趙羚延，何 瀏，馬艷妮，余 佳

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一種血液細胞惡性克隆性疾病,具有髓系細胞異常增殖且分化受阻的特點,導(dǎo)致患者造血功能異常,功能性血液細胞數(shù)量減少,進而危及患者生命,全球每年因為急性髓系白血病死亡的人數(shù)超過8萬[1]。MLL1基因的染色體易位會導(dǎo)致不同的白血病亞型,其中MLL重組型急性髓系白血病和淋系白血病,約占白血病的5-10%[2-3]。MLL易位產(chǎn)生的嵌合基因編碼致癌的 MLL 融合蛋白,最常見的易位伙伴之一是染色體9p22上的 AF9[4]。多重剪接功能的RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein with multiple splicing,RBPMS)基因是位于人類第8號染色體p12位的一個基因,大小超過230 kb,具有一個RNA 識別位點(RNA recognition motif,RRM),可以與新生mRNA結(jié)合并調(diào)節(jié)其加工[5],也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子以調(diào)節(jié)基因表達,有研究發(fā)現(xiàn)RBPMS與Smad2、Smad3和Smad4相互作用,促進Smad介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性信號通路,而該信號通路與體外和體內(nèi)的細胞生長、增殖和細胞存活有關(guān)[6-7],過表達RBPMS會抑制乳腺癌以及卵巢癌細胞的生長和、遷移和侵襲[6-8],此外有研究通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示AML細胞層級關(guān)系的工作中,RBPMS作為定義疾病來源的造血干細胞樣細胞的標志性基因被使用[9],但是RBPMS在AML細胞中發(fā)揮什么作用仍是未知。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人急性單核細胞白血病細胞系THP-1(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心)。

1.1.2 主要試劑:RPMI-1640(改良)、胎牛血清FBS(Gibco公司);雙抗(Biological Industries公司);β-巰基乙醇、Lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher Scientific 公司);TRIzol RNA提取試劑(Invitrogen公司);BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(Solarbio公司);BioSciTMNewFlashTmProtein AnyKDPAGE蛋白電泳凝膠試劑盒(北京達科為生物技術(shù)有限公司);SYBR Green(北京蘭博利德商貿(mào)有限公司); RBPMS抗體(Abcam公司);RBPMS OE質(zhì)粒(云舟生物科技有限公司合成);Cell Counting Kit-8試劑(CCK-8,北京蘭博利德商貿(mào)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 公共數(shù)據(jù)分析:使用GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles)分析RBPMS基因在正常造血干祖細胞及急性髓系白血病干細胞中的表達水平。

1.2.2 RBPMS過表達細胞株構(gòu)建:THP-1在1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細胞密度1×106個/mL時,室溫900 r/min 離心5 min,棄上清后用等體積培養(yǎng)基重懸細胞,轉(zhuǎn)移至新的24孔板(1 mL/孔),將細胞分為對照組(vehicle control,PLV)及過表達組(over-expressed,OE)兩組,分別加入對應(yīng)的慢病毒溶液(100 mL/孔),培養(yǎng)14 h后相同條件離心換新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),48 h后加入0.5 mg/mL的嘌呤霉素(puromycin,puro)進行篩選,篩選24 h后離心去掉含puro的培養(yǎng)基,加入新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d,用以后續(xù)實驗。

1.2.3 RT-qPCR檢測基因表達水平:取5×105個上述病毒感染后的THP-1細胞,離心棄上清,加入500 μL TRIzol RNA提取試劑,混勻后加入250 μL三氯甲烷快速顛倒混勻,4 ℃,11 304 r/min 離心15 min,吸取上層無色透明液體到新的離心管,加入250 μL異丙醇顛倒混勻,室溫靜置10 min后相同條件離心10 min,可以看到離心管底部有RNA白色沉淀,棄上清后加入1 mL 75% 乙醇,4 ℃ 11 304 r/min 離心5 min,吸棄乙醇,開蓋晾干管壁液體,用20 μL無酶水溶解RNA白色沉淀,使用Nano Drop檢測RNA溶液濃度,計算并吸取1μg RNA,通過兩步法反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。全程使用無酶材料和試劑。

取0.4 μL cDNA作為模板,配置10 μL RT-qPCR反應(yīng)體系,使用羅氏LC480進行PCR擴增,每個樣本3個復(fù)孔,得到每個樣本每個基因的閾值循環(huán)數(shù)(Ct值),以β-actin為內(nèi)參,按照log 2-△△Ct法計算得到RBPMS的相對表達量(relative quantification,RQ)。

1.2.4 Western blot檢測蛋白質(zhì)表達水平:取2×106個病毒感染后的THP-1細胞,用大約5倍細胞沉淀體積的細胞裂解液(加入蛋白酶抑制劑)在冰上裂解30 min,4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min,吸取上清至新的離心管,使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度,用5×SDS-PAGE loading將蛋白質(zhì)溶液稀釋至3 μg/μL。吸取10 μL蛋白質(zhì)溶液上樣到SDS-PAGE膠中,300 V恒壓電泳跑至溴酚藍到達膠底部,之后260 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別4 ℃過夜孵育β-actin及RBPMS一抗,室溫孵育二抗1 h后顯影。

1.2.5 細胞增殖檢測:將THP-1細胞稀釋成濃度為5×104個/mL,吸取100 μL到96孔板,每個樣本做6個復(fù)孔。按照10∶1的體積,每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)2.5 h后,用酶標儀測定450 nm處的吸光度值,連續(xù)監(jiān)測4 d(D0、D1、D2、D3)。

1.2.6 細胞遷移檢測:THP-1細胞離心后,用不含血清的培養(yǎng)基重懸,稀釋成濃度為2×106個/mL,吸取100 μL到直徑8 μm的Transwell板上室,下室加入600 μL含10%血清的完全培養(yǎng)基,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)24 h后,取出上室,吸取下室所有液體,用流式細胞儀檢測遷移進下室的細胞數(shù)量,使用公式(下室細胞數(shù)/初始總細胞數(shù))×100% 計算得到細胞遷移率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RBPMS在造血干細胞中高表達,在白血病干細胞中低表達

為了明確RBPMS在造血細胞分化以及AML中的可能作用,首先檢索下載了兩組公共數(shù)據(jù),共117個樣本的基因表達數(shù)據(jù),然后分析比較了RBPMS在正常造血干祖細胞中的表達,發(fā)現(xiàn)RBPMS在造血干細胞中高表達,并隨著向下游祖細胞分化表達量逐步降低(圖1A),提示RBPMS對于造血干細胞的干性維持具有重要作用。接著分析了RBPMS在白血病干細胞中的表達,發(fā)現(xiàn)與正常造血干細胞相比,RBPMS在急性髓系白血病干細胞中表達顯著降低(圖1B),其中在MLL融合基因型急性髓系白血病干細胞中表達最低(圖1C),提示RBPMS的異常低表達可能與急性髓系白血病的產(chǎn)生存在某種聯(lián)系。

A.RBPMS expression in normal hematopoietic stem progenitor cells(GSE63270);B.RBPMS expression in normal HSC and LSC(GSE17054);C.RBPMS expression in normal HSC,LSC and MLL-LSC(GSE63270); HSC.hematopoietic stem cell;MPP.multipotent progenitor;CLP.common lymphoid progenitor;CMP.common myeloid progenitor;GMP.granulocyte-monocyte progenitor;MEP.megakaryocytic-erythroid progenitor;LSC.leukemia stem cell;*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.0001 compared with HSC group;#P<0.0001 compared with MPP group;▽P<0.0001 compared with CMP group;△P<0.0001 compared with LSC group.

2.2 過表達RBPMS抑制THP-1細胞增殖和遷移能力

為了探究RBPMS的低表達水平在MLL融合基因型急性髓系白血病細胞中的作用,本實驗使用攜帶RBPMS過表達閱讀框的慢病毒感染THP-1細胞,感染4 d后,通過RT-qPCR和Western blot檢測RBPMS的過表達效率(圖2A),確定RBPMS過表達成功后檢測其細胞增殖和遷移能力是否受到影響。檢測結(jié)果表明過表達RBPMS后THP-1細胞出現(xiàn)凋亡(P<0.000 1),增殖能力大幅下降(P<0.05)(圖2B),同時遷移能力也顯著減弱,24 h時內(nèi)的遷移率相比對照組減少約20%(圖2C)。

A.the mRNA (left) and protein (right) level of RBPMS in vehicle control (PLV) and RBPMS over-expressed (OE) THP-1 cell;**P<0.0001 compared with PLV1 group;#P<0.000 1 compared with PLV2 group;B.A450 represents cell proliferation;C.percentage migration of PLV and OE THP-1 cells;*P<0.05,**P<0.0001 compared with PLV group.

2.3 過表達RBPMS影響白血病細胞增殖及凋亡相關(guān)基因表達

為了進一步挖掘RBPMS調(diào)控白血病細胞增殖及遷移能力的機制,對THP-1細胞進行了轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示,空載對照組(PLV)和RBPMS過表達組(OE)的樣本相關(guān)性高(圖3),證明重復(fù)性較好,可以用于后續(xù)比較分析。與對照組相比,OE組有128個基因表達水平發(fā)生變化,其中有78個基因表達上調(diào),50個基因表達下調(diào)(圖4)。通過更深入的分析這些差異基因發(fā)現(xiàn),一些與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)的基因被下調(diào),比如轉(zhuǎn)錄因子HNF1B;同時具有促進腫瘤細胞增殖和遷移功能的基因也被下調(diào),比如趨化因子受體XCR1;除此之外還發(fā)現(xiàn)一些促進細胞凋亡有抑癌作用的基因表達上調(diào),比如腫瘤壞死因子LTA(圖5),這些結(jié)果提示:RBPMS可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)各類因子的表達進而抑制了白血病細胞的增殖和遷移能力。

A.correlation of vehicle control (PLV);B.correlation of RBPMS over-expressed (OE);FKPM+1,fragments per kilobase of gene per million mapped fragments+1.

A.volcano of differentially expressed genes;B.heatmap of down rugulated genes compared with vehicle control (PLV) cells; C.heatmap of up rugulated genes compared with vehicle control (PLV) cells.

圖5 對照組(PLV)和過表達組(OE)細胞間差異表達基因的功能分類

3 討論

急性髓系白血病存在多種亞型,并且不同亞型之間發(fā)病機制大相徑庭,隨著干細胞生物學(xué)和基因組分析技術(shù)的發(fā)展,AML患者基因改變與其疾病發(fā)生間的機制關(guān)系逐漸被揭示,目前普遍認為AML起源于白血病干細胞,而白血病干細胞是由正常造血干祖細胞轉(zhuǎn)變的,這種轉(zhuǎn)變通常由基因突變引起,其中融合基因是最常見的致病突變,占所有AML病因的19%[10]。

MLL,又稱KMTA2,是一種原癌基因,1979年首次發(fā)現(xiàn)其在AML中存在染色體易位,后續(xù)出現(xiàn)大量研究報道MLL在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的染色體異常。MLL有40多種不同的融合伴侶蛋白質(zhì),由這些融合蛋白質(zhì)導(dǎo)致的白血病患者化療緩解率低,預(yù)后較差[11],其中AF9是MLL最常見的融合伴侶之一[12]。RBPMS作為一種RNA結(jié)合蛋白,具有復(fù)雜的功能,目前多項研究發(fā)現(xiàn)RBPMS在不同組織和環(huán)境中發(fā)揮的作用各不相同,與神經(jīng)發(fā)育、心臟發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展等重要生命活動有關(guān)[6-9],并且在造血干細胞中維持高表達,而在急性髓系白血病干細胞中表達顯著下降,因此探究其在急性髓系白血病中的作用更值得關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)在MLL-AF9融合基因型急性髓系白血病細胞系THP-1中過表達RBPMS,會顯著抑制其細胞增殖和細胞遷移,轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果也發(fā)現(xiàn)RBPMS的過表達會導(dǎo)致與細胞增殖遷移相關(guān)的基因表達下調(diào)。

綜上所述, 本研究通過檢索分析GEO數(shù)據(jù)庫中公共數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)RBPMS在正常造血干細胞中維持高表達,但是在急性髓系白血病干細胞中表達下調(diào),尤其是在MLL融合基因型急性髓系白血病干細胞中下調(diào)最強。在攜帶MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病細胞系THP-1中過表達RBPMS后顯著抑制了其細胞增殖能力和遷移能力,通過分析轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),RBPMS可能通過上調(diào)腫瘤壞死因子LTA的表達,來抑制THP-1細胞的增殖。同時RBPMS的過表達會下調(diào)趨化因子受體XCR1,有研究報道發(fā)現(xiàn)XCR1可以促進口腔癌[13]、卵巢癌[14]和肺癌[15]的細胞增殖和遷移,證明RBPMS的低表達對AML細胞的極速擴增具有重要意義,甚至可能有助于白血病的髓外轉(zhuǎn)移,有望成為治療MLL融合基因型急性髓系白血病的新靶點。