宋 可，宋 柯，李靜宇，馬 偉*，楊曉葵*

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院 生殖醫(yī)學(xué)科，北京 100026；2.首都醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，北京 100069

卵母細(xì)胞減數(shù)分裂(oocyte meiosis)是哺乳動物產(chǎn)生單倍體配子的重要生理過程。減數(shù)分裂異常導(dǎo)致的配子發(fā)生障礙或質(zhì)量低下是引發(fā)不孕不育的重要原因。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中,紡錘體牽引染色體運動和分離。因此,紡錘體的正確組裝對于染色體的精確分離具有重要意義。在哺乳動物卵子發(fā)生早期中心粒就退化了,卵母細(xì)胞內(nèi)缺乏中心體結(jié)構(gòu),減數(shù)分裂紡錘體的形成有賴于與中心體發(fā)揮相似功能的無中心粒微管組織中心 (microtubule organizing centers, MTOCs)[1]。MTOCs是由結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、微管釋放蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)構(gòu)成的。其中結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)包括Pericentrin和Cep192等,它們發(fā)揮腳手架功能,形成其他蛋白質(zhì)錨定的平臺。微管成核蛋白質(zhì)主要是γ-tubulin,能夠催化α,β-tubulin二聚體聚合成微管。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)主要包括某些蛋白激酶,如aurora-A等,在減數(shù)分裂恢復(fù)時加入MTOCs,調(diào)節(jié)其功能成熟[2]。卵母細(xì)胞內(nèi)紡錘體在形成后立即向皮質(zhì)區(qū)遷移,由此實現(xiàn)胞質(zhì)分裂的非對稱性,保證形成體積極大的卵子和極小的極體,以使卵子盡可能地保留母源的信息和營養(yǎng)物質(zhì)。紡錘體的遷移依賴于胞質(zhì)中動態(tài)的F-actin網(wǎng)絡(luò),其機(jī)動性取決于囊泡外向型輸送及其與細(xì)胞膜之間的融合[3]。

紡錘體異常組裝蛋白6(spindle assembly abnor-mal protein 6, SAS-6)是體細(xì)胞內(nèi)中心粒的核心構(gòu)建蛋白,它是由N端球形結(jié)構(gòu)域,一段卷曲的結(jié)構(gòu)域和C端構(gòu)成的。SAS-6通過螺旋卷曲的方式形成二聚體結(jié)構(gòu)[4],并進(jìn)一步寡聚化,有助于中心粒的組裝[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)人類SAS-6(human SAS-6, HsSAS-6)通過與γ-微管蛋白環(huán)復(fù)合物(γ-tubulin ring complex, γ-TuRC)相互作用,在微管的形成中起著至關(guān)重要的作用[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞系U2OS中siRNA介導(dǎo)的HsSAS-6的失活消除了使用阿非迪霉素(aphidicolin)處理后中心體的過度復(fù)制,并干擾了正常的中心體復(fù)制周期,表明SAS-6對于中心體的形成發(fā)揮了關(guān)鍵作用,但其潛在的影響機(jī)制尚未完全闡明。

本文研究了SAS-6在體細(xì)胞和小鼠卵母細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位及其與中心體、MTOCs和囊泡之間的關(guān)系,為進(jìn)一步探究其功能和潛在作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗使用21日齡SPF級雄性C57BL/6與雌性BALB/C雜交所生產(chǎn)的F1代小鼠,記為CB6F1[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證編號為SCXK(京)2012-0001];中國倉鼠卵巢細(xì)胞系 (Chinese hamster ovary cell, CHO);MEM Alpha(1×)(Gibco公司);MEM(1×)+ GlutaMAX TM-Ⅰ(Gibco公司);兔抗SAS-6抗體(Genetex公司);鼠抗中心粒周圍蛋白Pericentrin(BD公司);鼠抗高爾基體基質(zhì)蛋白GM130(BD公司);注射用血促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)(寧波第二激素廠);米力農(nóng)milrinone(Selleck公司);牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(中國北京索萊寶科技有限公司);正常山羊血清(normal goat serum, NGS)(Sigma-Aldrich公司);含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)封片劑(Vector Lab公司);PVP粉末(Sigma-Aldrich公司);細(xì)胞裂解液(Laemmli buffer)(Bio-Rad公司);蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail)(Bio-Rad公司);PAGE凝膠快速制備試劑盒(中國雅酶公司);PVDF膜(Millipore公司);Super ECL plus蛋白質(zhì)印跡超敏發(fā)光液(中國南京諾唯贊生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠卵母細(xì)胞收集和體外培養(yǎng):首先向出生3周的雌性CB6F1小鼠給予腹腔注射10 UI的PMSG進(jìn)行超促排卵,在44～48 h后處死小鼠,使用低速二氧化碳窒息法以減輕小鼠的痛苦。隨后戳破卵泡,釋放卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complex, COC),將釋放出的COC收集到另一個37 ℃提前預(yù)熱的HEPES緩沖液中,后轉(zhuǎn)移至MEM(minimum essential medium)培養(yǎng)基中。于體外培養(yǎng)0、2、8和16小時,分別對應(yīng)減數(shù)分裂過程中的幾個關(guān)鍵時期進(jìn)行收樣。

1.2.2蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot):每組樣本收集50個卵母細(xì)胞,在預(yù)熱的PVP溶液中瞬洗3次后,將其加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中,在水浴鍋中100 ℃煮10 min,之后用聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離,得到的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至甲醇激活的PVDF膜上。隨后室溫下使用脫脂牛奶封閉膜1 h,將PVDF膜浸泡在一抗稀釋液中,4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜,使用1×TBST漂洗后再浸泡于相應(yīng)的二抗中,室溫下孵育1 h,用1×TBST漂洗干凈,最后按照1∶1的比例配制發(fā)光液進(jìn)行曝光。抗體主要包括:兔抗SAS-6(1∶1 000);兔抗GAPDH(1∶5 000);辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5 000)。

1.2.3免疫熒光染色(immunofluorecent staining, IF):將培養(yǎng)至相應(yīng)時期的卵母細(xì)胞放入提前配制的1% paraformaldehyde + 0.5% Triton X-100中固定滲透45 min,使用0.2% PBST漂洗3次,每次5 min,隨后室溫下在含10%山羊血清中封閉1 h,于96孔板中用封閉液稀釋一抗,細(xì)胞在稀釋的一抗液中4 ℃孵育過夜。0.2% PBST漂洗細(xì)胞3次,每次15 min,之后使用相應(yīng)標(biāo)記的二抗室溫下避光孵育1 h,再用0.2% PBST漂洗細(xì)胞3次,每次15 min,漂洗干凈后轉(zhuǎn)移至蓋玻片上,最后按照1∶1的比例用含DAPI的封片劑封片。得到的樣品用熒光顯微鏡觀察并分析有絲分裂和減數(shù)分裂各階段中SAS-6和Pericentrin的時空分布相關(guān)性,以及MⅠ期SAS-6與囊泡標(biāo)志物GM130的定位關(guān)系。抗體主要包括: 兔抗SAS-6(1∶100),小鼠抗Pericentrin(1∶3 000)和小鼠抗GM130(1∶100)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SAS-6在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的蛋白表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示SAS-6在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂生發(fā)泡期(germinal vesicle, GV)、生發(fā)泡破裂期(germinal vesicle breakdown, GVBD)、第1次減數(shù)分裂中期(metaphase Ⅰ, MⅠ)和第2次減數(shù)分裂中期(metaphase Ⅱ, MⅡ)均穩(wěn)定高表達(dá),且表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1),這表明SAS-6在減數(shù)分裂中可能發(fā)揮相關(guān)作用。

Western blot showed that SAS-6 was stably expressed at all stages of oocyte meiosis; Each sample contained 50 oocytes.

2.2 SAS-6在體細(xì)胞有絲分裂中的亞細(xì)胞定位(圖2)及其與Pericentrin的相關(guān)性分析

免疫熒光分析顯示在體細(xì)胞有絲分裂間期,團(tuán)狀的染色質(zhì)周圍出現(xiàn)了SAS-6的紅色信號,并且空間上與中心粒周圍蛋白Pericentrin共定位(圖2d);在分裂前期染色質(zhì)逐漸縮短變粗,形成棒狀染色體,兩個中心體也逐漸分開移向相對的兩極,此時SAS-6依然分布于Pericentrin標(biāo)記的中心體上(圖2h);隨著有絲分裂進(jìn)展至中期,每條染色體的著絲點都排列在細(xì)胞中央的一個平面上,即赤道板(圖2i),SAS-6和 Pericentrin同時高度聚集,呈點狀分布于染色體排列區(qū)域的兩側(cè),即紡錘體的兩極(圖2l);直至有絲分裂后期,姐妹染色單體發(fā)生分離,SAS-6和 Pericentrin的信號仍舊保持高度重疊(圖2p)。SAS-6和 Pericentrin在體細(xì)胞中心體的這種共定位模式提示SAS-6極有可能參與中心體的組裝過程。

Blue showed DNA, green showed pericentrin, red showed SAS-6 and yellow showed the superposition of SAS-6 and pericentrin signals; Arrows showed pericentrin, SAS-6 and their co-location signals; IF showed that SAS-6(g,k,o, arrow) and pericentrin(f,j,n, arrow) always showed co-localization characteristics(d,h,i,p, arrow) during somatic cell (CHO) mitosis; GV.germinal vesicle; GVBD.germinal vesicle breakdown; MⅠ.metaphase Ⅰ; TⅠ.telophase Ⅰ; MⅡ.metaphase Ⅱ.

2.3 SAS-6在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的亞細(xì)胞定位(圖3)及其與GM130陽性囊泡的相關(guān)性分析

結(jié)果顯示在減數(shù)分裂GV期,MTOC外周蛋白質(zhì)形成點狀結(jié)構(gòu),此時SAS-6并不與Pericentrin存在空間關(guān)聯(lián)性(圖3Ad),而是呈現(xiàn)不規(guī)則的點片狀分布于一個廣泛的區(qū)域(圖3Ac);在減數(shù)分裂GVBD期,染色質(zhì)凝集,Pericentrin離開生發(fā)泡,并在染色體周圍由單一點狀裂解為擴(kuò)大的片狀聚集(圖3Af),而SAS-6呈現(xiàn)散在的點狀囊泡樣結(jié)構(gòu)分布于胞質(zhì)內(nèi)(圖3Ag),此時SAS-6與Pericentrin不存在相似的空間定位;隨著進(jìn)展至MⅠ期所有染色體整齊排列在赤道板上,Pericentrin聚集形成MTOCs兩極,然而SAS-6還是呈點狀散在彌漫分布于整個胞質(zhì),并不與Pericentrin的信號重合(圖3Al);同樣的,在第1次減數(shù)分裂末期(telophase Ⅰ, TⅠ),Pericentrin逐漸向兩極分離,SAS-6與Pericentrin依然沒有共定位(圖3Ap);直至MⅡ期,第一極體排出(圖3Aq),SAS-6與Pericentrin的分布也并無關(guān)聯(lián),提示在減數(shù)分裂過程中,SAS-6與MTOCs沒有相關(guān)性。

A.immunofluorescence staining(IF) of SAS-6 and pericentrin during GV, GVBD, MⅠ, TⅠ and MⅡ phases in mouse oocyte meiosis; B.immunofluorescence staining of SAS-6 and GM130-positive vesicles in MⅠ phase of mouse oocyte meiosis; a, b showed DNA was labeled in blue, GM130 or pericentrin in green, SAS-6 in red, and the superposition of SAS-6 and GM130 signals in yellow; IF showed that SAS-6 appeared different scales of dotted aggregation-vesicles (Ac,g,k,o,s; Bc, arrow), and the Golgi matrix protein GM130 showed tight colocalization characteristics (Bb-d, arrow), SAS-6 and microtubule organizing centers(MTOCs) protein pericentrin (Ab,f,j,n,r, arrow) did not coincide; Aq.the arrow was shown as the first polar body (1st PBD); GV.germinal vesicle; GVBD.germinal vesicle breakdown; MⅠ.metaphase Ⅰ; TⅠ.telophase Ⅰ; MⅡ.metaphase Ⅱ.

由于SAS-6呈現(xiàn)出不同規(guī)模的點片狀聚集,因此針對MⅠ期卵母細(xì)胞進(jìn)行了SAS-6與囊泡標(biāo)志物GM130的免疫熒光染色實驗,結(jié)果如圖3B顯示,SAS-6的熒光信號與GM130陽性囊泡完全重合,表明與體細(xì)胞不同,SAS-6沒有聚集于Pericentrin陽性的MTOCs上,而是聚集在GM130陽性的囊泡中,提示該分子可能通過調(diào)節(jié)囊泡而參與紡錘體的趨皮質(zhì)區(qū)遷移。

3 討論

SAS-6作為一種中心粒生物發(fā)生早期支架的車輪組裝的中心蛋白,新生中心粒是車輪結(jié)構(gòu),由堆疊的9層對稱SAS-6環(huán)狀聚合物組成[9],SAS-6參與調(diào)節(jié)體細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程中中心粒的生物發(fā)生、中心體的復(fù)制和組裝等多個事件[10-11],其活性異?；虮磉_(dá)缺失會直接損害中心體的結(jié)構(gòu)形成和復(fù)制周期。研究證實在大多數(shù)細(xì)胞中,缺乏SAS-6蛋白會導(dǎo)致中心粒形成失敗。在衣單胞菌和果蠅中,失活突變SAS-6蛋白表現(xiàn)出有缺陷的中心粒和異常數(shù)量的三重微管[12]。在哺乳動物卵子發(fā)生的早期中心粒退化,卵母細(xì)胞內(nèi)沒有中心粒也不組裝成典型的中心體結(jié)構(gòu),而中心粒的結(jié)構(gòu)成分在卵母細(xì)胞中的存在形式和功能一直是未解之謎。本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠卵母細(xì)胞中SAS-6均衡表達(dá)于減數(shù)分裂的各個階段,說明SAS-6仍舊存在于卵母細(xì)胞中。SAS-6在體細(xì)胞有絲分裂過程中聚集在中心體,即與Pericentrin共定位,而該蛋白在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中并沒有定位于MTOCs,而是聚集在胞質(zhì)中的囊泡上。據(jù)報道,Rab蛋白在囊泡運輸中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,Rab11a陽性囊泡可以驅(qū)動小鼠卵母細(xì)胞中肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)動力學(xué),促進(jìn)不對稱的紡錘體定位,以保證卵母細(xì)胞完成不對稱分裂[13]。也有研究證實了Rab8a調(diào)控肌動蛋白絲組裝的ROCK/LIMK通路,進(jìn)而影響了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中高爾基體分布相關(guān)的GM130的募集、紡錘體的遷移和極體擠壓[14]。這些研究均表明紡錘體的趨皮質(zhì)區(qū)遷移與囊泡的功能和作用密切相關(guān)。

本研究中SAS-6的這種分布定位提示其在卵母細(xì)胞內(nèi)的主要功能并不是參與MTOCs調(diào)節(jié)的紡錘體組裝,而是可能通過調(diào)節(jié)囊泡的形態(tài)或機(jī)動性而參與F-actin所驅(qū)動的紡錘體趨皮質(zhì)區(qū)遷移過程。本研究初步涉及SAS-6在小鼠卵母細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位模式及其與GM130陽性囊泡的相關(guān)性,SAS-6影響紡錘體遷移的具體機(jī)制尚需深入研究,從而為認(rèn)識卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟質(zhì)量的確保機(jī)制,以及提高卵母細(xì)胞質(zhì)量提供新的證據(jù)。