楊瀚毅，寧佳怡，汪小蘭，張益萌，謝婷珂1，，陳奕玄1，，韓 靜*

1.西安醫(yī)學(xué)院 眼科學(xué)教研室，陜西 西安 710068；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院 眼科，陜西 西安 710038

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是一種導(dǎo)致失明的嚴(yán)重并發(fā)癥,是成人失明的主要原因[1],但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前,氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS) 導(dǎo)致內(nèi)皮受損被認(rèn)為是DR中血管功能異常的重要因素[2]。H2O2是一種常見(jiàn)的氧活性物質(zhì)(reactive oxygen species, ROS),其可以在內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)中產(chǎn)生或外源性添加[3]。H2O2可以誘導(dǎo)ECs的氧化應(yīng)激,這導(dǎo)致了一系列的負(fù)面結(jié)果,如ECs的凋亡、壞死、老化、增殖受抑制、黏附分子表達(dá)增加、一氧化氮合成減少等[4-5]。褪黑素(melatonin,MT)具有很強(qiáng)的抗氧化作用,可以清除ROS和氮活性物質(zhì)(reactive nitrogen species, RNS),保護(hù)細(xì)胞免受氧化物的侵害[6]。MT調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激在衰老疾病中已經(jīng)有廣泛研究[7],有研究表明MT可能通過(guò)超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase,SOD2)發(fā)揮抗氧化功能[8],但MT對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中氧化應(yīng)激的調(diào)控的機(jī)制研究還尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,該研究旨在探究MT抑制H2O2誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激的機(jī)制,以及對(duì)凋亡標(biāo)志蛋白質(zhì)表達(dá)的影響,從而為探索糖尿病視網(wǎng)膜病變的新治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVECs)(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心);DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素(Gibico公司);CCK8試劑盒、活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)染色試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)檢測(cè)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA) 檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司); p65抗體、p-p65抗體、cleaved-caspase3抗體(Cell Signaling Technology公司);SOD2抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);BCA 試劑盒和酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)和MT(Cayman chemical公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理:將細(xì)胞分為分為對(duì)照組(control),H2O2組:先用CCK8法確定H2O2損傷細(xì)胞的濃度依賴曲線,選用400 mmol/L處理48 h,和MT干預(yù)H2O2組:同時(shí)加入1 mmol/L MT[9]。HUVECs單層培養(yǎng)于含 10%胎牛血清和雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基中,培養(yǎng)箱溫度為 37 ℃、CO2濃度為 5%。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增殖期時(shí)(匯合度大約為 80% ～90%),進(jìn)行傳代和鋪板。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性:將 6×103細(xì)胞接種在 96 孔板中一個(gè)孔內(nèi),等待細(xì)胞密度達(dá)到約 80%后進(jìn)行實(shí)驗(yàn):用 H2O2(100、200、300、400、600、700 mmol/L)的不同濃度處理48 h后,換上完全培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h,根據(jù)IC50,確定模型濃度,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,在每孔中加入 10 μL CCK-8,37 ℃孵育2 h,在酶標(biāo)儀中以450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。

1.2.3 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài):倒置顯微鏡(上海尼康精機(jī)有限公司)觀察control組和H2O2組細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)狀態(tài),并進(jìn)行鏡下拍照。

1.2.4 Western blot檢測(cè)各蛋白質(zhì)表達(dá)水平:將各組細(xì)胞培養(yǎng)和處理后,用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的中性裂解液在冰上裂解細(xì)胞,用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,每組取30 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜操作,用5%牛奶封閉膜后,在4 ℃過(guò)夜孵育一抗( p-p65、p65、SOD2、cleaved-caspase 3和β-actin均為1∶ 1 000)。第2天,用TBST洗膜3次,每次8 min,再用相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1.5 h。洗膜后,用ECL顯色液檢測(cè)信號(hào),重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5 ROS染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量和分布情況:將各組細(xì)胞在共聚焦皿中培養(yǎng)和處理后,去除培養(yǎng)基,用PBS洗滌3次,加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA探針(最終濃度為10 μmol/L),在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育25 min,再用PBS洗滌3次,進(jìn)行熒光觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 試劑盒檢測(cè)SOD活性和MDA、CAT濃度:將各組細(xì)胞在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)和處理后,收集各組細(xì)胞蛋白質(zhì),并按照相應(yīng)試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行處理。用酶標(biāo)儀設(shè)定不同波長(zhǎng)(SOD:450 nm;MDA:532 nm;CAT:520 nm),讀取各孔的A值,并計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)HUVECs氧化應(yīng)激損傷模型的濃度

如圖1所示,CCK8結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,100 mmol/L(88.30±8.48)、200 mmol/L(72.35±8.50)、300 mmol/L(69.09±7.24)、400 mmol/L(47.88±5.88)、500 mmol/L(47.88±5.88)、600 mmol/L(16.91±1.01)和700 mmol/L(13.82±1.32)的H2O2造成HUVECs的活性呈濃度依賴性的降低。根據(jù)IC50416.8,選擇400 mmol/L的濃度進(jìn)行造模(圖1)。

A.measure the absorbance values of HUVECs treated with different concentrations of H2O2 at 450 nm, the x-axis represents the concentration of H2O2, and the y-axis represents the absorbance value at 450 nm; B.the x-axis represents the logarithm of the H2O2 concentration, and the y-axis represents the cell survival rate.

2.2 H2O2誘導(dǎo)HUVECs形態(tài)變化

與對(duì)照組相比,在用400 mmol/L H2O2處理48 h后,HUVECs形態(tài)發(fā)生了變化,明顯回縮,由鋪路石樣變?yōu)樗笮魏烷L(zhǎng)條形。同時(shí),活細(xì)胞的比例也顯著下降,漂浮細(xì)胞明顯增多(圖2)。

Control group; H2O2 group: 400 mmol/L H2O2 treatment for 48 hours.

2.3 MT降低了H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)與凋亡標(biāo)志物的表達(dá)

H2O2組細(xì)胞中p-p65/p65(1.15±0.02)、cleaved-caspase 3(0.91±0.04)的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(p-p65/p65:0.81±0.03,cleaved-caspase 3:0.60±0.03 )(P<0.001),而SOD2(0.66±0.01)的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(0.84±0.10)(P<0.05)。相較于H2O2組,H2O2+MEL組細(xì)胞中SOD2(1.02±0.06)的表達(dá)水平顯著上升(P<0.001),而p-p65/p65(0.73±0.04)(P<0.001)、cleaved-caspase 3(0.69±0.04)(P<0.01)的表達(dá)水平顯著下降(圖3)。

The expression of p-p65, p65, SOD2 and cleaved-caspase 3 in control, H2O2 and H2O2+MT group; The expression of p-p65/p65 in control and H2O2 group; **P<0.001 compared with control group; The expression of p-p65/p65 in H2O2 and H2O2+MT group; ##P<0.001 compared with H2O2 group; The expression of SOD2 in control and H2O2 group; *P<0.05 compared with control group; The expression of SOD2 in H2O2 and H2O2+MT group; ##P<0.001 compared with H2O2 group; the expression of cleaved-caspase 3 in control and H2O2 group; **P<0.001 compared with control group; The expression of cleaved-caspase 3 in H2O2 and H2O2+MT group; #P<0.01 compared with H2O2 group.

2.4 MT降低了H2O2引起的ROS含量增多

H2O2組(6.38±2.25)細(xì)胞中綠色熒光的強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(38.99±3.27)(P<0.001),說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量顯著增加。而MT處理(4.47±1.11)能有效降低綠色熒光的強(qiáng)度(P<0.001),表明MT能減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生(圖4)。

Fluorescence staining was used to detect the ROS levels in control, H2O2 and H2O2+MT group; The ROS levels in control and H2O2 group; *P<0.001 compared with control group; The ROS levels in H2O2 and H2O2+MT group; #P<0.001 compared with control group.

2.5 MT處理氧化應(yīng)激損傷的HUVECs后檢測(cè)SOD活性和CAT、MDA濃度

與對(duì)照組相比, H2O2組的SOD活性(0.20±0.02)(P<0.001)和CAT濃度(2.72±0.68)(P<0.01)明顯低于對(duì)照組(SOD:0.55±0.03,CAT:5.86±0.56),MDA濃度(6.12±0.23)明顯高于對(duì)照組(2.57±0.24)(P<0.001)。而相較于H2O2組,MT處理能夠有效改善氧化應(yīng)激狀態(tài),提高SOD活性(0.42±0.03)(P<0.001)與CAT濃度(4.62±0.93)(P<0.05),降低MDA濃度(3.20±0.40)(P<0.001)(圖5)。

Detection of SOD activity, MDA, and CAT content using kits in control group, H2O2 group and H2O2+MT group; The SOD activity in control and H2O2 group; **P<0.001 compared with control group; The SOD activity in H2O2 and H2O2+MT group; ##P<0.001 compared with control group; The MDA concentration in control and H2O2 group; **P<0.001 compared with control group; The MDA concentration activity in H2O2 and H2O2+MT group; ##P<0.001 compared with control group; The CAT concentration in control and H2O2 group; *P<0.01 compared with control group; The CAT concentration activity in H2O2 and H2O2+MT group; #P<0.05 compared with control group.

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變目前仍是全球勞動(dòng)適齡人口失明的主要原因之一。由于其發(fā)病機(jī)制尚未明確,目前的治療手段也存在諸多局限性,主流的注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)藥物的治療手段可能會(huì)由于內(nèi)皮細(xì)胞突變和血管重塑等原因?qū)е乱徊糠只颊邔?duì)其產(chǎn)生耐藥[10]。因此,研究新的有效的靶點(diǎn)及藥物治療手段不僅能夠?yàn)榛颊咛峁┬碌闹委熯x擇,也對(duì)進(jìn)一步明確糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血管受損嚴(yán)重影響著眼部血管的健康,特別是在糖尿病視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮重要的作用[11]。MT已經(jīng)在衰老疾病領(lǐng)域中展現(xiàn)出不俗的抗氧化能力。有研究表明,MT能夠改善楓糖尿病中神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激引起的記憶障礙[12]。同時(shí),MT也能夠抑制凋亡相關(guān)因子的釋放和表達(dá),達(dá)到抗凋亡的目的[13]。但是,MT對(duì)氧化應(yīng)激的作用機(jī)制還尚未明確,以及MT調(diào)控HUVECs中氧化應(yīng)激的機(jī)制也鮮有報(bào)道。該研究用MT處理H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的HUVECs,觀察其氧化應(yīng)激水平以及相關(guān)標(biāo)志蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。研究結(jié)果表示,MT能夠上調(diào)H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激SOD2的表達(dá)降低以及減少ROS的含量。SOD2作為一種重要的抗氧化劑,能直接在線粒體內(nèi)清除ROS,避免線粒體受到氧化應(yīng)激損傷。因此,MT介導(dǎo)的ROS含量減少可能是通過(guò)增加SOD2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,除此之外,試劑盒檢測(cè)總SOD、MDA和CAT結(jié)果表示,MT能增加總SOD的活性以及CAT濃度,并減少M(fèi)DA濃度。這些因子中,MDA在一定程度上反應(yīng)氧化應(yīng)激的水平,而CAT則是一種重要的抗氧化酶。該結(jié)果更說(shuō)明了MT有強(qiáng)大的抗氧化能力。同時(shí),MT減少了H2O2介導(dǎo)的p-p65/p65和cleaved-caspase表達(dá)升高。p-p65/p65能夠反應(yīng)NF-κB通路的活性,其與炎性反應(yīng)有著密切關(guān)系[14],而caspase 3是一種關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行因子,它可以被激活并裂解為cleaved-caspase 3發(fā)揮作用,促進(jìn)細(xì)胞凋亡?？傊?H2O2通過(guò)減少SOD2的表達(dá),介導(dǎo)HUVECs的氧化應(yīng)激損傷,同時(shí)增加了NF-κB通路的活性以及凋亡因子cleaved-caspase 3的表達(dá),而MT能夠抑制這一過(guò)程。因此,MT有望成為糖尿病視網(wǎng)膜病變和其他氧化應(yīng)激損傷和凋亡相關(guān)血管疾病的潛在治療方法。