文｜李群杰（山東省壽光市羊口鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站）

輪狀病毒（PORV）是導(dǎo)致仔豬腹瀉的重要病原體之一。它能夠引起多種小動(dòng)物和新生嬰兒腹瀉，主要通過(guò)糞便和口腔傳播。臨床上常表現(xiàn)為腹瀉、食欲不振甚至消瘦和嗜睡等癥狀。隨著規(guī)?；i場(chǎng)的興起，世界上許多國(guó)家和地區(qū)都發(fā)現(xiàn)了輪狀病毒導(dǎo)致的相關(guān)腹瀉疾病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，采用快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)該疫病進(jìn)行防控和治療至關(guān)重要。筆者對(duì)豬源輪狀病毒檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，總結(jié)了已有的豬源輪狀病毒檢測(cè)方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)等，以期為臨床上輪狀病毒的防治提供重要指導(dǎo)。

一、病原學(xué)

豬輪狀病毒（Porcine Rotavirus，RV）屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，其基因編碼了一種結(jié)構(gòu)蛋白和5種非結(jié)構(gòu)蛋白。全球范圍內(nèi)，豬輪狀病毒廣泛流行，且沒(méi)有明顯的季節(jié)性規(guī)律，豬場(chǎng)的患病率高達(dá)74%。根據(jù)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6的氨基酸序列，輪狀病毒可以分為9組（RVARVD和RVF-RVJ）。其中，RVA、RVB、RVC和RVH四組對(duì)人和豬都具有致病性。豬A組輪狀病毒（RVA）和C組輪狀病毒（RVC）是新生仔豬中最常見的病原體，其中RVC的致死率可達(dá)100%。RVA是主要的輪狀病毒群，有多種基因型可引起豬腹瀉。與RVA類似，RVC也能感染多種動(dòng)物，尤其在新生仔豬中患病率較高。最近的研究表明，豬RVC毒株的某些基因（如VP6或nsP4）與人RVC毒株具有相似性，存在可能發(fā)生人畜共患病的情況。由于輪狀病毒的血清型較多，目前還沒(méi)有特效的治療方法。豬輪狀病毒和豬冠狀病毒的傳播對(duì)公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)產(chǎn)生了巨大威脅。因此，對(duì)于輪狀病毒的暴發(fā)和流行，及時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)和鑒別該病毒對(duì)于采取更有效的防治措施具有重要意義。目前常用的豬輪狀病毒檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)經(jīng)典檢測(cè)方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)經(jīng)典檢測(cè)方法主要基于電鏡技術(shù)和病毒分離培養(yǎng)技術(shù)。然而，電鏡技術(shù)設(shè)備昂貴且操作煩瑣，不適合大規(guī)模的臨床檢測(cè)。此外，病原檢測(cè)涉及復(fù)雜的病料處理流程，如細(xì)菌培養(yǎng)、動(dòng)物組織和血清處理等，受到其他病原體的影響，病原檢測(cè)的敏感性較低。病毒分離培養(yǎng)是病原檢測(cè)過(guò)程中必不可少的步驟，但由于病毒分離存在一定的不確定性，因此不適合大規(guī)模臨床檢測(cè)。目前，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是輪狀病毒檢測(cè)常用的方法。其中，ELISA是世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦使用的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)診斷輪狀病毒的方法。ELISA利用抗體與病毒特定蛋白結(jié)合的原理，通過(guò)顏色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)病毒的存在。PCR則通過(guò)擴(kuò)增目標(biāo)病毒的核酸序列來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，具有高度的敏感性和特異性。

二、豬輪狀病毒ELISA檢測(cè)方法

ELISA技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。目前，在國(guó)內(nèi)已經(jīng)建立了以豬輪狀病毒VP6和VP7蛋白為抗原的間接ELISA方法來(lái)檢測(cè)豬輪狀病毒血清抗體。研究人員使用純化的豬輪狀病毒VP6蛋白作為檢測(cè)抗原，建立了快速、特異、敏感的間接ELISA方法，為臨床上預(yù)防和治療豬輪狀病毒提供了一種有效的技術(shù)手段。此外，研究人員還開展了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)豬輪狀病毒血清抗體。他們使用純化的兔抗PRV抗血清作為包被抗體，利用2B3雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為檢測(cè)抗體。該方法在檢測(cè)豬輪狀病毒時(shí)與PEDV、TGEV和PRV沒(méi)有交叉反應(yīng)，并具有良好的穩(wěn)定性。與RT-PCR方法相比，該方法的準(zhǔn)確性達(dá)到了95.7%。盡管ELISA方法具有操作簡(jiǎn)練、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些局限性。例如，它不能夠進(jìn)行定量檢測(cè)，在臨界值附近時(shí)無(wú)法判斷結(jié)果。

三、豬輪狀病毒分子生物學(xué)技術(shù)方法

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）是一種目前在RV病毒檢測(cè)中具有高特異性的方法。它的操作簡(jiǎn)單，可以擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)的克隆和測(cè)序等研究。然而，與病毒培養(yǎng)相比，該方法不能夠準(zhǔn)確地定量目標(biāo)病毒。此外，在操作過(guò)程中，判斷反應(yīng)結(jié)果需要進(jìn)行電泳，這會(huì)延長(zhǎng)操作時(shí)間。而且，操作過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生污染，并且人工判斷結(jié)果時(shí)存在誤判的可能性。因此，為了提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，許多學(xué)者對(duì)RT-PCR的實(shí)驗(yàn)原理進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化。

1.一步法RT-PCR。RT-PCR試驗(yàn)可以使用一步法和兩步法進(jìn)行。一步法RT-PCR技術(shù)是在同一個(gè)緩沖液和酶系中進(jìn)行cDNA合成和PCR擴(kuò)增，無(wú)需建立cDNA文庫(kù)，即可獲得少量的mRNA。這種方法省去了中間步驟，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程。兩步法RTPCR是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)cDNA進(jìn)行合成，并將合成的cDNA作為PCR的模板，將RNA的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增分為兩個(gè)步驟?？蒲腥藛T使用NSP4作為目標(biāo)基因設(shè)計(jì)引物，開發(fā)了一種基于一步法的RT-PCR技術(shù)。與傳統(tǒng)的RT-PCR技術(shù)相比，這種方法具有簡(jiǎn)便、高效、快速、靈敏度高、特異性高和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。與兩步法相比，一步法具有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，操作簡(jiǎn)便只需1～2小時(shí)；其次，反應(yīng)快速，只需15分鐘即可完成；此外，使用非核酸模板（如生物素）而不是核酸模板（如PCR產(chǎn)物），可以降低污染的風(fēng)險(xiǎn)；再者，一步法對(duì)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響較小，因?yàn)镽NA的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化主要出現(xiàn)在3'端或5'端，一步法可以減少RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化；最后，由于在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中進(jìn)行了純化，一步法可以降低由引物和模板不匹配引起的PCR錯(cuò)誤率。綜上所述，一步法RT-PCR具有簡(jiǎn)單操作、快速、低污染、對(duì)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)影響小和PCR錯(cuò)誤率低等優(yōu)點(diǎn)，是一種有效的RT-PCR技術(shù)。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR。熒光定量PCR是一種廣泛應(yīng)用的病毒檢測(cè)方法，與傳統(tǒng)PCR相比，它具有更高的靈敏度、更強(qiáng)的特異性，并且具有高度的自動(dòng)化程度，對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，并且可以進(jìn)行多樣的檢測(cè)反應(yīng)，所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。熒光定量PCR技術(shù)主要包括探針?lè)ê蚐YBR Green I染料法?？茖W(xué)家選擇了VP6基因用于引物設(shè)計(jì)，通過(guò)使用FAM、Texas Red、CY5和VIC這四種不同的信號(hào)波長(zhǎng)，建立了基于TaqMan探針的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，可用于檢測(cè)和區(qū)分豬流行性腹瀉病毒的G1和G2亞型，以及豬輪狀病毒的A和C群。該方法具有高度的特異性，因?yàn)樗姆N信號(hào)波長(zhǎng)不同，不會(huì)相互干擾，可以在同一反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)熒光信號(hào)。這種方法減少了檢測(cè)時(shí)間和成本，為多種豬腹瀉病毒的快速、靈敏和特異性檢測(cè)提供了有效的工具。該多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以作為豬病毒性腹瀉病的早期篩查工具、流行病學(xué)研究以及腹瀉病毒傳播的監(jiān)測(cè)。另外，高等科學(xué)家利用VP6基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立了一種使用SYBR Green I染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，用于檢測(cè)豬A組輪狀病毒。與探針?lè)ㄏ啾?，染料法的特異性更高、敏感性更?qiáng)，但如果探針區(qū)域發(fā)生變異，可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。針對(duì)容易發(fā)生變異的區(qū)域，采用多個(gè)探針可以避免這個(gè)缺陷，但是探針的設(shè)計(jì)、標(biāo)記和純化成本較高。而科學(xué)家開發(fā)的基于SYBR Green I染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法成本較低，只需設(shè)計(jì)特異性引物即可進(jìn)行病毒拷貝數(shù)的檢測(cè)，而且比普通PCR方法具有更高的敏感性，重復(fù)性也良好，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2%，表明該方法具有較高的穩(wěn)定性，非常適合臨床上大規(guī)模檢測(cè)。

3.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。

科研人員利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）開發(fā)了一種快速檢測(cè)輪狀病毒的方法。該方法利用具有鏈置換功能的BST DNA聚合酶，在60～65℃的恒定溫度下擴(kuò)增目標(biāo)序列。這種技術(shù)的原理是在固定溫度條件下，引物與模板形成氫鍵，從而只需進(jìn)行恒溫反應(yīng)即可獲得目標(biāo)條帶，無(wú)需進(jìn)行模板熱變性、溫度循環(huán)、跑電泳和UV觀察等步驟。該反應(yīng)體系中只有模板和引物參與反應(yīng)，使整個(gè)過(guò)程簡(jiǎn)化且省去了復(fù)雜的PCR步驟。與傳統(tǒng)的RT-PCR相比，這種方法節(jié)省了時(shí)間，提高了效率，因?yàn)闊o(wú)需進(jìn)行模板熱變性、溫度循環(huán)、跑電泳和UV觀察等步驟。此外，所需儀器簡(jiǎn)單，易于在臨床應(yīng)用中使用。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于減少了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性，為快速、高效的病毒檢測(cè)提供了一種新的選擇。

四、綜合防治

豬輪狀病毒具有季節(jié)性發(fā)生和流行的特點(diǎn)，多在冬春季發(fā)病較多。它以地方性或散在流行的方式傳播，影響各個(gè)發(fā)育階段的豬只。病癥主要表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水、食欲不振和低精神狀態(tài)。特別是對(duì)于哺乳仔豬和斷奶仔豬，其危害更為嚴(yán)重，影響它們的正常生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)也給養(yǎng)殖場(chǎng)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

豬輪狀病毒主要通過(guò)患病豬和潛伏感染豬傳播，主要途徑是糞-口傳播，即病豬排泄的糞便可污染飼料和飲用水，從而成為主要的傳播途徑。為了應(yīng)對(duì)這個(gè)問(wèn)題，建議在日常養(yǎng)殖過(guò)程中采取以下措施：對(duì)患病豬進(jìn)行隔離，一旦發(fā)現(xiàn)疑似病例，立即將其隔離，以切斷傳染源并保護(hù)易感動(dòng)物免受病原體感染。對(duì)病豬的飼養(yǎng)工具和飼養(yǎng)場(chǎng)地進(jìn)行全面的消毒，以切斷傳播途徑。改善環(huán)境衛(wèi)生狀況，定期清潔和消毒養(yǎng)殖環(huán)境，每天進(jìn)行消毒連續(xù)一周。確保飼料不受污染且營(yíng)養(yǎng)豐富，這樣可以提高豬只的免疫力和抵抗力，預(yù)防不良誘因。對(duì)于仔豬，應(yīng)按照規(guī)定的疫苗免疫程序進(jìn)行接種，并及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)種，確保養(yǎng)殖動(dòng)物達(dá)到預(yù)定的抗體水平。

綜上所述，豬輪狀病毒是一種傳播廣泛且危害嚴(yán)重的病毒性傳染病。目前存在多種檢測(cè)以及針對(duì)該病的治療和預(yù)防方法。因此，養(yǎng)殖管理人員應(yīng)高度重視病毒的衛(wèi)生環(huán)境消毒，制定全面的防控措施，及時(shí)切斷病毒傳播途徑，減少病原體存活的機(jī)會(huì)，確保養(yǎng)殖動(dòng)物的健康生長(zhǎng)。