成 娟,陳 宏,劉德華,馮 爽

(1.天津市人民醫(yī)院皮膚科,天津 300121;2.晉城市人民醫(yī)院皮膚科)

面部激素依賴性皮炎(FCDD)是由于長期在面部不當使用外用糖皮質(zhì)激素而引起的慢性炎性反應疾病,具體發(fā)病機制目前尚未明確,但近期研究發(fā)現(xiàn)T輔助細胞(Th)亞群分化失衡所引起的皮膚免疫功能異常與FCDD發(fā)病關系密切,而細胞因子信號傳導抑制因子1(SOCS1)與趨化素樣因子1(CKLF1)在Th細胞免疫平衡中扮演了重要的角色。為了進一步探索SOCS1與CKLF1的作用和臨床意義,本文研究了SOCS1與CKLF1 mRNA在FCDD患者PBMC中的表達,并觀察祛風清熱涼血方治療熱毒熾盛證FCDD患者的療效及對兩種細胞因子表達變化的影響,進而為祛風清熱涼血方治療FCDD機制的闡明提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2015年3～12月天津市人民醫(yī)院確診為FCDD且中醫(yī)辨證為熱毒熾盛證患者50例為FCDD組,其中男8例,女42例,年齡18～62歲,平均(36.14 ±11.02)歲,對照組為同期正常體檢的40例正常人,其中男13例,女27例,年齡18～64歲,平均(41.15±14.47)歲。兩組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。FCDD組口服祛風清熱涼血方顆粒劑(方劑主要藥物:生地黃、生石膏、水牛角、玄參、白鮮皮、知母、荊芥、防風、牛蒡子、金銀花、連翹、白茅根、黃芩、黃柏、苦參、升麻、白芍、甘草,廣東一方制藥廠生產(chǎn)),每日1劑,沖服。口服藥物同時給予0.9 %生理鹽水冷敷面部,外用玉澤精華乳,2次/d,檢測患者首診及治療2 w(隨訪到33例患者)、4 w(隨訪到19例患者)時PBMC SOCS1 mRNA、CKLF1 mRNA 的表達情況。診斷標準:根據(jù)2009年中國醫(yī)師協(xié)會皮膚科分會美容專業(yè)組提出的《激素依賴性皮炎診治指南》與第四版《中國臨床皮膚病學》及文獻[1]制定,納入標準為熱毒熾盛證FCDD患者。排除標準:1個月內(nèi)系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素、抗生素、免疫抑制劑、抗組胺藥治療;合并(真菌、細菌、病毒)感染者;肝腎功能損害或其他系統(tǒng)疾病者;患有過敏性疾病、銀屑病等影響試驗結(jié)果的疾病;妊娠及哺乳期婦女;對方中草藥成分過敏者;未能按時隨診,不能按時服藥或不能耐受藥物不良反應的患者。評分依據(jù)近年FCDD相關文獻[2-3],采用4級評分法對患者的主觀、客觀指標進行評分。療效評價標準:根據(jù)尼莫地平法計算公式計算療效指數(shù),痊愈:皮損幾乎完全消退,自覺癥狀消失,療效指數(shù)>90%;顯效:皮損明顯消退,自覺癥狀有明顯的減輕,60%<療效指數(shù)≤90%;有效:部分皮損消退,自覺癥狀有所減輕,20% <療效指數(shù)≤60%;無效:極少部分皮損消退,自覺癥狀變化不明顯甚至加重,療效指數(shù)≤20%?？傆行?(痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意并與患者簽署了知情同意書。

1.2儀器與試劑:RNAisoplus、RT-PCR試劑盒、引物(內(nèi)參GAPDH、SOCS1、CKLF1,且引物終濃度均為10 μmol/L)(大連寶生物工程有限公司);焦炭酸二乙酯(DEPC)(大連寶生物工程有限公司);實驗室超純水系統(tǒng)ELGAPURELAB Ultra(英國 ELGA Lab Water公司);小型高速冷凍離心機5415D、臺式高速大容量離心機5804R、核酸蛋白測定儀(德國eppendorf公司);實C-1000型熒光定量 PCR 儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法:本試驗所有樣本均抽取2 ml外周靜脈血,EDTA抗凝,-80℃低溫凍存。參照試劑盒操作說明提取單個樣本總RNA,總RNA濃度和純度的測定,總RNA完整性的檢測,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,SYBR Green I 實時熒光定量 PCR,PCR 產(chǎn)物電泳。基因的相對定量用ΔCT表示(Ct值表示每個PCR反應管內(nèi)熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),ΔCT=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值,mRNA表達量與ΔCt值呈反比關系)。

1.4統(tǒng)計學分析:使用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行t及χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1SOCS1、CKLF1 擴增產(chǎn)物的鑒定:在PCR的擴增曲線中每條反應管的擴增曲線拐點清楚,標準的基線平直或略微下降,無明顯的上揚趨勢,平行性好,表明其擴增效率相近,試驗重復性好。

2.2FCDD組與對照組外周血SOCS1、CKLF1的表達:FCDD患者 SOCS1、CKLF1 mRNA的ΔCT 值均小于對照組,二者差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05),ΔCT 值與 mRNA表達量呈反比關系,因此FCDD組外周血中SOCS1、CKLF1 mRNA的表達量明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);患者SOCS1、CKLF1 mRNA的表達經(jīng)祛風清熱涼血方治療2 w時較治療前、治療4 w時較治療2 w時明顯降低,且差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 FCDD患者與正常對照組及祛風清熱涼血方治療2 w、4 w時SOCS1、CKLF1相對表達量的比較

2.3祛風清熱涼血方治療對SOCS1、CKLF1 mRNA表達的影響:2 w時與治療前、治療4 w時與治療2 w比較,SOCS1、CKLF1 mRNA均顯著下降,且差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05),見表1。

2.4祛風清熱涼血方治療FCDD患者4 w時和2 w時療效比較:祛風清熱涼血方對FCDD有較好的治療作用,并且遠期療效更佳。見表2。

表2 祛風清熱涼血方治療FCDD患者4 w時和2 w時療效比較[n(%)]

3 討論

近年來Th細胞比例失衡在激素依賴性皮炎發(fā)生中的作用引起了眾多學者關注,而研究人員大多認為FCDD屬變態(tài)反應類疾病,Th細胞分化失衡可能是FCDD發(fā)病基礎[4]。SOCS1通過作用于JAK/STAT信號途徑在抑制Thl細胞增殖的同時促進Th2細胞分化[5],在Th1/Th2分化失衡所引發(fā)的各種變態(tài)反應性疾病中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)SOCS1表達的增高是調(diào)節(jié)Th1和Th2相互平衡的重要機制,體外實驗證實SOCS1在Th1細胞表達是在Th2細胞的5倍[6],這提示SOCS1可能參與了Th1/Th2分化的調(diào)節(jié)并且與免疫紊亂導致的疾病有關。有研究顯示,IL-6 可以通過活化STAT3上調(diào)CD4+T細胞SOCS1的表達,高表達的SOCS1對IFN-γ的分泌抑制,說明SOCS1主要是抑制IFN-γ介導的信號途徑,從而對 Th1 細胞分化起到抑制,引起以Th2占優(yōu)勢的Th1/Th2免疫失衡[7]。研究發(fā)現(xiàn)SOCS1可以通過抑制IFN-γ而促進Th17細胞的分化[8]。綜上SOCS1可能是通過抑制IFN-γ/STAT1信號通路調(diào)節(jié)Th17細胞增殖,同時對Th1細胞分化起到抑制,引起以Th2占優(yōu)勢的免疫失衡。本研究發(fā)現(xiàn)SOCS1在FCDD患者外周血中表達水平增高,表明SOCS1可能參與了FCDD的發(fā)病過程,而目前并無對SOCS1在FCDD患者中的報道。

CKLF1是趨化因子家族的一員,對淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞等有廣譜趨化活性,并促進炎性反應效應,參與免疫介導的炎性反應性疾病病理過程[9]。研究發(fā)現(xiàn)CCR4與其配體CKLF1的結(jié)合趨使Th2細胞從血液移至皮膚組織使Th1/Th2細胞亞群失衡[10],而IL-4水平表達升高時SOCS1又可以通過干擾IFN-γ信號誘導的STAT1磷酸化過程,抑制Th1細胞分化[11],從而達到協(xié)同作用,與本研究得出的SOCS1與CKLF1 mRNA的表達量呈正相關一致,但差異無統(tǒng)計學意義,可能與樣本含量有關。也有學者發(fā)現(xiàn)過敏性鼻炎患者鼻黏膜CKLF1與CCR4表達量較正常人明顯增高,CKLF1的表達與Th2細胞呈顯著正相關,同時CKLF1表達與鼻腔分泌物涂片及下鼻甲黏膜刮片嗜酸性粒細胞計數(shù)也呈顯著正相關性,說明CKLF1可能在變應性鼻炎嗜酸性粒細胞與Th2細胞的活化及浸潤中起到了重要作用,使過敏性鼻炎患者鼻黏膜局部CD4+T淋巴細胞主要向Th2分化,出現(xiàn)以Th2細胞表達升高而導致的Th2與Th1比例失調(diào)[12]。本研究顯示,推測CKLF1可能通過與Th2細胞表面的CCR4受體結(jié)合,使Th2細胞過度趨集活化導致Th1/Th2失調(diào),同時CKLF1可能通過嗜酸性粒細胞表面的CCR4或其他受體,參與其嗜酸性粒細胞活化從而影響FCDD的發(fā)病,而目前并無對CKLF1在FCDD患者中的報道。

祛風清熱涼血方主要作用于熱毒熾盛證的FCDD患者,中醫(yī)認為激素類藥物藥性多屬辛溫、燥熱之品,長期外用可導致藥物毒邪侵犯肌膚,久之郁而化熱,使顏面部血熱瘀毒,故面部出現(xiàn)紅斑、毛細血管擴張、灼熱、瘙癢、皮膚變薄等。本研究結(jié)果表明推測祛風清熱涼血方可能通過抑制SOCS1,CKLF1的表達,影響Th17、Th2的分化進而調(diào)控體內(nèi)Th1/Th2/Th17細胞亞群功能的平衡狀態(tài),在FCDD中起到免疫調(diào)節(jié)作用。Th17細胞主要分泌的促炎因子IL-17可以促進嗜酸性粒細胞浸潤,同時對Th2免疫應答具有正調(diào)節(jié)作用,祛風清熱涼血方可能通過下調(diào)SOCS1的高表達提高Th1細胞的表達,減少Th17細胞分泌 IL-17,在一定程度上減弱對Th2細胞的正調(diào)控作用,從而糾正Th細胞亞群失衡,另一方面祛風清熱涼血方可能抑制了CCR4與其配體CKLF1結(jié)合的相互作用而產(chǎn)生抗炎效應,調(diào)節(jié)Th2細胞的過度趨集活化恢復Th1/Th2平衡,減輕了FCDD的炎性反應,發(fā)揮免疫抑制作用。通過對各單味藥的現(xiàn)代藥理研究,本方的作用可能為抗炎、抑制過敏、調(diào)節(jié)免疫反應,但中醫(yī)學強調(diào)整體觀念研究問題,祛風清熱涼血方療效確切,但其治療作用并非是通過對各單味藥物的藥理作用疊加而成,其具體作用機制還未明了,有待進一步研究[13-15]。