-135a-5p與CXCL12關(guān)系:利用生物信息學(xué)預(yù)測工具 TargetScan (http://www.targetscan.org/vert _71/)預(yù)測 miR-135a-5p和CXCL12的結(jié)合位點。設(shè)計合成含有 CXCL12 3′-UTR 野生型 (CXCL12-Wt) 或突變型 (CXCL12-Mut) 片段的psicheck2-CXCL12 3′-UTR 重組報告質(zhì)粒。將質(zhì)粒與miR-135a-5p mimic或NC mimic共轉(zhuǎn)染至 HEK-293T 細(xì)胞中,設(shè)置分組為 miR-135a-5p mimics+CXCL12 Wt組、 mimics-NC+CXCL12 Wt組、 miR-135a-5p mimics+CXCL12 Mut組和 mimics-NC+CXCL12 Mut組,48 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 嗎啡耐受模型的建立

皮下注射嗎啡后MT組的%MPE顯著高于同時間點的NS組(P<0.05)(圖1A),隨著嗎啡給藥時間的延長,MT組的%MPE逐漸降低,直至第7天恢復(fù)至基線值(圖1A)。與對照組相比,模型組小鼠L4～L5脊髓CXC12的mRNA、蛋白表達(dá)較對照組均升高(P<0.05)(圖1B～D),而miR-135a-5p表達(dá)下顯著降(P<0.05)(圖1E)。

A.the percent of maximal potential effect (MPE) in the two groups; B.relative expression of CXCL12 mRNA in the two groups; C,D.Western blot assay of CXCL12 in the two groups;E.relative expression of miR-135a-5p in the two groups;NS: normal saline group;MT: morphine tolerance group;*P<0.05 compared with NS.

2.2 下調(diào)CXCL12表達(dá)可緩解嗎啡耐受小鼠的熱痛刺激

相比于NC-siRNA組,CXCL12 siRNA組CXCL12 mRNA及蛋白水平均下降(P<0.05)(圖2A～C)。溫水甩尾法測試結(jié)果顯示,連續(xù)皮下注射嗎啡后,NC-siRNA組%MPE逐漸減低,第7天恢復(fù)至基線值。然而,CXCL12-siRNA 組%MPE從第3天開始高于同時點的NC-siRNA組(P<0.05)(圖2D)。

A.relative expression of CXCL12 mRNA in the two groups; B,C.Western blot assay of CXCL12 in the two groups;D.the percent of maximal potential effect (MPE) in the two groups;CXCL12-siRNA:silence CXCL12 group;NC-siRNA: negative control group of CXCL12-siRNA;*P<0.05 compared with NC-siRNA.

2.3 上調(diào)miR-135a-5p可緩解嗎啡耐受小鼠的熱痛刺激

與miR-NC組相比,miR-agomir組miR-135a-5p 表達(dá)明顯升高(P<0.05)(圖3A)。連續(xù)皮下注射嗎啡后,miR-NC組%MPE升高,但在第7天降至基線值。與miR-NC組相比, miR-agomir組%MPE從第2天開始升高(P<0.05)(圖3B),持續(xù)至第7天。與miR-NC組相比,miR-agomir組CXCL12 mRNA、蛋白表達(dá)下降(P<0.05)(圖3C～E)。

A.relative expression of miR-135a-5p in the two groups; B.the percent of maximal potential effect (MPE) in the two groups; C.relative expression of CXCL12 mRNA in the two groups;D,E.Western blot assay of CXCL12 in the two groups; miR-agomir: overexpression miR-135a-5p group;miR-NC.negative control group of miR-agomir;*P<0.05 compared with miR-NC.

2.4 Cxcl12與miR-135a-5p的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)預(yù)測到 miR-135a-5p和Cxcl123′-UTR存在結(jié)合位點(圖4A)。miR-135a-5p過表達(dá)顯著降低了含有預(yù)測的野生型Cxcl123′-UTR質(zhì)粒相對熒光素酶活性(P<0.05)(圖4B),而在Cxcl123′-UTR翻譯區(qū)含有突變結(jié)合位點的質(zhì)粒未觀察到該效應(yīng)。

A.prediction of the targeting relationship between miR-135a-5p and Cxcl12 3′-UTR; B.dual-luciferase reporter gene assay to detect the targeting relationship between miR-135a-5p and Cxcl12; miR-135a-5p mimic: over-expression miR-135a-5p group;mimic NC.negative control group of miR-135a-5p mimic;Wt.wide type;Mut.mutant; *P<0.05 compared with mimic NC.

2.5 miR-135a-5p通過CXCL12緩解小鼠熱痛刺激

與agomir+LV-control組相比,agomir+LV-CXCL12組的CXCL12 mRNA與蛋白表達(dá)均顯著上升(P<0.05)(圖5A～C)。溫水甩尾法測試結(jié)果顯示,與agomir+LV-control組相比,agomir+LV-CXCL12組 %MPE從第4天開始下降(P<0.05)(圖5D)。

A.relative expression of CXCL12 mRNA in the two groups; B,C.Western blot assay of CXCL12 in the two groups;D.the percent of maximal potential effect (MPE) in the two groups; miR-agomir: overexpression miR-135a-5p;LV-CXCL12: overexpression CXCL12;LV-control: negative control of LV-CXCL12; *P<0.05 compared with miR-agomir+LV-control.

3 討論

在中重度癌痛患者中嗎啡使用率占89.7%,1周內(nèi)出現(xiàn)嗎啡増量的占35.1%,2個月內(nèi)出現(xiàn)嗎啡增量的達(dá) 71.4%[8]。隨著嗎啡耐受的發(fā)生發(fā)展,為達(dá)到滿意的鎮(zhèn)痛效果,患者需不斷增加嗎啡劑量,然而劑量的增加不僅會加速耐受的形成,還會提升不良反應(yīng)的發(fā)生,造成惡性循環(huán)[9]。故除了疾病本身進展導(dǎo)致疼痛以外,阿片藥物耐受也是目前最亟待解決的難點,尋求預(yù)防及治療嗎啡耐受的方法,對提高癌痛嗎啡耐受患者的生活質(zhì)量有重要意義。既往研究認(rèn)為MT與MOR的內(nèi)吞、脫敏、下調(diào);阿片受體亞型的異聚化;細(xì)胞內(nèi)信號分子及信號通路的改變和神經(jīng)炎性反應(yīng)等機制相關(guān)[10-11],但目前仍無統(tǒng)一定論。

嗎啡耐受通常與痛覺過敏同時出現(xiàn),并且兩者的發(fā)生機制十分相似,故可通過使用無痛生理狀態(tài)下動物建立疼痛模型,測試其痛閾的變化,根據(jù)疼痛閾值下降這一特征性表現(xiàn)來表征嗎啡耐受[12-13]。CXCL12是CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)唯一的配體,研究表明CXCR4與MOR在疼痛傳遞的神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)中共定位,包括背根神經(jīng)節(jié)、脊髓背角和中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì),用CXCR4拮抗劑預(yù)處理能顯著增強嗎啡鎮(zhèn)痛[14]。本研究建立嗎啡耐受小鼠模型,檢測了嗎啡耐受小鼠脊髓組織中CXCL12的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL12表達(dá)升高,敲低Cxcl12表達(dá)可緩解嗎啡耐受小鼠的熱痛覺刺激,這與先前的研究一致。

為明確CXCL12的調(diào)控機制,本研究基于microRNA作用機理進行了進一步的預(yù)測和研究,利用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)Cxcl12的3′-UTR與miR-135a-5p存在結(jié)合位點,最終選擇miR-135a-5p作為Cxcl12的上游研究對象。既往文獻報道m(xù)iR-135a-5p在骨癌痛小鼠疼痛中起到重要作用[15],故有理由推測miR-135a-5p參與嗎啡耐受的發(fā)生,本研究檢測發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受小鼠脊髓中miR-135a-5p表達(dá)水平下降,增加miR-135a-5p表達(dá)可緩解MT小鼠的熱痛刺激,從而減緩耐受形成。為驗證CXCL12與miR-135a-5p的靶向關(guān)系,本研究檢測了過表達(dá)miR-135a-5p的模型組織中CXCL12的表達(dá),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-135a-5p可導(dǎo)致CXCL12表達(dá)下降,說明它們存在負(fù)向調(diào)控關(guān)系。此外,進行了雙熒光素酶基因?qū)嶒?結(jié)果證實了Cxcl12是miR-135a-5p的下游靶基因。為驗證CXCL12對嗎啡耐受的影響是受miR-135a-5p的調(diào)控的,進行了回復(fù)驗證實驗,結(jié)果顯示,miR-135a-5p對嗎啡耐受小鼠的熱痛保護作用可以被CXCL12的過表達(dá)所消除。

綜上所述,本實驗初步明確了miR-135a-5p能靶向調(diào)控CXCL12的表達(dá)從而減緩嗎啡耐受的形成,為尋求嗎啡耐受潛在的機制提供新的見解,并為嗎啡耐受的臨床治療提供潛在的靶點。