賽麗麥·穆門

摘要：牛白血病是由C型、致瘤病毒群、反轉(zhuǎn)錄病毒科、丁型反轉(zhuǎn)錄病毒屬的牛白血病病毒導(dǎo)致的一種可發(fā)生于瘤牛、水牛、普通牛中的疾病，全世界范圍內(nèi)均可發(fā)生此病?；疾『笈Ｖ坏纳a(chǎn)性能下降，給廣大養(yǎng)殖戶帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此準(zhǔn)確掌握其診斷技術(shù)及治療方案至關(guān)重要。本文綜述了在分子層面診斷牛白血病的方法以及在基因?qū)用孢M(jìn)行治療的方案，以期廣大養(yǎng)殖戶能夠利用先進(jìn)的技術(shù)減少此病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：牛；白血??；分子診斷；基因治療

牛白血病作為一種全世界均流行的、經(jīng)常發(fā)生于各種牛中的慢性、致死性、腫瘤性疾病，其產(chǎn)生的危害極大，奶牛感染之后造成產(chǎn)奶量的下降，肉牛感染之后造成體重的減輕、生長(zhǎng)性能的下降。感染此病的牛只的皺胃、右心耳、腸、子宮、腎臟、肺臟、肝臟等均受到侵害，隨著病情的發(fā)展最終導(dǎo)致牛只免疫功能下降、免疫應(yīng)答受損，患其他疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。牛白血病的傳染源主要為感染牛白血病的動(dòng)物，此病可以通過垂直（血液、胎盤、乳汁）或者水平傳播方式（血液、滲出物、組織的混合物）進(jìn)行傳播，還可以通過昆蟲的叮咬（蠅等）進(jìn)行水平傳播。到目前為止，此病仍在世界范圍內(nèi)（波蘭、烏克蘭、澳大利亞、巴西）廣泛分布。我國自1978年首次報(bào)道此病之后，截止到2016年，通過對(duì)6個(gè)省份的奶牛、15個(gè)省份的肉牛進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)牛白血病在奶牛個(gè)體、肉牛個(gè)體中的陽性率分別為49.1%、1.6%，說明此病在我國養(yǎng)牛場(chǎng)尤其是奶牛場(chǎng)中普遍存在。因此，掌握先進(jìn)、科學(xué)、準(zhǔn)確的分子診斷方式是判斷此病的基礎(chǔ)，而熟悉此病的基因治療方案至關(guān)重要[1]。

1 患病機(jī)理

當(dāng)牛只感染牛白血病病毒后會(huì)通過影響牛只外周循環(huán)而導(dǎo)致患病，患病牛只頜下淋巴結(jié)、腹股淋巴結(jié)等多處體表淋巴結(jié)發(fā)生炎癥，隨著淋巴細(xì)胞的不斷惡性浸潤(rùn)和增生，導(dǎo)致其血液系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)受到嚴(yán)重的損傷，接著骨髓組織、內(nèi)皮系統(tǒng)等也發(fā)生病變，隨著病毒入侵的蔓延導(dǎo)致胃腸道系統(tǒng)也出現(xiàn)病變，表現(xiàn)為因食道無法擴(kuò)張而出現(xiàn)吞咽、采食困難等癥狀，最終衰竭而亡[2]。從分子層面解釋為：當(dāng)牛只感染牛白血病病毒后其病毒的基因會(huì)整合在牛只的染色體中，導(dǎo)致牛只終身帶毒。在牛只體內(nèi)反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，牛白血病病毒合成一條DNA分子鏈以用于與病毒的RNA進(jìn)行雜交，在DNA聚合酶的作用下形成具有雙股的DNA并進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，以整合到牛只染色體中，形成DNA前病毒；然后在RNA聚合酶的作用下，完成復(fù)制RNA病毒的核酸，并翻譯成病毒的外殼、反轉(zhuǎn)錄酶，以出芽生殖的方式將組裝成的病毒擴(kuò)散到其他細(xì)胞中。此病毒攻擊的主要是牛只的B淋巴細(xì)胞，然后經(jīng)過各種途徑之后造成其他細(xì)胞的感染，最終導(dǎo)致牛只的死亡[3]。

2 分子診斷

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，分子生物學(xué)檢測(cè)牛白血病的方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)勢(shì)，且由于牛白血病病毒的基因可以整合到牛只細(xì)胞基因組中，其他方式幾乎無法檢測(cè)到牛白血病病毒基因組，故在檢測(cè)牛白血病病毒時(shí)分子生物學(xué)檢測(cè)逐漸取代了傳統(tǒng)的血液學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、酶聯(lián)免疫吸附等方式，使從牛只的新鮮腫瘤或者外周血單核細(xì)胞樣本中檢測(cè)到牛白血病病毒的基因組成為可能。在診斷牛白血病病毒時(shí)常見的分子生物學(xué)技術(shù)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（FRET-qPCR）等。

2.1 PCR技術(shù)

此技術(shù)是最普通的PCR檢測(cè)方式，也是最先被使用來進(jìn)行牛白血病病毒檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)，具有加速檢測(cè)流程、敏感性、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。此技術(shù)主要是對(duì)牛白血病病毒的前病毒DNA進(jìn)行檢測(cè)。具體操作流程如下：采集或者使用在-80 ℃冰箱保存的牛只全血樣本；根據(jù)NCBI網(wǎng)站查找已經(jīng)報(bào)道過的關(guān)于牛白血病病毒的基因序列，并利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性的引物（即引物設(shè)計(jì)）；用已知陽性牛只的血液樣本和購買的DNA病毒提取試劑盒將樣本中病毒的DNA提取出來，并根據(jù)提出的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所使用的試驗(yàn)條件為在95 ℃下預(yù)變性5 min。進(jìn)入循環(huán)：在95 ℃條件下變性45 s，56 ℃條件下退火35 s，72 ℃條件下延伸30 s，一共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；之后在72 ℃條件下延伸10 min，結(jié)束之后觀察電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在牛白血病病毒陽性的樣品中擴(kuò)增出了大小為194 bp的目的片段，故說明使用前病毒DNA樣本的PCR技術(shù)能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出牛白血病病毒[4]。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)

此診斷技術(shù)能夠彌補(bǔ)由于酶聯(lián)免疫吸附或者其他檢測(cè)方式由于牛白血病病毒相關(guān)抗體、抗原含量低而導(dǎo)致陰性的結(jié)果，檢測(cè)陽性樣本時(shí)僅需3個(gè)拷貝數(shù)。具體操作如下：首先要找到牛白血病病毒的基因序列，推薦使用的是Gen Bank數(shù)據(jù)庫；然后進(jìn)行篩選，從基因庫中選出高度保守的區(qū)域，并選擇出具有特異性的基因序列，通過使用FAM熒光、MGB標(biāo)記的方式對(duì)上下游進(jìn)行標(biāo)記以此來設(shè)計(jì)探針引物；接著使用實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)來確定標(biāo)準(zhǔn)曲線（即Ct值與濃度之間的線性關(guān)系）；最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增出關(guān)于牛白血病病毒長(zhǎng)度為79 bp的特異性片段[2]。

2.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移PCR技術(shù)

此技術(shù)具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、不擴(kuò)增其他牛常見病原體的優(yōu)勢(shì)，且可以檢測(cè)牛只血液、陰道分泌物、牛奶、糞便中的牛白血病病毒，但是檢出率最高的是檢測(cè)血液中的病毒。具體操作如下：設(shè)計(jì)并合成FRET-qPCR引物和探針，通過利用GenBank數(shù)據(jù)庫和利用Clustal multiple alignment algorithm軟件分別找到牛白血病病毒的全基因序列和其中的保守區(qū)域以此來設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針；制備陽性對(duì)照，即是根據(jù)牛白血病病毒中的pol基因中的目的片段合成質(zhì)粒并在大腸桿菌中表達(dá)；通過使用Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行線性化；根據(jù)PicoGreen算法對(duì)已經(jīng)線性化的質(zhì)粒中的雙鏈DNA進(jìn)行定量和稀釋并獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算樣品濃度；建立FRET-qPCR反應(yīng)所需的條件；最后根據(jù)FRET-qPCR擴(kuò)增曲線和高分辨率溶解曲線對(duì)得到的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判斷（Ct值＜30時(shí)且此時(shí)得到的Tm值在60～62 ℃之間則判定為陽性）。使用此方法得到的奶牛血液中的陽性率最高，為75.2%；陰道分泌物的陽性率次之，為49.5%；牛奶中的陽性率為46.7%；糞便中的陽性率最差為7.6%。且若血液中檢測(cè)結(jié)果為陰性的牛只，同一頭牛其他三個(gè)部位的樣品檢測(cè)結(jié)果也為陰性[5]。

3 基因治療

目前尚未研發(fā)出治療牛白血病的特效藥，因此常用基因治療的方式來治療種用價(jià)值或者其他價(jià)值較高的牛只，對(duì)于一般牛只若患有白血病之后則采用淘汰的方式進(jìn)行處理。基因治療是將外源正常的基因?qū)氲脚Ｖ话屑?xì)胞以達(dá)到糾正或者補(bǔ)償缺陷基因、異?；虻哪康模瑥亩鴮?shí)現(xiàn)對(duì)牛只的治愈。在治療牛只白血病時(shí)常用的基因治療技術(shù)包括RNA干擾技術(shù)。

RNA干擾技術(shù)的原理是在牛只細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)某段序列同源的雙鏈RNA從而使內(nèi)源性的mRNA發(fā)生降解，最終達(dá)到使牛白血病基因沉默的目的。此技術(shù)具有特異性強(qiáng)（只引起特定基因的降解而不會(huì)引起其他基因的沉默）、效率高（在治療過程中只需少量的同源的雙鏈RNA即可有效抑制靶基因的表達(dá)，且進(jìn)行方式是催化放大）、可進(jìn)行傳播（即可以在細(xì)胞群落之間進(jìn)行傳播，注射到某個(gè)部位之后進(jìn)而傳播到整個(gè)機(jī)體）、穩(wěn)定性高（雙鏈的RNA性質(zhì)穩(wěn)定，不需要進(jìn)行修飾）、遺傳性好（當(dāng)在父母代中注射雙鏈RNA后，其子一代中也存在同樣基因抑制的現(xiàn)象）等優(yōu)勢(shì)。

4 預(yù)防措施

對(duì)于牛白血病常見的預(yù)防措施包括定期檢疫、定期驅(qū)蟲、嚴(yán)格引種等。

4.1 定期檢疫

由于此病的潛伏期較長(zhǎng)，且對(duì)于患病的牛只尚無特效藥進(jìn)行救治，因此做好定期檢疫是預(yù)防此病發(fā)生的重要措施之一。當(dāng)牛只患白血病之后，其最典型的特征就是血液中的淋巴細(xì)胞數(shù)量增多明顯，因此，可以通過定期對(duì)全群的牛只以全檢或者抽檢的方式來檢測(cè)血象變化，當(dāng)牛只血液中白細(xì)胞超過70%的增量且發(fā)生異常增生時(shí)即可確診為白血病。而定期檢疫的時(shí)間一般為2～3個(gè)月；對(duì)于檢疫結(jié)果為陽性的妊娠母牛，其所產(chǎn)犢牛應(yīng)該單獨(dú)隔離飼養(yǎng)至6月齡以上。對(duì)于確診的牛只要及時(shí)進(jìn)行淘汰和撲殺，以此來慢慢實(shí)現(xiàn)對(duì)牛群的凈化[6]。

4.2 定期驅(qū)蟲

由于牛白血病可以通過吸血昆蟲、蚊蠅等進(jìn)行機(jī)械性的傳播，因此牛群驅(qū)蟲工作實(shí)施的好壞直接決定了牛群的發(fā)病率。對(duì)于寄生在牛只體表（螨蟲、蜱蟲等）或者體內(nèi)（線蟲、絳蟲、吸蟲）的寄生蟲，可以通過定期藥浴、飼喂驅(qū)蟲藥物（芬苯達(dá)唑伊維菌素片）的方式來驅(qū)蟲，一般藥浴選擇在天氣晴朗、溫度適宜的夏秋進(jìn)行；飼喂藥物一般選擇在早晨飼喂之前空腹灌服驅(qū)蟲藥以保證驅(qū)蟲的效果。對(duì)于圈舍內(nèi)蚊蠅，尤其是炎熱多雨夏季更適合蚊蠅的滋生，此時(shí)需要每日打掃牛只排泄的糞便，并每周進(jìn)行滅蠅，保證圈舍的清潔、干燥，破壞適合蚊蠅生存的環(huán)境。另外，也要及時(shí)處理圈舍周邊的雜草等，避免蚊蠅滋生。

4.3 嚴(yán)格引種

養(yǎng)殖場(chǎng)盡量堅(jiān)持自繁自養(yǎng)的基本原則，減少從其他地區(qū)引入牛只或者使用精液。確需引種時(shí)，則需要對(duì)新引入的牛只進(jìn)行單獨(dú)的隔離飼養(yǎng)，并在隔離期間多次進(jìn)行牛白血病抗體的檢測(cè)以及血液中淋巴細(xì)胞的檢測(cè)，隔離期滿后確認(rèn)未攜帶牛白血病病毒后再與原群進(jìn)行混養(yǎng)。

5 小結(jié)

由于牛白血病是我國乃至世界范圍內(nèi)危害比較嚴(yán)重的疾病之一，因此為了促進(jìn)我國養(yǎng)牛業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，保證養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，必須掌握牛白血病的分子診斷方式，發(fā)現(xiàn)有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的牛只患病后及時(shí)采取有效的基因治療方案，并通過定期檢疫、定期驅(qū)蟲以及嚴(yán)格引種等措施最大限度地降低此病的發(fā)生率。

參考文獻(xiàn)：

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[3] 王瑞林.牛地方性白血病的診斷和預(yù)防[J].中國動(dòng)物保健，2023，25（4）：48-49.

[4] 宮洪杰.牛白血病病毒的鑒定及防控[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2022，41（4）：19-20.

[5] 楊奕.牛白血病病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及其致病性的研究[D].揚(yáng)州大學(xué)，2018.

[6] 紅華.牛白血病的診斷與防治[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2021（1）：32.