高過，華永飛，江寅，王高卿

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是發(fā)病率和死亡率逐年上升的惡性腫瘤之一[1]。其是一個(gè)高度異質(zhì)性的惡性腫瘤[2]，傳統(tǒng)的分期如TNM 分期，在預(yù)測患者生存差異方面并未表現(xiàn)出很好效果[3]。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)為PC患者的治療提供了許多有價(jià)值的參考，也讓個(gè)體化治療成為了現(xiàn)實(shí)[4-5]。二代測序技術(shù)的使用，使利用相關(guān)特征對患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層成為了可能[6]。本研究通過不同數(shù)據(jù)集獲得了和PC 預(yù)后相關(guān)的基因，并建立了著絲粒蛋白E（centromere protein E，CENPE）、肌動蛋白結(jié)合蛋白（anillin，actin binding protein，ANLN）和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白2 類似物（cytoskeleton associated protein 2 like，CKAP2L）在內(nèi)的預(yù)后模型，適用于指導(dǎo)患者預(yù)后評估和治療決策，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 本研究嚴(yán)格遵守根據(jù)赫爾辛基宣言，所使用的數(shù)據(jù)來源于 TCGA（https://portal.gdc.com）、ICGC（https://dcc.icgc.org/releases/current/Projects）和HPA（https://www.proteinatlas.org/）數(shù)據(jù)庫。本研究從ICGC 和TCGA 數(shù)據(jù)庫獲取PC 的RNAseq 數(shù)據(jù)（level3）和相應(yīng)的臨床信息，從GTEx V8 版數(shù)據(jù)庫（https://gtexportal.org/home/datasets ）獲取正常胰腺組織RNAseq 數(shù)據(jù)，從HPA 數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)蛋白在PC 中表達(dá)的免疫組化結(jié)果。

1.2 篩選和PC 預(yù)后相關(guān)的基因 基于ICGC 數(shù)據(jù)庫所獲取的兩個(gè)數(shù)據(jù)集中PC 的RNAseq 數(shù)據(jù)（level3）和相應(yīng)的臨床信息，通過單因素Cox 回歸分析與PC預(yù)后相關(guān)的基因，兩個(gè)數(shù)據(jù)集取交集并結(jié)合文獻(xiàn)資料最終選擇所要研究的目的基因。

1.3 目的基因在PC和正常胰腺組織中的表達(dá)水平通過TCGA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選出的目的基因在PC 和正常胰腺組織中的表達(dá)水平。從TCGA 數(shù)據(jù)庫獲取在PC 及癌旁組織中RNAseq 數(shù)據(jù)（level3），從GTEx 數(shù)據(jù)庫獲取正常胰腺組織RNAseq 數(shù)據(jù)。

1.4 目的基因表達(dá)水平對PC 患者預(yù)后的影響 基于TCGA 數(shù)據(jù)庫獲取的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步驗(yàn)證目的基因?qū)C 患者預(yù)后的影響。

1.5 構(gòu)建基因相關(guān)的預(yù)后模型 基于1.4 中所獲取的TCGA 數(shù)據(jù)集，使用R 包“glmnet”執(zhí)行Lasso Cox回歸以及10 倍交叉驗(yàn)證；采用R 軟件survival 包進(jìn)行多因素Cox 回歸分析構(gòu)建預(yù)后模型。

1.6 基因預(yù)后模型獨(dú)立于其他臨床因素 為了證明PC患者存在其他臨床變量影響預(yù)后，本研究進(jìn)行了單因素和多因素Cox 回歸分析，將臨床特征和基因預(yù)后模型設(shè)置為自變量，將總體生存時(shí)間（overall survival，OS）設(shè)置為因變量。

1.7 構(gòu)建和驗(yàn)證列線圖 為了提高模型的適用性，將具有預(yù)后能力的臨床變量與基因特征模型相結(jié)合，并應(yīng)用列線圖來預(yù)測PC 患者的預(yù)后?；趩我蛩睾投嘁蛩谻ox 回歸分析選擇所有獨(dú)立預(yù)后因素來構(gòu)建列線圖來評估PC 患者1 年OS 的概率。使用R包“timeROC”獲得1 年OS 的ROC 曲線和AUC。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法 采用R V4.0.3 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用的R 包主要包括survival、survminer、timeROC、glmnet 和rms 等。兩組間基因表達(dá)水平的比較采用Wilcox檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC 差異表達(dá)基因 通過ICGC 數(shù)據(jù)庫中的兩個(gè)數(shù)據(jù)集篩選與PC 預(yù)后相關(guān)的差異基因，其中澳大利亞數(shù)據(jù)集和加拿大數(shù)據(jù)集分別獲取了2 355 和2 828 個(gè)差異差異基因，將兩個(gè)數(shù)據(jù)集所獲差異基因最顯著的前30 個(gè)基因取交集，最終獲得3 個(gè)候選目的基因，分別CENPE、ANLN 和CKAP2L，見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因

2.2 差異基因在PC 和正常組織中的表達(dá)水平 基于TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)集比較2.1 中所選3 個(gè)差異基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示相比正常胰腺組織，CENPE、ANLN 和CKAP2L 在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯升高（均P ＜0.05），見圖2。HPA 數(shù)據(jù)庫的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也提示CENPE、ANLN 和CKAP2L蛋白表達(dá)水平呈強(qiáng)陽性，見圖3。

圖3 CENPE、ANLN和CKAP2L蛋白在胰腺癌中的表達(dá)（IHC染色，×4）

2.3 差異基因表達(dá)水平與PC不良預(yù)后的相關(guān)性 基于TCGA 數(shù)據(jù)集進(jìn)一步驗(yàn)證和分析CENPE、ANLN和CKAP2L 的表達(dá)對PC 患者OS 的影響，結(jié)果顯示高表達(dá)CENPE、ANLN、CKAP2L 的PC 患者的中位OS 短于低表達(dá)患者（均P ＜0.05），見圖4。

2.4 構(gòu)建預(yù)測模型 使用TCGA 數(shù)據(jù)集生成了基于上述三個(gè)基因表達(dá)的預(yù)測模型，隨后計(jì)算了三個(gè)基因表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)評分，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分截?cái)嘀担?9 例患者被分為高風(fēng)險(xiǎn)組，其余90 例患者被分為低風(fēng)險(xiǎn)組?；谌齻€(gè)基因的兩組K-M 曲線提示高風(fēng)險(xiǎn)組的預(yù)后明顯短于低風(fēng)險(xiǎn)組（P ＜0.05）。預(yù)后模型的1 年生存時(shí)間的AUC 為0.67，見圖5。

圖5 以最佳截?cái)帱c(diǎn)為界，高風(fēng)險(xiǎn)組的總生存率低于低風(fēng)險(xiǎn)組

2.5 構(gòu)建和驗(yàn)證列線圖 采用單因素和多因素Cox回歸分析來檢測基于三基因的預(yù)后模型在TCGA隊(duì)列中的獨(dú)立預(yù)測能力。單因素Cox 回歸分析結(jié)果提示：預(yù)后模型、年齡、腫瘤分級（分化程度）和放療具有預(yù)后價(jià)值，而其他變量與OS 沒有顯著相關(guān)；將上述具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量納入到多因素Cox回歸分析，顯示預(yù)后模型和放療是獨(dú)立預(yù)后因素（均P ＜0.05），見表1。

表1 單因素和多因素Cox 回歸分析

為了使預(yù)后模型適用于臨床，應(yīng)用列線圖來預(yù)測TCGA 隊(duì)列中患者1 年OS 的概率，列線圖中的預(yù)測因素包括預(yù)后模型和放療，1 年OS概率校準(zhǔn)圖提示列線圖性能較好，見圖6。進(jìn)一步計(jì)算了相應(yīng)模型預(yù)測1 年OS 的AUC 為0.78，見圖7。

圖6 列線圖的構(gòu)建和驗(yàn)證

圖7 列線圖模型預(yù)測PC 患者1 年OS 的時(shí)間依賴性ROC 曲線

3 討論

PC是最常見的癌癥死亡原因之一，長期存活率仍然很低，隨著治療水平的不斷提高，雖然在一定程度上改善了PC 患者的預(yù)后，但通過危險(xiǎn)分層識別高危患者將更有助于提高PC 患者的存活時(shí)間?；虻漠惓１磉_(dá)是腫瘤始發(fā)的內(nèi)在因素，篩選出PC中異常表達(dá)的基因?qū)τ陂_發(fā)新標(biāo)記物和構(gòu)建腫瘤預(yù)后模型至關(guān)重要。本研究利用不同數(shù)據(jù)集篩選出與PC預(yù)后密切相關(guān)的差異表達(dá)基因，進(jìn)而構(gòu)建了多基因預(yù)后模型，并且納入了相關(guān)臨床因素形成了具有較好預(yù)測能力的列線圖。

本研究結(jié)果顯示CENPE、ANLN 和CKAP2L 與PC 密切相關(guān)。CENPE 是著絲粒的核心成分，在有絲分裂過程中將染色體連接到紡錘體微管上，在紡錘體微管捕獲和染色體會聚中發(fā)揮作用[7-8]。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)CENPE與多種腫瘤的惡性表型有關(guān)，如肺癌[9]、食管癌[10]、乳腺癌[11]和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[12]等。紫杉醇和秋水仙堿通過抑制有絲分裂紡錘體可塑性來抑制腫瘤細(xì)胞分裂，而CENPE蛋白在有絲分裂過程中起著重要作用，因此，CENPE 很可能成為實(shí)體腫瘤治療的靶點(diǎn)[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)CENPE 在PC 組織中表達(dá)明顯升高，且與PC 患者的不良預(yù)后相關(guān)，與Güven[14]研究結(jié)果相符。

既往相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)[15-16]，ANLN 過表達(dá)于PC組織和細(xì)胞系中，且與腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)，ANLN 通過調(diào)節(jié)EZH2/miR-218-5p/LASP1 信號軸促進(jìn)PC 進(jìn)展，這提示ANLN 可能是潛在治療靶點(diǎn)。Olakowski 等[17]也發(fā)現(xiàn)ANLN 和HIST1H1C 在PC中高表達(dá)，并基于這兩個(gè)基于構(gòu)建了預(yù)后模型且具有較好性能。本研究通過篩選也發(fā)現(xiàn)ANLN 明顯與PC 患者的不良預(yù)后有關(guān)，進(jìn)一步提示ANLN 在PC 中的關(guān)鍵作用。

CKAP2L 是一種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，與許多腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。一項(xiàng)泛癌研究表明，在大多數(shù)癌癥中，CKAP2L表達(dá)和活性顯著升高，CKAP2L表達(dá)升高導(dǎo)致患者預(yù)后不良，并且是大多數(shù)腫瘤的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；高表達(dá)CKAP2L 的患者對免疫治療更加敏感，可作為預(yù)測腫瘤免疫治療的生物標(biāo)志物[18]。本研究結(jié)果也顯示CKAP2L 和PC 患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。楊潞頔[19]對CKAP2L 在PC 中的作用機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)探討，發(fā)現(xiàn)CKAP2L 通過調(diào)節(jié)MYC 通路促進(jìn)PC 細(xì)胞的惡性表型，且促進(jìn)了PC 細(xì)胞的體內(nèi)成瘤和肝轉(zhuǎn)移。

基于臨床相關(guān)因素構(gòu)建的PC 預(yù)后模型已被諸多研究報(bào)道，盡管所報(bào)道的模型效能較好[20-21]，但考慮基因異常在腫瘤中的關(guān)鍵作用，似乎有必要將相關(guān)異常基因納入到模型中從而更能提高其效能。本研究結(jié)合上述三基因構(gòu)建的危險(xiǎn)分層和預(yù)后模型，可以較準(zhǔn)確對患者預(yù)后作出預(yù)測。Olakowski[17]等基于ANLN 和HIST1H1C 雙基因構(gòu)建的PC 預(yù)后模型，列線圖模型的曲線下面積在0.5 年時(shí)為0.83，在1 年時(shí)為0.73，并且列線圖模型的C 指數(shù)比單獨(dú)的其他變量高0.66。說明了結(jié)合將異常表達(dá)的基因和臨床相關(guān)因素結(jié)合構(gòu)建腫瘤預(yù)后模型的重要性。

然而，本研究存在一些局限性。首先，考慮到PC的預(yù)后不良，本文構(gòu)建了1 年OS的預(yù)測模型；其次，由于缺乏特定的臨床數(shù)據(jù)，無法對列線圖進(jìn)行外部驗(yàn)證，這意味著列線圖應(yīng)該使用多中心臨床試驗(yàn)和前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究使用相對嚴(yán)格的回歸模型方法確定三個(gè)基因在PC中具有預(yù)后意義，構(gòu)建了包含預(yù)后模型的列線圖，以幫助臨床醫(yī)生以個(gè)性化方式治療PC 患者。

致謝 感謝TCGA、ICGC、GTEx 和HPA 數(shù)據(jù)庫提供的平臺和資源，同時(shí)感謝中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院的武強(qiáng)博士在數(shù)據(jù)處理上提供的指導(dǎo)和幫助。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 高過：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫；高過、江寅：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；江寅、王高卿、華永飛：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持