戚穎 黃子祺 別鴻宇 顏次慧 任秀寶

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居癌癥相關死亡第4 位[1]。胃竇是炎癥、潰瘍和腫瘤的高發(fā)部位，胃竇癌（gastric antral cancer，GAC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[2]。免疫治療已成為癌癥治療的重要方式，研究者越來越認識到免疫檢查點在腫瘤免疫治療中的關鍵作用。免疫檢查點是T 細胞表面的信號分子，可以通過調控其活性并參與免疫反應。通過阻斷免疫檢查點，可以促使腫瘤消退。因此，研究免疫檢查點與癌癥臨床治療的關系至關重要[3-5]。目前研究較多的是PD-1、PD-L1 抑制劑，但其并不能對所有腫瘤患者有效，因此有必要找出更多的免疫檢查點。靶向多個免疫檢查點可能是一種有前途的策略，可以阻斷免疫檢查點的抑制作用，從而在癌癥中獲得更多的抗腫瘤效果[6]。淋巴細胞激活基因3（lymphocyteactivation gene 3，LAG-3）是一種免疫檢查點受體蛋白，可在活化的T 淋巴細胞上表達，其在抗腫瘤免疫中的作用越來越受到重視[7]。纖維蛋白原樣蛋白1（fibrinogen-like protein 1，FGL1）是肝臟分泌的與增殖和代謝有關的蛋白。多項研究證明FGL1 是LAG-3 的一個新型免疫檢查點配體，阻斷FGL1、LAG-3 相互作用可能為新型免疫檢查點抑制劑治療帶來希望[8]。主要組織相容性復合體Ⅱ類分子（major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC-Ⅱ）是LAG-3 的經典配體，LAG-3 與MHC-Ⅱ的結合可以抑制T 細胞的活化，從而發(fā)揮負性免疫調節(jié)的功能，維持內環(huán)境穩(wěn)定[9]。本研究旨在探討LAG-3 與其配體FGL1、MHC-Ⅱ在胃竇癌中的表達情況，以及與臨床病理特征和預后的關系，從而為臨床腫瘤免疫治療研究提供新線索。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 病例資料 收集天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院2012年1 月至2014 年12 月診斷為GAC 患者的組織石蠟標本67 例。納入標準：1）所有患者均行胃部腫瘤切除術，術前未進行其他抗癌治療，經病理確診為胃竇癌；2）臨床分期均為Ⅲ期；3）均有完整的病歷資料，留有完整組織標本。排除標準：1）術前接受其他抗癌治療；2）臨床病理資料不完整；3）精神疾病或認知障礙者。

全部標本中男性52 例，女性15 例；年齡30～82 歲，≤55 歲24 例，＞55 歲43 例；分期采用國際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國抗癌聯(lián)合委員會（AJCC）第8 版TNM 分期。本研究獲得天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準（編號：E20230556），患者均知情同意。

1.1.2 主要試劑 抗體：#15372（LAG-3）購自美國Cell Signaling Tecnology 公司；ab275091（FGL1）購自英國Abcam 公司；ab7856（MHC-Ⅱ）購自英國Abcam 公司。DAB 顯色試劑盒購自北京中衫金橋生物有限公司；二抗即酶標羊抗鼠/兔IgG 聚合物購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學檢測 石蠟切片脫蠟后用枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓修復，3%H2O2封閉，一抗于4℃冰箱孵育過夜。第二天PBS 洗后，于室溫孵育二抗，加入現配制的DAB 顯色液顯色，至出現棕色陽性反應。蘇木素染色，鹽酸分化，氨水返藍，乙醇梯度脫水，置于通風櫥晾干后樹膠封片顯微鏡下觀察。

1.2.2 收集信息 收集患者臨床病理特征，隨訪至2023 年7 月，中位隨訪時間為35.5（4～123）個月?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為手術日期至任何原因死亡的時間，無病生存期（disease-free survival，DFS）定義為手術日期至腫瘤復發(fā)或由于腫瘤進展死亡的時間。全部患者失訪13 例，故分析54 例患者LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ三個指標在各部位表達情況的生存曲線。

1.2.3 結果判定 評估時首先排除正常、壞死和壓壞的偽影區(qū)域，然后對全片進行閱片。PBS 代替一抗作陰性對照，采用已知陽性切片作陽性對照。所有指標的結果均由兩位病理科醫(yī)師經雙盲法測定，對免疫細胞及腫瘤細胞（細胞漿、細胞核）表達的百分比進行評估，為減小誤差，最終結果取兩位醫(yī)生評估的平均值。陽性率（%）=陽性細胞數/總細胞數×100%

本研究中提到的LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ在免疫細胞和腫瘤細胞中的陽性率以及FGL1 的免疫組織化學評分（histochemistry score，H-score）均用簡稱代替（表1）。

表1 LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ在各部分表達的簡稱

組織化學評分（H-score）：H-score=Σpi（i+1），公式中pi 表示特定指標陽性百分率；i 代表著色強度。著色強度分數：0 分（不著色 ），1 分（弱著色 ），2 分（中著色 ），3 分（強著色 ）。

分組方法：根據年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤大小和淋巴結轉移情況分別進行分組，與LAG-3 免疫細胞、FGL1 腫瘤細胞、MHC-Ⅱ免疫細胞以及MHC-Ⅱ腫瘤細胞陽性表達率進行比較。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0 和GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。對于非正態(tài)分布的兩獨立樣本，采用Mann-WhitneyU法檢驗兩組間是否存在差異。根據OS 制作受試者工作特征曲線選取截斷值，采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，采用Log-rank 法進行生存分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色

2.1.1 LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ陽性表達細胞 LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ陽性表達細胞通過讀片統(tǒng)計，LAG-3僅在免疫細胞中表達；FGL1 可在免疫細胞也可在腫瘤細胞中表達：免疫細胞中表達非常少，在本次試驗中忽略不計，主要在腫瘤細胞中表達；MHC-Ⅱ在免疫細胞和腫瘤細胞中均有表達。

2.1.2 LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ陽性細胞定位 LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ在陽性細胞中的定位通過觀察LAG-3 在免疫細胞細胞膜上表達；FGL1 在腫瘤細胞的細胞漿和細胞核中均表達，且細胞漿的表達明顯高于細胞核；MHC-Ⅱ在免疫細胞細胞膜上表達，同時在腫瘤細胞的細胞漿和細胞核表達（圖1～圖3）。采用柯爾莫戈洛夫-斯米諾夫檢驗分析，表明LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ在各部分表達的百分比均不符合正態(tài)分布；FGL1 腫瘤細胞中細胞核表達率中位數（95%CI）和FGL1 腫瘤細胞核表達率中位數（95%CI）均為0，故未體現（表2）。

圖1 LAG-3 在免疫細胞中的表達

圖2 FGL1 在腫瘤細胞中的表達

圖3 MHC-Ⅱ在免疫細胞、腫瘤細胞細胞漿和腫瘤細胞細胞核中的表達

表2 LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ在各部分表達的中位數（95%CI）

2.2 LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ在不同細胞內表達率和病理特征的相關性

LAG-3 免疫細胞陽性率與腫瘤大小、淋巴結是否轉移具有統(tǒng)計學相關性（P＜0.05），腫瘤大小＜4 cm的患者和無淋巴結轉移的患者LAG-3 免疫細胞陽性率更高；與患者年齡、性別、有無吸煙史、有無飲酒史無統(tǒng)計學相關性（P＞0.05）。而MHC-Ⅱ在腫瘤細胞中的陽性率與患者性別具有統(tǒng)計學相關性（P＜0.05），女性患者MHC-Ⅱ免疫細胞陽性率更高；與年齡、有無吸煙史、有無飲酒史、腫瘤大小、淋巴結是否轉移差異無統(tǒng)計學相關（P＞0.05），見表3。所有分組中的數據均不符合正態(tài)分布，故采用Mann-WhitneyU檢驗統(tǒng)計數據。

表3 LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ在不同細胞內表達率和病理特征的相關性

2.3 GAC 患者病理特征及LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ在免疫細胞和腫瘤細胞內的表達與生存的關系

LAG-3 免/免高的患者的OS 顯著高于LAG-3 免/免低的患者（P＜0.05，圖4A）；LAG-3 免/總高的患者的OS 顯著高于LAG-3 免/總低的患者（P＜0.05，圖4B）；MHC-Ⅱ免/總高患者的OS 顯著高于MHC-Ⅱ免/總低的患者（P＜0.05，圖5A）；MHC-Ⅱ腫/總高的患者的OS 顯著低于MHC-Ⅱ腫/總低的患者（P＜0.05，圖5B）；MHC-Ⅱ核/腫高的患者的OS 顯著低于MHC-Ⅱ核/腫低的患者（P＜0.05，圖5C）。MHC-Ⅱ免/總高的患者的DFS 顯著高于MHC-Ⅱ免/總低的患者的（P＜0.05，圖6A）；MHC-Ⅱ腫/總高的患者的DFS 顯著低于MHC-Ⅱ腫/總低的患者（P＜0.05，圖6B）；MHC-Ⅱ漿/總高的患者的DFS 顯著低于MHC-Ⅱ漿/總低的患者（P＜0.05，圖6C）。同時也對表2 中除上述外其余指標均進行生存分析發(fā)現差異無統(tǒng)計學意義，與生存預后無相關性（表2）。

圖4 LAG-3 在免疫細胞中表達水平與生存的關系

圖5 MHC-Ⅱ在免疫細胞、腫瘤細胞中的表達水平和生存的關系

圖6 MHC-Ⅱ在免疫細胞、腫瘤細胞中的表達水平和預后的關系

綜上所述，GAC 患者LAG-3、MHC-Ⅱ在免疫細胞上的高表達預示著較好的預后。

3 討論

2020 年，胃癌新發(fā)病例約有100 萬例，發(fā)病率居全部惡性腫瘤第5 位，病死率居第4 位[10]。胃竇是炎癥、潰瘍和腫瘤的好發(fā)部位，胃竇癌是消化系統(tǒng)常見的、多發(fā)的惡性腫瘤。免疫檢查點的研究是腫瘤免疫治療至關重要的一環(huán)。

LAG-3 主要表達在活化的CD4 和CD8 T 細胞上、NK 細胞和漿細胞樣樹突狀細胞表面，是一種抑制性受體，是繼 PD-1、PD-L1 之后最具有應用前景的免疫檢查點之一[11]。LAG-3 分子作為一種免疫檢查點受體蛋白，在多種實體腫瘤中表達異常，且與疾病預后有關。T 細胞中的LAG-3 表達是免疫抑制和腫瘤侵襲進展的標志物，說明LAG-3 在腫瘤免疫中發(fā)揮重要的調控作用。Lv 等[12]研究認為，與LAG-3 表達陽性細胞百分比低的患者相比，腫瘤組織中LAG-3 表達陽性細胞比例高的胃癌患者生存期更短，LAG-3 陽性表達與胃癌的不良預后有關。LAG-3 選擇性地與抗原提呈細胞和腫瘤細胞的MHC-Ⅱ相互作用，從而激活共抑制信號通路，最終導致T 細胞功能障礙。因此，靶向LAG-3 抑制其免疫抑制活性被認為具有巨大的臨床應用潛力。但在某些實體瘤的研究中得出相反的結論：LAG-3 的高表達與良好的OS 和DFS 相關，特別是在早期階段[11]。Zhang 等[13]研究報道，在包含所有階段（Ⅰ～ Ⅳ）的食管鱗狀細胞癌混合隊列中，LAG-3 表達與生存率提高相關，而LAG-3 的高表達對結局的有利影響僅限于Ⅰ～Ⅱ期腫瘤。本研究納入67 例GAC 患者，發(fā)現腫瘤大小＜4 cm 的患者和無淋巴結轉移的患者LAG-3 免疫細胞陽性率更高，LAG-3 免疫細胞表達率高的GAC 患者有更好的OS，可能的原因是LAG-3 在免疫細胞中的表達增加不能單純視為免疫抑制作用，或許可能是增強了炎癥免疫反應，刺激腫瘤微環(huán)境中淋巴細胞發(fā)揮抗腫瘤反應，從而獲得較好的OS。總而言之，LAG-3 在胃竇癌中的確切作用機制目前尚不明確，其在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮的具體調節(jié)作用有待未來進一步研究。

FGL1 與LAG-3 受體高親和力結合產生抑制信號，阻斷LAG-3/FGL1 相互作用能夠促進腫瘤微環(huán)境中T 細胞的活化和增殖，增強機體抗腫瘤免疫功能。癌癥患者血漿中FGL1 升高與預后不良和免疫治療效果有關[14-15]。Zhang 等[16]研究發(fā)現，FGL1 在胃癌組織中表達升高，與預后不良相關。本研究表明，FGL1 在免疫細胞和腫瘤細胞中的表達與GAC 患者的預后無顯著相關。這可能與LAG-3 存在多種配體并且與這些配體相互作用有關。

MHC-Ⅱ主要由抗原提呈細胞表達，活化的CD4+T 細胞通過T 細胞抗原受體與MHC-Ⅱ分子呈遞的抗原結合并發(fā)揮效應。本研究中免疫細胞中MHC-Ⅱ高表達較低表達患者的預后較好，與預期一致。然而，MHC-Ⅱ也可能是由腫瘤細胞表達，其可能與T 細胞浸潤和IFN-γ 信號通路基因富集相關。本研究中GAC 患者腫瘤細胞中MHC-Ⅱ高表達較低表達的患者預后差，可能是腫瘤細胞中MHC-Ⅱ與LAG-3 相互作用，產生免疫抑制信號，影響免疫細胞的功能。另有報道表明，腫瘤MHC-Ⅱ表達與多種癌癥類型（如乳腺癌、結腸癌、黑色素瘤）的良好預后相關[17]。推測在不同腫瘤、不同類型細胞中MHC-Ⅱ的表達可能對LAG-3 陽性T 細胞產生不同的影響，存在不一樣的機制，有待進一步研究。

本研究詳細分析了LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ在不同區(qū)域表達量的差異，以及與GAC 預后的關系。GAC 患者LAG-3 免/免、LAG-3 免/總高表達與較好的OS 相關，可能提示免疫細胞處于活化狀態(tài)，具有抗腫瘤潛力并發(fā)揮作用。后續(xù)可更深入地探索LAG-3與其配體FGL1、MHC-Ⅱ的相互調控機制，為腫瘤免疫調控的研究以及臨床轉化應用提供線索。

本文無影響其科學性與可信度的經濟利益沖突。