朵建英, 邸 麗, 盧 巖, 王 敏, 黃 月, 朱文佳,文欣玫, 徐 敏, 陳 海, 笪宇威

特發(fā)性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathy,IIM)是一組以骨骼肌炎癥浸潤,伴全身多臟器受累為特征的難治性、異質(zhì)性自身免疫性疾病,各組型臨床癥狀存在差異,發(fā)病機制各異,治療方法也不盡相同[1-2]。臨床上常將IIM分為多發(fā)性肌炎(polymyositis,PM)、皮肌炎(dermatomyositis,DM)、壞死性自身免疫性肌病(necrotizing antoimmune myopathy,NAM)、散發(fā)性包涵體肌炎(sporadic inclusion body myositis,IBM)和重疊性肌炎(overlap myositis,OM)[1,3-4]。其中前4種分類在臨床上應(yīng)用最廣,最后一種分類提出的時間較晚且定義尚存爭議。本文主要對前4種分類進行研究。肌肉病理檢查是IIM診斷、分型的重要依據(jù)[1,5-6]。目前,對各類型的IIM病理學特點主要以肌纖維組化染色、CD系列免疫組化染色及MHC-Ⅰ免疫組化染色進行鑒別[6]。主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類分子,是一類細胞表面特異性蛋白,可以通過識別和清除外來及內(nèi)在的抗原來參與和調(diào)控機體免疫應(yīng)答[7]。2004年歐洲神經(jīng)肌肉病中心已將MHC-Ⅰ免疫組化染色結(jié)果納入PM的診斷標準[8],MHC-Ⅱ免疫組化染色在IIM病理檢查中的作用也日益受到重視。本研究通過對臨床診斷明確的不同類型IIM,以及非炎性肌病(non-inflammatory myopathy,NIM)患者的肌肉活檢標本進行MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ免疫組化染色,分析不同類型IIM及NIM中MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ的表達差異,為將MHC-Ⅱ聯(lián)合MHC-Ⅰ免疫組化染色納入IIM診斷的常規(guī)實驗室檢查項目提供參考。

1 資料與方法

1.1臨床資料及標本收集 收集2010年3月至2018年4月在首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科經(jīng)肌肉活檢保存的標本29份,并通過醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集標本來源患者的臨床資料。根據(jù)目前公認的IIM診斷和分類標準[1,3,9],挑選4種最有代表性的IIM(DM 5例,PM 5例,IBM 4例及NAM 5例)和2種NIM[肌營養(yǎng)不良(muscular dystrophy,MD)5例,dysferlinopathy肌病5例]。所有患者在入院時均簽署肌肉活檢知情同意書。本研究獲得首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院倫理委員會批準(批號：臨研審【2023】018號)。

1.2納入與排除標準 納入標準：(1)年齡13～80歲,性別不限;(2)IIM病例符合2004年國際疾病協(xié)作組提出的IIM診斷及分類標準[8];(3)NIM病例根據(jù)臨床病理檢查或基因檢查確診為MD或dysferlinopathy肌病。排除標準：合并硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等其他風濕病。

1.3檢查方法

1.3.1 標本處理 患者活檢標本組織經(jīng)異戊烷預(yù)冷,液氮中冷凍固定,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色 肌肉標本在-20 ℃冰凍切片機中切片,厚度8 μm,切片晾干后進行HE染色。切片在蘇木素染色液(北京益利精細化學品有限公司)中浸染2 min后以流水沖洗10 min。伊紅染色液(北京益利精細化學品有限公司)浸染1 min后以流水沖洗30 s。依次用75%、85%、95%及100%乙醇進行脫水處理。二甲苯透明化處理2次,5 min/次,中性樹膠封片。

1.3.3 免疫組化染色 標本切片厚度6 μm,使用MHC-Ⅰ(Abcam)、MHC-Ⅱ(Abcam)、dysferlin(Abcam)三種抗體進行免疫組化染色,另設(shè)置正常對照。切片以無水乙醇在4 ℃下固定過夜,流水沖洗1 min,磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.3)清洗5 min。將MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及dysferlin抗體用抗體稀釋液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)按1∶200稀釋后滴加在標本上,4 ℃孵育過夜,用磷酸緩沖鹽溶液清洗3次,5 min/次。予通用型小鼠/兔IgG聚合物二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫孵育30 min,磷酸緩沖鹽溶液清洗3次,5 min/次。予DAB(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色處理30 s,蘇木素復染2 min,用流水清洗10 min后予75%、85%、95%及100%乙醇依次脫水處理5 min,二甲苯透明化處理2次,5 min/次,中性樹膠封片。MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ染色抗體陽性表達時肌纖維膜及炎性細胞浸潤區(qū)域均可染成深棕色,抗體陰性時肌纖維沒有特異性的著色。染色結(jié)果按照以下標準進行半定量評判[10]：(1)只有內(nèi)皮細胞深染,記為“-”。(2)1%～10%深染的肌纖維,記為“+”。(3)11%～25%深染的肌纖維,記為“++”。(4)26%～50%深染的肌纖維,記為“+++”。(5)51%～100%深染的肌纖維,記為“++++”。在本研究中,免疫組化染色讀片結(jié)果出現(xiàn)“+”“++”“+++”或“++++”時判定為陽性表達。

2 結(jié)果

2.129例患者的臨床資料 19例IIM患者包括DM 5例,PM 5例,IBM 4例及NAM 5例,其中以四肢無力起病18例,以吞咽困難、言語不清起病1例。10例NIM患者包括MD 5例,dysferlinopathy肌病5例,其中以四肢無力起病9例,以行走不穩(wěn)起病1例。在接受肌酸激酶檢查16例IIM患者中有15例肌酸激酶水平異常升高,接受肌酸激酶檢查的7例NIM患者肌酸激酶水平均異常升高。在行肌電圖檢查的15例IIM患者中有10例提示肌源性損害,行肌電圖檢查的7例NIM患者均提示肌源性損害,見表1。

表1 29例患者的臨床資料

2.2IIM及NIM患者肌肉標本HE染色結(jié)果 IIM患者肌纖維可出現(xiàn)不同程度變性、壞死、再生,結(jié)締組織有輕度至中度增生(見圖1?～圖1?),多數(shù)患者可見肌內(nèi)膜、肌周膜和血管周圍炎性細胞浸潤(見圖1?、圖1?)。NIM部分患者肌纖維也可出現(xiàn)變性、壞死及再生(見圖1?、圖1?),但炎性細胞浸潤較少。本研究19例IIM患者出現(xiàn)肌纖維變性、壞死18例(94.7%),肌纖維再生13例(68.4%),炎性細胞浸潤13例(68.4%)。10例NIM患者出現(xiàn)肌纖維變性、壞死9例(90.0%),肌纖維再生5例(50.0%),炎性細胞浸潤2例(20.0%),見表2。

?～?為IIM患者肌肉標本HE染色結(jié)果。?PM患者,肌纖維變性、壞死和再生,肌內(nèi)衣可見炎性細胞大量浸潤,可見炎性細胞侵入非壞死肌纖維;?DM患者,個別肌纖維變性,肌纖維大小不等,萎縮的肌纖維呈圓形,呈束周萎縮;?IBM患者,肌纖維變性、壞死和再生,結(jié)締組織增生,肌束衣及肌內(nèi)衣偶見灶樣炎性細胞浸潤;?NAM患者,偶見變性、壞死和再生肌纖維。?、?為NIM患者肌肉標本HE染色結(jié)果。?dysferlinopathy肌病患者,肌纖維大小不等,可見較多變性、壞死吞噬和再生肌纖維;?MD患者,肌纖維大小不等,偶見變性、壞死和再生肌纖維,部分肌纖維內(nèi)可見鑲邊空泡。

表2 IIM及NIM患者肌肉標本病理染色結(jié)果(n)

2.3 IIM及NIM患者肌肉標本免疫組化染色結(jié)果

PM患者MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ均在肌纖維膜及炎性細胞浸潤區(qū)域陽性表達,見圖2?、圖2?。DM患者MHC-Ⅰ在肌纖維膜及束周部分陽性表達(見圖2?),MHC-Ⅱ為陰性表達(見圖2?)。IBM患者MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ均在肌纖維膜及炎性細胞浸潤區(qū)域陽性表達,見圖2?、圖2?。NAM患者MHC-Ⅰ在肌纖維膜及束周部分陽性表達(見圖),MHC-Ⅱ為陰性表達(見圖)。dysferlinopathy肌病患者MHC-Ⅰ在肌纖維膜及束周部分陽性表達(見圖3?),MHC-Ⅱ為陰性表達(見圖3?)。MD患者MHC-Ⅰ在肌纖維膜陽性表達(見圖3?),MHC-Ⅱ為陰性表達(見圖3?)。IIM患者MHC-Ⅰ染色陽性率為94.7%(18/19),MHC-Ⅱ染色陽性率為21.1%(4/19);NIM患者MHC-Ⅰ染色陽性率為50.0%(5/10),MHC-Ⅱ染色陽性率為0.0%(0/10),見表2。

?～?為PM患者肌肉標本病理染色所見。?HE染色可見肌纖維變性、壞死和再生,肌內(nèi)衣可見多處大量炎性細胞灶樣浸潤;?MHC-Ⅰ在肌纖維膜及炎性細胞浸潤區(qū)域陽性表達(++++);?MHC-Ⅱ在肌纖維膜及炎性細胞浸潤區(qū)域陽性表達(+++)。?～?為DM患者肌肉標本病理染色所見。?HE染色可見肌束內(nèi)肌纖維大小不等,萎縮的肌纖維呈圓形,束周萎縮,個別肌纖維變性,未見壞死及再生;?MHC-Ⅰ在肌纖維膜及束周部分陽性表達(+++);?MHC-Ⅱ為陰性表達(-)。?～?為IBM患者肌肉標本病理染色所見。?HE染色見肌纖維變性、壞死和再生,肌內(nèi)衣可見炎性細胞浸潤;?MHC-Ⅰ在肌纖維膜及炎性細胞浸潤區(qū)域陽性表達(+);?MHC-Ⅱ在肌纖維膜及炎性細胞浸潤區(qū)域陽性表達(++)。?為NAM患者肌肉標本病理染色所見。?HE染色可見肌纖維變性、壞死和再生,肌束衣和肌內(nèi)衣有炎性細胞浸潤;MHC-Ⅰ在肌纖維膜及束周部分陽性表達(++);MHC-Ⅱ為陰性表達(-)。?、?、?、?放大倍數(shù)為×200,其余為×100。

?～?為dysferlinopathy肌病患者肌肉標本病理染色所見。?HE染色可見肌纖維大小不等,變性、壞死和再生,可見肌分裂、核內(nèi)移及炎性細胞浸潤;?MHC-Ⅰ在肌纖維膜及束周部分陽性表達(++);?MHC-Ⅱ為陰性表達(-)。?～?為MD患者肌肉標本病理染色所見。?HE染色可見變性、壞死和再生肌纖維,未見炎性細胞浸潤;?MHC-Ⅰ在肌纖維膜陽性表達(+++);?MHC-Ⅱ為陰性表達(-)。

3 討論

3.1IIM是一種可治性肌病,常與惡性腫瘤伴發(fā)。不同類型IIM與MD的臨床表現(xiàn)不具有特異性,肌活檢結(jié)果在IIM各組型中常有重疊,且伴有炎癥的MD在肌活檢時也有相似的形態(tài)學改變,很難與IIM區(qū)分,這在一定程度上干擾了IIM的臨床診斷和治療[10-13]。因此,尋找高特異度、高靈敏度的IIM診斷指標成為目前研究的熱點。

3.2目前,國內(nèi)外對MHC-Ⅰ在IIM中的表達研究較多[9,13-14],但關(guān)于MHC-Ⅱ在IIM中的研究較少。MHC-Ⅱ同樣參與了T細胞活化及其介導的免疫反應(yīng)過程,只是通路途徑與MHC-Ⅰ有區(qū)別。MHC-Ⅰ能抑制自然殺傷(natural killer,NK)細胞和細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)的效應(yīng)功能,具有免疫調(diào)節(jié)作用;MHC-Ⅱ提呈外源性抗原給輔助T細胞,使T細胞激活和分化,在誘導免疫應(yīng)答中也起重要作用[15-16]。正常成年人的肌細胞膜MHC-Ⅰ表達水平較低,而在IIM患者上調(diào)表達,但差異未能顯示出統(tǒng)計學意義[15]。本研究中,PM、DM、IBM及NAM患者的MHC-Ⅰ陽性率均在80.0%以上,而dysferlinopathy肌病患者的MHC-Ⅰ陽性率為20.0%。PM、IBM患者的MHC-Ⅱ陽性率分別為40.0%、50.0%,NIM患者MHC-Ⅱ呈陰性表達,這與相關(guān)研究結(jié)果相似[14,17],提示MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ在IIM和NIM患者間的表達均存在差異。

3.3MHC的表達與炎性細胞浸潤無關(guān)[9],在局灶性炎癥性肌病和廣泛性炎癥性肌病的肌纖維,均可在炎性細胞存在或缺失的情況下表達MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ抗原,提示MHC可能在IIM的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定的作用,而不僅僅是局部炎癥引起的表現(xiàn)[9,18-19]。本研究結(jié)果顯示,在沒有炎癥浸潤的情況下也可出現(xiàn)MHC-Ⅰ陽性表達,19例IIM組患者中,13例有炎性細胞浸潤,18例MHC-Ⅰ陽性;10例NIM患者中,2例有炎性細胞浸潤,5例MHC-Ⅰ陽性。兩組MHC-Ⅰ陽性率均較炎性細胞浸潤率高。而在炎性細胞浸潤的病例中,MHC-Ⅱ也可是陰性。5例DM中有炎性細胞浸潤4例,MHC-Ⅱ陽性0例;5例NAM中有炎性細胞浸潤1例,MHC-Ⅱ陽性0例。這提示MHC-Ⅱ的表達除了與炎癥相關(guān),可能與結(jié)締組織增生等肌纖維病理改變的程度有關(guān)[15]。

3.4MHC-Ⅰ過度表達可出現(xiàn)在所有類型的炎性肌病中,敏感性高,但也可出現(xiàn)在其他NIM和神經(jīng)源性肌病中,對于IIM的診斷特異性不佳[14]。MHC-Ⅱ僅在MHC-Ⅰ陽性時少量表達,在IIM不同類型中表達有差異,特別是在IBM中表達率高[20],這對IBM的早期診斷有參考意義。Aouizerate等[21]研究顯示,MHC-Ⅱ在IBM患者中的陽性率高達100.0%。本研究中IBM患者的MHC-Ⅱ陽性率為50.0%,在PM患者為40.0%,其余類型患者均未見陽性表達,提示MHC-Ⅱ檢測對IBM及PM的診斷有參考價值。

3.5通過本研究我們看到IIM組及NIM組肌肉活檢均可出現(xiàn)肌纖維變性、壞死和再生以及炎性細胞浸潤的病理表現(xiàn),僅依靠病理染色很難對不同類型的肌病進行辨別。但在臨床上,識別IIM的類型非常重要,不是所有的IIM均對激素敏感,如IBM的臨床表現(xiàn)缺乏特異性,常被誤診為PM、DM或進行性DM。糖皮質(zhì)激素與免疫抑制劑治療對IBM療效不明顯,需大劑量靜脈注射免疫球蛋白以改善肌病癥狀。在NIM中MHC-Ⅱ低表達或不表達,這對于某些NIM的鑒別診斷有實際意義,如dysferlinopathy肌病在臨床上容易被誤診為PM、NAM,延誤治療。在本研究中,dysferlinopathy肌病患者的MHC-Ⅱ染色均呈陰性表達,提示MHC-Ⅱ染色可能對dysferlinopathy肌病的早期診斷治療提供幫助。

綜上所述,本研究結(jié)果提示MHC可能為IIM發(fā)病及病理維持的潛在因素,MHC-Ⅱ聯(lián)合MHC-Ⅰ免疫組化染色對IIM的診斷及類型鑒別有較好的臨床應(yīng)用價值,有助于及時診斷和治療,改善患者預(yù)后。