秦蓓 王榮 余麗麗 張怡心 譚雄 王娜娜

(西安醫(yī)學(xué)院1.西安市多靶協(xié)同抗高血壓創(chuàng)新藥物研制重點實驗室2.藥物研究所3.藥學(xué)院,陜西 西安 710021)

高血壓是臨床常見的心腦血管疾病之一,據(jù)調(diào)查我國成人高血壓的患病率約為23.2%[1]。藥物治療是高血壓控制的關(guān)鍵,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑是高血壓防治的一線藥物。課題組以普利類藥物結(jié)構(gòu)設(shè)計為基礎(chǔ),基于“組合中藥分子化學(xué)”研究策略[2],設(shè)計篩選得到了一個具有自主知識產(chǎn)權(quán)(RU2685709C2)的候選藥物分子—脯氨酸丹參素冰片酯,其化學(xué)名為(S)-1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-基-1-[(S)-2-((R)-3-(3,4-二羥基苯基)-2-羥基丙酰氨基)丙?；鵠吡咯烷-2-羧酸酯[3],結(jié)構(gòu)如圖1。在該分子結(jié)構(gòu)中間的二肽結(jié)構(gòu)是普利類藥物的母核結(jié)構(gòu),該部分母核結(jié)構(gòu)的存在使其能夠與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶有效作用。二肽脯氨酸端通過酯鍵與右旋龍腦(冰片)結(jié)合,冰片具有芳香開竅作用[4],可以協(xié)助藥物分子通過血腦屏障,直接作用于大腦,同時降低傳統(tǒng)普利類藥物在肺部富集引起干咳的問題[5]。二肽的丙氨酸端與丹參素通過更為穩(wěn)定的酰胺鍵結(jié)合,丹參素可以實現(xiàn)協(xié)同降壓的同時起到了保護血管[6]、心臟[7]、腎臟[8]等臟器的作用。前期研究顯示,脯氨酸丹參素冰片酯可作用于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)系統(tǒng)發(fā)揮降壓效果,在此基礎(chǔ)之上,為進一步評價該化合物的安全性,考察脯氨酸丹參素冰片酯對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響,為其臨床應(yīng)用提供安全性方面的實驗數(shù)據(jù)。

圖1 脯氨酸丹參素冰片酯的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級KM健康小鼠,體重(20 ± 2)g,雌雄各半,購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心,實驗動物許可證號:SYXK(陜)2020-005。動物雌雄分籠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)獨立通氣籠中,自由飲用高壓滅菌水,60Co放射滅菌鼠顆粒飼料喂養(yǎng),環(huán)境溫度(25 ± 5)℃、濕度(50 ± 10)%。

1.2 藥品與試劑脯氨酸丹參素冰片酯(自制,白色結(jié)晶,高效液相色譜法測定含量為97 %);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(河南勝久實業(yè)有限公司);戊巴比妥鈉鈉(美國Merck,批號:191204);醋酸。以0.5 % CMC-Na溶液為溶劑配置不同濃度藥物溶液。

1.3 實驗儀器YLS-4C轉(zhuǎn)棒式疲勞儀,YLS-6B智能熱板儀,YLS-1C動物自由活動儀(均購自濟南益延科技發(fā)展有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠一般行為和自主活動觀察小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機分為對照組和脯氨酸丹參素冰片酯大劑量(120 mg/kg)、中劑量(60 mg/kg)和小劑量(30 mg/kg)給藥組,每組10只,雌雄各半。試驗前禁食12 h,自由飲水,分別灌胃給予相應(yīng)藥物,對照組灌胃等量溶劑。給藥前及給藥后10、30、60、90、120、180 min將小鼠放至自主活動記錄儀,記錄小鼠5 min內(nèi)自主活動次數(shù),并觀察小鼠的一般行為。

1.4.2 小鼠協(xié)調(diào)運動實驗小鼠分組及給藥同1.4.1,分別采用轉(zhuǎn)棒法和金屬網(wǎng)法考察脯氨酸丹參素冰片酯對小鼠協(xié)調(diào)運動能力的影響。(1)轉(zhuǎn)棒法:實驗前小鼠于轉(zhuǎn)棒儀轉(zhuǎn)桿訓(xùn)練3 d,轉(zhuǎn)速40 rpm/min。記錄給藥前及給藥60 min后小鼠從轉(zhuǎn)棒儀轉(zhuǎn)桿上掉落所用時間。(2)金屬網(wǎng)法[9]:給藥后將小鼠放置于與桌面呈50°的金屬網(wǎng)上任其攀爬,記錄給藥前及給藥后60 min后各組小鼠從金屬網(wǎng)上掉落使用的時間。

1.4.3 小鼠睡眠協(xié)同作用試驗小鼠分組及給藥同1.4.1。小鼠灌胃給藥30 min后,腹腔注射戊巴比妥鈉(閾下和閾睡眠劑量分別為30 mg/kg和45 mg/kg)[10-11],觀察30 min內(nèi)小鼠翻正反射消失情況(小鼠四肢朝上仰臥1 min沒有翻轉(zhuǎn)過來即為進入翻正反射消失階段),超過1 min以上即為睡眠動物。以翻正反射消失為睡眠指標,計算入睡潛伏期(從注射戊巴比妥鈉開始到翻正反射消失之間所用的時間)和睡眠持續(xù)時間(翻正反射消失到翻正反射恢復(fù)所用的時間)。計算睡眠發(fā)生百分率,入睡率(%)=入睡動物數(shù)/動物總數(shù)×100%。

1.4.4 小鼠鎮(zhèn)痛作用試驗小鼠分組及給藥同1.4.1,分別采用熱板法和醋酸扭體法考察脯氨酸丹參素冰片酯的鎮(zhèn)痛作用。(1)熱板法:熱板儀調(diào)至(55±0.5)℃,小鼠置于熱板上,以小鼠舔后足作為痛覺指標,記錄小鼠出現(xiàn)舔后足的時間作為痛閾值。記錄給藥前和給藥后60、120、180 min小鼠的痛閾值。(2)醋酸扭體法:給藥后24 h,每只小鼠腹腔注射1 %醋酸0.2 mL/10 g,小鼠腹部出現(xiàn)內(nèi)凹、軀干與后肢伸張,臀部高起等行為被認定發(fā)生一次扭體反應(yīng)。觀察10 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)及出現(xiàn)扭體的時間。

2 結(jié) 果

2.1 藥物的來源實驗藥物由課題組自主設(shè)計合成。該藥物的合成以冰片、Boc-L-丙氨酸、Boc-L-脯氨酸、丹參素為原料,合成過程通過了酯化縮合、脫叔丁氧?；?、酰胺化縮合、脫叔丁氧酰基、酰胺化縮合五步反應(yīng)。產(chǎn)物最終通過柱層析分離和重結(jié)晶聯(lián)合的方法進行純化研究,路線產(chǎn)率可達30%以上。純化后產(chǎn)物的色譜純度達到99.8%以上,適合用于后期的成藥性研究。

2.2 各組小鼠自主活動情況各組小鼠姿勢、步態(tài)等一般行為均正常。與對照組相比,脯氨酸丹參素冰片酯大劑量、中劑量和小劑量組在10～180 min內(nèi)小鼠的自主活動逐漸降低,且在120 min時自主活動次數(shù)最少。與給藥前相比,脯氨酸丹參素冰片酯大劑量、中劑量和小劑量組對小鼠自主活動次數(shù)無顯著影響(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠自主活動情況對比次,n=10]

2.3 各組小鼠協(xié)調(diào)運動能力情況轉(zhuǎn)棒法:與對照組相比,脯氨酸丹參素冰片酯大劑量、中劑量和小劑量組小鼠在棒時間無顯著性差異;與給藥前相比,脯氨酸丹參素冰片酯大劑量、中劑量和小劑量組小鼠在棒時間均有延長趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。金屬網(wǎng)法:給藥前各組小鼠從金屬網(wǎng)上掉落時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);給藥后,與對照組相比,脯氨酸丹參素冰片酯大劑量、中劑量和小劑量組顯著延長了小鼠從金屬網(wǎng)上掉落的時間(P<0.05);與給藥前相比較,脯氨酸丹參素冰片酯對小鼠在網(wǎng)攀爬時間無顯著影響(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠協(xié)調(diào)運動能力對比

2.4 各組小鼠入睡情況各組小鼠分別灌胃給藥后給予戊巴比妥鈉閾下和閾劑量,與對照組相比,脯氨酸丹參素冰片酯大劑量、中劑量和小劑量各組小鼠的入睡只數(shù)、睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) ,表明脯氨酸丹參素冰片酯對小鼠入睡潛伏時間和睡眠時間無明顯影響。見表3。

表3 各組小鼠入睡情況比較

2.5 脯氨酸丹參素冰片酯鎮(zhèn)痛作用比較熱板法:與對照組相比,脯氨酸丹參素冰片酯大劑量、中劑量和小劑量各組小鼠的痛閾值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與給藥前相比,脯氨酸丹參素冰片酯各劑量組小鼠的痛閾值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。醋酸扭體法:與對照組相比,脯氨酸丹參素冰片酯大劑量、中劑量和小劑量對醋酸所致小鼠疼痛無顯著影響,其扭體反應(yīng)出現(xiàn)的時間和次數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 脯氨酸丹參素冰片酯對各組小鼠痛閾值的影響

3 討 論

一般藥理學(xué)也稱安全性藥理學(xué),其目的是研究藥物在治療或治療范圍以上時,潛在的不希望出現(xiàn)的對生理功能的不良影響[12]。一般藥理學(xué)觀察包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等方面。在新藥研發(fā)過程中,一般藥理學(xué)與急性毒性、長期毒性是對藥物進行安全性評價的重要組成部分。脯氨酸丹參素冰片酯是本課題組研發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗高血壓藥物,但其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響尚未見研究,其安全性及潛在受累靶器官尚不清楚。

本研究采用經(jīng)典的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥理實驗方法,如自主活動記錄、轉(zhuǎn)棒法、協(xié)同睡眠法等,評價,脯氨酸丹參素冰片酯對小鼠自主活動、協(xié)同睡眠、協(xié)調(diào)運動能力等的影響。結(jié)果顯示,脯氨酸丹參素冰片酯對小鼠一般行為和自主活動方面無顯著影響;對戊巴比妥鈉的睡眠作用不具有協(xié)同或累加效應(yīng);脯氨酸丹參素冰片酯對不具有鎮(zhèn)痛作用。在小鼠協(xié)調(diào)運動能力方面,脯氨酸丹參素冰片酯顯著延長了小鼠在網(wǎng)攀爬時間,但對小鼠在棒時間無顯著影響,故認為此現(xiàn)象與藥物毒性作用無關(guān)。以上研究表明,脯氨酸丹參素冰片酯在治療量或較高劑量時,對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)無顯著影響。本研究提供了脯氨酸丹參素冰片酯安全性試驗數(shù)據(jù),為其進一步研究開發(fā)提供了理論依據(jù)。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通過陜西西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(批準號:XYLS2022053),為動物實驗故免除知情同意。