張迪雅，李云帆，郭泓江，仇佳星，王鈺鋮，鞠 瑞，郭 磊

中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 藥理系，北京 100005

膠質母細胞瘤(glioblastoma, GBM)是成人中最常見的惡性膠質瘤(glioma)形式,其腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)具有高度異質性并且處于一種免疫抑制的狀態(tài),導致目前免疫治療的效果不佳[1-2]。值得注意的是,在膠質瘤TME中,單核細胞來源的膠質瘤相關巨噬細胞(glioma associated macrophages, GAMs)占腫瘤質量的三分之一以上,其浸潤比例與膠質瘤的惡性進展呈正相關[3-4]。

巨噬細胞的可塑性使其能在不同的刺激下極化成不同的表型,通常被簡化為促炎的M1表型與抗炎的M2表型。然而越來越多的證據(jù)表明,在TME中并不存在M1/M2巨噬細胞表型的明顯劃分,GAMs能夠同時表達M1與M2相關促癌介質如IL-1β、IL-6、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、精氨酸酶(arginase 1, ARG1),塑造了免疫抑制的微環(huán)境[5-8]。有研究發(fā)現(xiàn),巨噬細胞在TME刺激下,葡萄糖攝取與糖酵解代謝速率增加,但是糖酵解是否以及如何影響GAMs進而調控腫瘤免疫抑制微環(huán)境尚不清楚[9-10]。因此,本研究旨在探索膠質瘤條件培養(yǎng)基對巨噬細胞表型與糖酵解代謝的影響,并利用乳酸脫氫酶抑制劑stiripentol(STP)初步驗證糖酵解對GAMs促癌表型的支持作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:小鼠結締組織細胞系L929(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心);小鼠膠質瘤細胞系GL261(上海賽百慷生物技術股份有限公司)。

1.1.2 動物:C57BL/6J小鼠[6周齡,SPF級,雄性,體質量(18±20)g,中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所動物中心]。

1.1.3 試劑:Stiripentol(STP)(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)(Sigma-Aldrich公司);紅細胞裂解液、RIPA裂解液、PMSF(北京索萊寶生物科技有限公司);引物(北京擎科生物科技股份有限公司);SYBR Green Pro Taq HS 預混型 qPCR 試劑盒、AG RNAex Pro RNA 提取試劑、Evo M-MLV 反轉錄試劑預混液(湖南艾科瑞生物工程有限公司);Seahorse XF 糖酵解壓力測試試劑盒(Agilent公司);STAT3抗體、羊抗兔IgG二抗、羊抗鼠IgG二抗(Proteintech公司);β-actin抗體、p-STAT3抗體、STAT6抗體、p-STAT6抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理:L929細胞與GL261細胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素和1% L-谷氨酰胺的DMEM高糖完全培養(yǎng)基,在37 ℃、含5% CO2的常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。GL261細胞條件培養(yǎng)基(GL261 cell conditioned medium, GCM)上清收集:將2×106個GL261細胞接種于10 cm大皿,在常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,更換含3% 胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基,在低氧(5% O2)培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細胞培養(yǎng)基上清。小鼠骨髓來源巨噬細胞(bone marrow derived macrophage, BMDM)分離與誘導:小鼠脫頸處死后,分離脛骨與股骨,收集骨髓內BMDM細胞,使用含10% L929細胞培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基誘導分化BMDM細胞6 d(培養(yǎng)3 d后換液1次)為成熟巨噬細胞。將成熟的BMDM細胞分為對照(BMDM)組(No GCM)、腫瘤誘導(GCM-BMDM)組(GCM)與500 μmol/L STP誘導給藥組(GCM STP)。No GCM組更換為含5%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基,GCM組與GCM STP組更換為含50% GL261上清的腫瘤條件培養(yǎng)基,在常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換為含藥或溶劑對照(DMSO)的條件培養(yǎng)基,在低氧(5% O2)培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測促癌介質與糖酵解代謝相關基因的mRNA表達水平:收集低氧與藥物處理后的細胞,按照AG RNAex Pro RNA 提取試劑說明書提取細胞RNA,NanoDrop One超微量紫外分光光度計測定濃度和純度,按照Evo M-MLV 反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應合成cDNA,按照SYBR Green Pro Taq HS 預混型 qPCR 試劑盒說明書配置反應液進行qPCR檢測。以β-actin為內參基因計算目的基因mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.2.3 Seahorse細胞能量實驗檢測細胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR):取誘導分化后的BMDM細胞,No GCM組按2.5×105個/孔,GCM與GCM STP組按1.5×105個/孔接種于24孔板,過夜貼壁后,更換為腫瘤條件培養(yǎng)基,在常氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后更換含藥腫瘤條件培養(yǎng)基,在低氧(5% O2)培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h,按照Seahorse XF 糖酵解壓力測試試劑盒說明書進行操作,使用Seahorse XF分析儀檢測。

1.2.4 Western blot檢測STAT3、p-STAT3、STAT6、p-STAT6蛋白表達水平:收集低氧與藥物處理后的細胞,冰上裂解,離心,取蛋白質上清,進行BCA蛋白質濃度測定,按比例加入5×蛋白質上樣緩沖液,98℃煮樣10 min使蛋白質變性,-80 ℃保存。計算每組30 μg蛋白質所需上樣體積,進行SDS-PAGE,冰上轉膜2 h,PVDF膜經5%脫脂奶粉-TBST溶液封閉2～3 h,一抗4 ℃孵育過夜,二抗孵育1～2 h,顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 GCM刺激BMDM Hif-1α與多種促癌介質mRNA表達

與對照組相比,BMDM細胞經過GCM誘導后Hif-1α,M1介質Il-1β、Il-6、iNOS,M2介質Ido、Il-10、Arg1、Cd163、Cd274mRNA表達均升高(P<0.01,P<0.001)(圖1)。

*P<0.01, **P<0.001 compared with No GCM group.

A.Bar chart of mRNA level of glycolysis associated genes; B.Seahorse glycolysis stress test with sequential addition of glucose, oligomycin, and 2-DG in BMDM; C.quantification of ECAR in various groups after the addition of glucose; 2-DG.2-deoxy-D-glucose;*P<0.01, **P<0.001 compared with No GCM group; #P<0.05 compared with GCM group.

2.2 GCM上調BMDM糖酵解水平

與對照組相比,GCM組BMDM細胞葡萄糖攝取基因Slc2a1與糖酵解代謝關鍵酶基因Hk2、Pkm與LdhamRNA表達升高。在Seahorse糖酵解壓力測試實驗中,與對照組相比,GCM組ECAR水平升高,GCM STP組BMDM細胞經GCM與STP處理后, ECAR水平降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(圖2)。

2.3 STP下調GCM-BMDM促癌介質mRNA表達

與GCM組相比,GCM STP組Hif-1α與促癌介質Il-1β、Il-6、Ido、Cd163mRNA水平均降低(P<0.01,P<0.001)(圖3)。

*P<0.01, **P<0.001 compared with No GCM group; #P<0.01, ##P<0.001 compared with GCM group.

2.4 STP抑制GCM-BMDM炎性轉錄因子活化

與對照組相比,GCM組炎性轉錄因子STAT3與STAT6磷酸化水平增加,p-STAT3/STAT3與p-STAT6/STAT6的比值升高。加入STP處理后,GCM-BMDM中p-STAT3/STAT3與p-STAT6/STAT6的比值降低(P<0.05,P<0.001)(圖4)。

*P<0.05, **P<0.001 compared with No GCM group; #P<0.05 compared with GCM group.

3 討論

長期以來,腫瘤細胞一直被認為是TME中葡萄糖的主要消耗者,通過有氧糖酵解為自身增殖和轉移提供能量[11]。然而最近的研究發(fā)現(xiàn),骨髓來源的腫瘤相關巨噬細胞是TME中葡萄糖攝取最多的免疫細胞亞群,糖代謝需求的增加可能與其免疫抑制的促癌表型相關[12]。單核來源的巨噬細胞被招募到腫瘤組織后,在TME的刺激下發(fā)生特定代謝與功能的改變。例如,組織內缺氧與腫瘤細胞產生的乳酸蓄積都將穩(wěn)定缺氧誘導因子HIF-1α的表達,而HIF-1α作為一種重要的轉錄因子,能調控多種糖酵解途徑關鍵酶與若干促癌介質的表達[13-15]。此外,JAK/STAT通路是調控巨噬細胞M2表型的重要調控通路。IL-4與IL-13通過受體IL-4Rα激活STAT6,IL-10通過其受體IL-10R激活STAT3,誘導M2表型的經典活化[16]。有研究報道IL-4還通過不同的表觀遺傳修飾誘導出具有促炎特性的M2巨噬細胞(M2IFN),糖酵解與HIF-1α是這種非經典M2巨噬細胞活化的決定因素[14]?；谝陨媳尘?本研究推測在低氧TME中,GAMs可能更依賴糖酵解,這一代謝偏好可能與其促癌介質表達相關。

在本研究中,經過缺氧與GL261腫瘤上清誘導后,GCM-BMDM中M1與M2促癌介質在轉錄水平表達上調,M2活化轉錄因子p-STAT3與p-STAT6表達增加。同時,GCM-BMDMHif-1α與其下游葡萄糖轉運體基因Slc2a1,糖酵解關鍵酶基因Hk2、Pkm、Ldha表達增加,糖酵解水平升高。

STP是一種FDA批準用于治療Dravet綜合征的抗癲癇藥物, 能有效抑制乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)的活性,生物安全性高且能透過血腦屏障。最近有研究表明STP能夠抑制GBM細胞增殖與侵襲,提高荷瘤小鼠的生存率,是治療GBM的潛在藥物[17]。本研究初步檢測了STP調控GAMs的作用,GCM-BMDM經STP處理后,Hif-1α表達下降,糖酵解水平降低,STAT3與STAT6的活化受到抑制,最終導致了促癌介質Il-1β、Il-6、Ido、Cd163表達下調。但是糖酵解抑制未能干預iNOS、Il-10、Arg1、Cd274的表達(數(shù)據(jù)未顯示),表明其他代謝通路或轉錄機制更多地參與了這些促癌介質的調控,對這一部分將繼續(xù)深入探索。

綜上所述,本研究在體外模型中證實了GAMs在轉錄水平多種促癌介質表達升高并偏向糖酵解代謝,乳酸脫氫酶抑制劑能有效降低糖酵解水平與促癌介質相關基因Il-1β、Il-6、Ido、Cd163的表達,糖酵解對促癌表型的支持作用可能是由轉錄因子HIF-1α、STAT3與STAT6介導的。