王 宇，高寅潔，任衛(wèi)東，童安莉*

1.河北北方學(xué)院 研究生院，河北 張家口075000；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 內(nèi)分泌科 國家衛(wèi)生健康委員會內(nèi)分泌重點(diǎn)實驗室，北京100730；3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河北 張家口 075000

原發(fā)性醛固酮增多癥(primary aldosteronism,PA)是由腎上腺皮質(zhì)球狀帶自主分泌醛固酮增多所致。醛固酮產(chǎn)生腺瘤(aldosterone producing adenoma,APA)是PA常見的病因,研究表明,APA中存在KCNJ5、ATP2B3、ATP1A1或CACNA1D等基因體系突變,這些突變通過引起離子通道或酶的異常,最終激活細(xì)胞內(nèi)鈣信號,導(dǎo)致醛固酮合成酶CYP11B2表達(dá)增加,醛固酮合成和分泌增多[1]。鈣通道阻滯劑(calcium channel blocker,CCB)作用于APA細(xì)胞膜上的鈣通道,阻斷細(xì)胞的鈣內(nèi)流,減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,從而減少醛固酮合成酶表達(dá)及醛固酮分泌。在腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞系NCI-H295R(以下簡稱H295R)細(xì)胞中也觀察到,CCB能減少醛固酮合成[2-3]。

Na+/Ca2+交換體(Na+/Ca2+exchanger,NCX)在維持細(xì)胞內(nèi)鈣的穩(wěn)態(tài)中起著重要作用,其位于細(xì)胞膜上,是一種雙向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì),即存在正向和反向兩種轉(zhuǎn)運(yùn)模式,正向模式為Na+轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)同時Ca2+轉(zhuǎn)出細(xì)胞外,反向模式為Ca2+轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)同時Na+轉(zhuǎn)出細(xì)胞外,轉(zhuǎn)運(yùn)方向取決于跨膜Na+、Ca2+的濃度梯度與膜電位的差值[4]。在腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中NCX的作用目前尚不清楚,為探討NCX對腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的醛固酮合成功能的調(diào)節(jié)作用,本研究擬觀察選擇性的NCX抑制劑SN-6對K+刺激的H295R細(xì)胞的醛固酮合成酶的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)鈣信號調(diào)節(jié)的影響,并探討NCX抑制劑SN-6和CCB維拉帕米(verapamil)這兩種鈣信號調(diào)節(jié)劑的共同作用產(chǎn)生的效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:人腎上腺皮質(zhì)腺癌細(xì)胞系NCI-H295R(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家生物醫(yī)學(xué)實驗細(xì)胞資源庫)。

1.1.2 試劑:Ultroser G 血清替代品(Pall公司);DMEM/F-12培養(yǎng)液(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家生物醫(yī)學(xué)實驗平臺);100×MEN非必需氨基酸添加劑(NEAA)(北京酷來搏科技有限公司);1 mol/L HEPES和1×PBS溶液(北京索萊寶科技有限公司);青鏈霉素(100×)(Cytiva公司);ITS液體培養(yǎng)補(bǔ)充劑(100×)(Sigma-Aldrich公司);SN-6和維拉帕米(MedChemExpree公司);TRIzol RNA提取試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(TaRaRa公司);FLIPR Calcium6檢測試劑盒(Molecular Device公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):H295R細(xì)胞置于含2% UltroserTMG的DMEM/F-12完全培養(yǎng)液中培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度接近90%時,用0.25%蛋白胰酶(含EDTA)消化后將其制成單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞以濃度為2×105個/mL接種于6孔板,每孔2 mL,置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組:將細(xì)胞分為對照組、K+(15 mmol/L)處理組、維拉帕米(10 μmol/L)處理組、SN-6(10 μmol/L)處理組、K++維拉帕米處理組、K++SN-6處理組、維拉帕米+SN-6處理組和K++維拉帕米+SN-6處理組,每組3孔,藥物處理24 h,收集細(xì)胞,于-80 ℃保存。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達(dá):依據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA,通過檢測A260/A280比值及RNA濃度,保證樣品RNA高純度,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄的標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,所獲取的cDNA作為PCR反應(yīng)模板,用實時熒光定量PCR儀擴(kuò)增目標(biāo)基因CYP11B2。CYP11B2上游引物:5′-GCTGTGA TTTTGTCCCTTGCCT-3′CYP11B2下游引物:5′-GACC CAACACTCGCTGCTT-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物:5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTC-3′;下游引物:5′-TGG GTGGAATCATATTGGAACAT-3′。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;共40個循環(huán);72 ℃終延伸 2 min。

1.2.4 FLIPR Calcium6檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平:細(xì)胞以濃度0.8×105個/μL接種于96孔板,每孔100 μL,置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理分組:對照組、K+(15 mmol/L)處理組、K++維拉帕米處理組、K++SN-6處理組、K++維拉帕米+SN-6處理組。制備上樣緩沖液:將試劑盒10 mL組分B溶液加入到組分A(QF-A液)瓶中,充分溶解組分的內(nèi)含物,并將AB混合溶液移至離心管中。組分C溶解在DMSO中,充分混合后離心,將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至AB混合液的離心管中。上樣:將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出,棄去培養(yǎng)液,加入組分B溶液(每孔100 μL),再加入上樣緩沖液(每孔100 μL)。將細(xì)胞板置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。用多功能酶標(biāo)儀測定細(xì)胞鈣離子熒光值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SN-6和維拉帕米單獨(dú)或聯(lián)合處理對K+刺激的H295R細(xì)胞CYP11B2 mRNA表達(dá)的影響

與對照組相比,K+能夠刺激CYP11B2 mRNA表達(dá)(P<0.001),與K+刺激組相比,K++SN-6組、K++維拉帕組、K++SN-6+維拉帕米組能夠抑制K+刺激的CYP11B2 mRNA表達(dá)(P<0.001);K++SN-6+維拉帕米組較K++SN-6組、K++維拉帕組抑制CYP11B2 mRNA表達(dá)更顯著(P<0.05)(圖1)。

SN-6:10 μmol/L;verapamil:10 μmol/L;K+:15 mmol/L;*P<0.001 compared with control group;△P<0.001 compared with K+ group;#P<0.05 compared with K+ +verapamil group.

2.2 SN-6和維拉帕米單獨(dú)或聯(lián)合處理對K+刺激的H295R細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的影響

K+刺激組的細(xì)胞內(nèi)鈣水平顯著高于對照組(P<0.001); 與K+刺激組相比,K++SN-6組、K++維拉帕組、K++SN-6+維拉帕米組能夠抑制K+刺激的細(xì)胞內(nèi)鈣水平增加(P<0.001)(圖2)。

SN-6:10 μmol/L;verapamil:10 μmol/L;K+:15 mmol/L;*P<0.01 compared with control group;#P<0.000 1 compared with K+ group.

3 討論

腎上腺皮質(zhì)球狀帶細(xì)胞中,鈣離子是調(diào)節(jié)醛固酮生成的關(guān)鍵第二信使。血漿鉀離子濃度增加時,細(xì)胞膜去極化,引起電壓門控鈣離子通道開放,進(jìn)而鈣內(nèi)流,鈣信號通路激活,增加醛固酮合成酶(CYP11B2)的表達(dá)并最終產(chǎn)生醛固酮[5]。

PA是血漿醛固酮水平過高的主要原因,典型的臨床表現(xiàn)為高血壓伴或不伴有低血鉀,是最常見的繼發(fā)性高血壓,占高血壓人群5%～13%。在PA患者的藥物治療中,除醛固酮受體拮抗劑外,CCBs也可有效降低血壓,其作用是抑制細(xì)胞鈣內(nèi)流,進(jìn)而松弛血管平滑肌張力[6]。本課題組和其他學(xué)者[7-8]對人腎上腺和PA中的電壓門控鈣通道的研究中,觀察了人腎上腺皮質(zhì)組織中L型、N型和T型電壓門控鈣離子通道的作用,結(jié)果顯示,不同類型的鈣通道均可能參與鈣相關(guān)的醛固酮生物合成。此外,CCB維拉帕米抑制KCNJ5突變型H295R細(xì)胞的CYP11B2 mRNA的表達(dá)[9]。

本課題組曾報道CCBs對原代培養(yǎng)APA類固醇激素譜的影響,結(jié)果顯示維拉帕米10 μmol/L處理可顯著抑制醛固酮的合成[10]。本研究以NCL-H295R細(xì)胞進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)維拉帕米抑制CYP11B2的表達(dá),同時減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。這與先前研究結(jié)果一致。

在大多數(shù)生理條件下,NCX可將1個Ca2+與3個Na+的交換,其中Ca2+流出(正向)或Ca2+內(nèi)流(反向)模式的方向性取決于離子濃度和特定細(xì)胞類型中的膜電位。通常,NCX的反向模式在病理環(huán)境中占主導(dǎo)地位,它可以顯著改變Ca2+穩(wěn)態(tài)[11-12]。NCX作用在心力衰竭、心律失常疾病中研究報道較多。但目前尚缺乏在PA中的研究報道。本研究發(fā)現(xiàn),SN-6能直接抑制NCI-H295R細(xì)胞基礎(chǔ)及K+刺激的CYP11B2 mRNA表達(dá),以及降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平,提示NCX在腎上腺細(xì)胞的作用以反向轉(zhuǎn)運(yùn)模式為主。

本研究還發(fā)現(xiàn)SN-6聯(lián)合維拉帕米對CYP11B2 mRNA的抑制作用較單獨(dú)使用SN-6或維拉帕米藥物抑制作用更加顯著,提示兩者在減少醛固酮合成酶的表達(dá)上有協(xié)同或疊加作用。

研究局限性:首先,本研究為細(xì)胞學(xué)實驗,缺乏在體內(nèi)研究對結(jié)果的驗證;其次,醛固酮分泌調(diào)控的機(jī)制復(fù)雜,鈣信號與其他信號通路之間存在相互作用,這些都需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述,SN-6能抑制K+刺激的醛固酮合成酶的表達(dá),并且和CCBs聯(lián)合較單獨(dú)使用這種抑制作用更強(qiáng),這種多種鈣信號調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合使用為探索臨床上治療PA的新手段奠定理論基礎(chǔ)。