劉 瀟，王曌慧，魏心怡，周 玥，趙 麗，王 玥，3，李俊發(fā)*

1.首都醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 神經(jīng)生物學系，北京 100006；2.首都醫(yī)科大學附屬北京安定醫(yī)院 國家精神心理疾病臨床醫(yī)學研究中心 精神疾病診斷與治療北京市重點實驗室，北京 100088；3.首都醫(yī)科大學 人腦保護高精尖創(chuàng)新中心，北京 100069

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的主要臨床表現(xiàn)為認知功能障礙。糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種以高血糖為特征的代謝性疾病。AD和DM之間密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn),DM患者患有AD的風險增加[1],但具體分子聯(lián)系尚不清楚。

AD的全基因組關(guān)聯(lián)研究得出的髓系細胞觸發(fā)受體-2(triggering receptor expressed on myeloid cells-2,TREM2)與神經(jīng)變性病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。與此同時,有一些實驗發(fā)現(xiàn)TREM2和DM神經(jīng)功能失調(diào)相關(guān),本實驗室前期工作發(fā)現(xiàn),第8和第15周DM小鼠前額葉皮層TREM2蛋白mRNA水平明顯增加[3]。以上研究提示TREM2可能是AD和DM的共同致病相關(guān)基因。

本研究在PubMed找到一個數(shù)據(jù)集GSE143951,展示了TREM2R47H突變AD患者iPSCs分化為神經(jīng)元的基因表達情況。目前只在PubMed數(shù)據(jù)集檢索到GSE161355數(shù)據(jù)庫記錄了DM患者腦組織轉(zhuǎn)錄組的變化。本研究將兩個數(shù)據(jù)集聯(lián)合起來,探討了DM和AD認知功能障礙中TREM2突變相關(guān)的核心基因及可能的治療靶點,為DM合并AD患者治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:6～8周齡的SPF級雄性成年野生型(wild-type,WT)C57BL/6J小鼠和Trem2小膠質(zhì)細胞特異性敲除(Trem2CKO)C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量18～22 g(北京維通利華實驗動物有限公司)。已經(jīng)通過首都醫(yī)科大學倫理委員會審查(AEEI-2021-023)。

1.1.2 試劑:鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ購自Sigma Aldrich公司);血糖試紙(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司);SNAP25多克隆抗體(Proteintech公司);羊抗兔IgG抗體 (Thermo Fisher Scientific公司);羊抗鼠IgG抗體 (Jackson ImmunoResearch公司)。

1.2 方法

1.2.1 微陣列數(shù)據(jù)的收集:微陣列表達譜數(shù)據(jù)集GSE161355,GSE143951和 GSE36980從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載。其中微陣列數(shù)據(jù)集GSE161355基于平臺GPL570 ([HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array);微陣列數(shù)據(jù)集GSE143951基于平臺GPL16043[ GeneChip?PrimeViewTMHuman Gene Expression Array(with External spikes-in RNAs)];微陣列數(shù)據(jù)集GSE36980基于平臺GPL6244 ([HuGene-1_0-st] Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array[transcript (gene) version])。GSE161355包含:糖尿病患者和健康人大腦皮層神經(jīng)元,皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)血管的內(nèi)皮細胞的基因表達變化; GSE143951分組為:AD患者和健康人iPSCs的基因表達變化;GSE36980分組為:AD患者和健康人額葉皮層,海馬和顳葉皮層的基因表達變化。

1.2.2 差異表達的分析:采用在線分析工具GEO2R進行差異表達分析;在GSE131655中,比較DM患者和健康對照的表達譜來鑒定DEGs。在GSE143951中,通過比較TREM2中攜帶R47H突變的患者和正常對照個體的iPSCs的表達譜來鑒定DEGs。P值和調(diào)整后的P值采用t檢驗計算。保留每個樣本中符合以下標準的基因: 1)|log2(fold-change)|>1;2)調(diào)整后的P<0.05。根據(jù)細胞類型將GSE131655數(shù)據(jù)集分為3組。星形膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元分別獨立分析,3組的DEGs取交聯(lián)合集。使用在線工具Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制了DEGs的維恩圖。

1.2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)分析:PPI網(wǎng)絡(luò)分析基于兩種疾病中DEGs共同改變的Venn圖結(jié)果,使用在線數(shù)據(jù)庫STRING (https://string-db.org/)。將交互得分>0.4作為閾值。此外,利用Cytoscape v3.6.0軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化和構(gòu)建。與相鄰節(jié)點交互次數(shù)最多的節(jié)點稱為中心節(jié)點。使用Cytohubba鑒定該網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。利用MCC(maximum Clique Centrality)算法,根據(jù)得到每個基因的度并排序,根據(jù)排序,將前4位確定為核心基因。MCODE(minimum Common Oncology Data Elements)算法用于識別顯著基因簇并獲得聚類得分(篩選標準:度截止值=2;節(jié)點評分截止值=0.2;k-core=2;最大深度=100)。最后,將所有結(jié)果相結(jié)合得到最終的核心基因。

1.2.4 Morris水迷宮:Morris水迷宮是檢測動物空間學習記憶能力的一種行為學方法。具體步驟參考文獻[4]的實驗方法。

1.2.5 Western blot檢測蛋白質(zhì)表達:取小鼠大腦海馬組織,加入RIPA、蛋白酶抑制劑,磷酸酶抑制劑,研磨組織,超聲30個循環(huán),每個循環(huán)持續(xù)30 s,間隔30 s,12 000×g,4 ℃,離心12 min,取上清,用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度,4 ℃一抗孵育過夜(稀釋比例均為1∶500),TBST清洗3次,室溫孵育二抗2 h,TBST清洗3次,顯影,Image J測定蛋白質(zhì)吸光度值,以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參,計算蛋白質(zhì)條帶吸光度值的比值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因的篩選

在本研究中,選擇了2種不同疾病的微陣列數(shù)據(jù)集,通過生物信息學方法探索2種疾病中起作用的DEGs及其顯著性。在GSE161355中,星形膠質(zhì)細胞中有2 282個DEGs,1 145個上調(diào)和1 137個下調(diào)基因;內(nèi)皮細胞中有2 682個DEGs,包括1 545個上調(diào)和1 137個下調(diào)基因;神經(jīng)元中有993個DEGs,包括653個上調(diào)和340個下調(diào)基因。GSE143951共有19 152個DEGs,其中上調(diào)基因10 176個,下調(diào)基因8 976個。接下來,使用熱圖和火山圖來可視化2個微陣列數(shù)據(jù)集中的DEGs,如圖1A～H所示。此外,在2個數(shù)據(jù)集中,有53個DEGs在DM和AD之間重疊,其中14個基因上調(diào)共存,5個基因下調(diào)共存(圖1I)。

A-C.respective volcano plots of three different cell types in GSE161355; The red plots represented upregulated genes (logFC>1 and P<0.05); The black plots represented nonsignificant genes (|logFC|<1 or P>0.05)); The blue plots represented downregulated genes (logFC<-1 and P<0.05);D-F.respective heatmaps of three different cell types of DEGs in GSE161355; Red rectangles represented high expression; Blue rectangles represented low expression;G.volcano plot of GSE143951;The red plots represented upregulated genes (logFC>1 and P<0.05); The black plots represented nonsignificant genes (|logFC|<1 or P<0.05); The blue plots represented downregulated genes (logFC<-1 and P<0.05);H.heatmap of DEGs in GSE143951; Red rectangles represented high expression; Blue rectangles represented low expression;I.venn diagram of DEGs from two microarray datasets.

2.2 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

本實驗使用STRING對GSE161355和GSE143951中發(fā)現(xiàn)的19個共同改變的DEGs進行了PPI分析,并通過Cytoscape進行了可視化(圖2A)。通過MCC算法計算9個DEGs(圖2B)。使用MCODE插件識別基因簇模塊。在這個PPI網(wǎng)絡(luò)中,確定了一個得分為3.33的模塊(圖2C)。根據(jù)基因的秩分布和MCODE插件的計算結(jié)果,本實驗選擇了DNER、GFAP、GRM5、SNAP25作為核心基因,是PPI網(wǎng)絡(luò)中最重要的基因,可能在DM和AD中發(fā)揮重要作用。

A.based on the STRING online database, 8 DEGs were filtered into the DEGs PPI network; cytoscape network visualization of the 8 nodes and 8 edges; the nodes represented DEGs; the edges represented links between DEGs,Red represented upregulated genes; blue represented downregulated genes;B.based on cytohubba analysis Module 1 contained 8 nodes and 8 edges; different colors represented different rank of genes; C.based on Mcode analysis Module 2 which represented the most significant module from the PPI network contained 4 nodes and 5 edges.

2.3 4個核心基因在AD中的ROC曲線

通過網(wǎng)站(https://www.bioinformatics.com.cn)分析4個核心基因在GSE36980中,額葉皮質(zhì)、海馬和顳葉皮質(zhì)的表達譜,并繪制ROC曲線。曲線下面積(AUC)可以用來評價ROC曲線的凹凸程度。結(jié)果顯示,SNAP25在額葉皮層(AUC:0.764)(圖3D)和海馬(AUC:0.889)(圖3H)的診斷價值最高,而GFAP在顳葉皮層的診斷價值最高(AUC:0.840)。其他基因的診斷價值如下::在額葉皮層,DNER(AUC:0.692),GFAP(AUC:0.662),GRM5(AUC:0.582)(圖3A～C);在海馬區(qū),DNER(AUC:0.521)、GFAP(AUC:0.643)、GRM5(AUC:0.809)(圖3E～G);在顳葉皮層,DNER(AUC:0.676),GRM5(AUC:0.818),SNAP25(AUC:0.800)(圖3I～L)。由于SNAP25在額葉皮質(zhì)和海馬中均具有良好的診斷性能,假設(shè)SNAP25可能是額葉皮質(zhì)和海馬中DM和AD的生物標志物。

A-D.ROC curve of 4 hub genes in frontal cortex;E-H.ROC curve of 4 hub genes in hippocampus;I-L.ROC curve of 4 hub genes in temporal cortex;AUC area under the ROC curve; X-axis showed the 1-specifity and Y-axis showed the Sensity of each gene;M.Western blot showed the expression of SNAP25 in hippocampus of mice in each group;N.relative quantitative analysis of the total amount of SNAP25 in hippocampus of mice in each group;n=6-7; control.wild normal mice; DM.wild diabetes mice; DM+TREM2-/-.TREM2 CKO diabetes mice; *P<0.001 compared with each group.

2.4 Trem2敲除加重T1DM小鼠空間學習記憶障礙

與正常對照組相比,DM小鼠血糖和體質(zhì)量水平在STZ注射后第2周開始分別升高和降低。說明DM小鼠模型構(gòu)建成功(圖4A,B)。STZ注射后8周通過Morris水迷宮測試發(fā)現(xiàn)與正常對照組小鼠相比,DM小鼠在水中找到平臺的潛伏期明顯延長(圖4C),在平臺所在象限游動所占時間百分比明顯減少(圖4D),游泳路徑較為混亂(圖4E)。Trem2敲除DM小鼠在學習記憶階段潛伏期更長(圖4C),平臺所在象限所占時間百分比更少(圖4D),游泳路徑更加混亂(圖4E)。同時,為了排除小鼠游動速度和小鼠個體視力差異對實驗結(jié)果的影響,統(tǒng)計各組小鼠每天的游泳速度發(fā)現(xiàn)差異均無統(tǒng)計學意義(圖4G),另外在實驗的第9天,通過可視平臺測試各組小鼠的視力情況,發(fā)現(xiàn)各組間差異均無統(tǒng)計學意義(圖4F),說明DM小鼠出現(xiàn)的空間學習記憶功能障礙不會受到逃逸動機及感覺運動能力的影響。

A.changes of blood glucose in each group of mice at different periods; B.weight changes in each group; C.Morris water maze escape latency of mice in each group; D.the percentage of swimming time in each quadrant after the platform was removed on day 7 of the Morris water maze test; E.swimming tracks of mice in each group on day 7 of Morris water maze test; F.the escape latency of mice in each group was tested by visual platform on day 9 of the Morris water maze experiment; G.the average daily swimming speed of each group of mice in the Morris water maze experiment;CON+TREM2+/+.wild normal mice; CON+TREM2-/-.TREM2 CKO mice; DM+TREM2+/+.diabetes mice; DM+TREM2-/-.TREM2 CKO diabetes mice; n=6; *P<0.05, **P<0.001 compared with the normal control group.

2.5 DM小鼠海馬SNAP25表達增加,TREM2影響DM小鼠海馬SNAP25的表達

得到SNAP25為核心基因后,本研究利用DM WT和DMTrem2敲除小鼠,應(yīng)用Western blot,檢測了DM小鼠第8周時海馬區(qū)SNAP25表達的變化。結(jié)果表明,DM小鼠海馬區(qū)SNAP25表達明顯增加,特異性敲除小膠質(zhì)細胞Trem2的DM小鼠海馬區(qū)SNAP25表達顯著降低(圖3M,N)。

3 討論

TREM2在DM和認知功能障礙中兩個疾病之間的聯(lián)系和潛在的作用靶點尚不清楚。在本研究中所納入的兩個數(shù)據(jù)庫分別涵蓋了DM患者腦組織和TREM2R47H突變AD患者神經(jīng)元基因的表達變化。

在本研究獲取的4個核心基因中,結(jié)合本實驗后續(xù)的ROC曲線驗證和疾病相關(guān)生物過程關(guān)聯(lián)的結(jié)果,SNAP25相較于其它3個基因更具有較大的研究潛力,它是一種在神經(jīng)元中特異高表達的突觸前膜蛋白。SNAP25在遲發(fā)性AD患者的腦脊液中明顯升高。也有實驗發(fā)現(xiàn)SNAP25多態(tài)性在DM中發(fā)揮一定作用[5]。但有趣的是,有實驗發(fā)現(xiàn)AD患者大腦皮層、海馬等特定區(qū)域突觸喪失,SNAP25的表達顯著降低[6]。本實驗顯示在DM小鼠大腦海馬區(qū)域SNAP25蛋白表達水平與生物信息學分析結(jié)果相一致。Trem2敲除后表達降低提示TREM2可能上調(diào)SNAP25的表達,其具體的作用機制還需后續(xù)實驗進一步探索?？傊?結(jié)合以上研究,本研究結(jié)果提示TREM2有可能通過上述核心基因參與DM認知功能障礙。

綜上所述,本研究成功篩選出與DM合并TREM2突變相關(guān)認知功能障礙的4個核心基因,這為治療DM認知功能障礙提供了新的靶點。這項研究同時也存在了一些不足,目前尚未檢索到TREM2突變DM患者的數(shù)據(jù)庫,因此隨著數(shù)據(jù)庫的擴大,后續(xù)還需要進一步的實驗探索。