王一凡, 呂厚星, 李志陽, 代云莉, 馮昭衛(wèi), 陳佳佳, 陳圣杰, 王建塔, 肖 瑛*

(1)貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室,貴州醫(yī)科大學病理生理學教研室, 貴陽 550025;2)貴州省化學合成藥物研發(fā)利用工程技術研究中心, 貴陽 550004)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種除酒精和其他明確肝損害因素外所導致的以肝脂肪過量聚集,并伴隨胰島素抵抗為特征的疾病,可進展為代謝相關脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)和肝纖維化甚至癌變[1]。全球約25%的成人受到NAFLD的影響[2]。對于NAFLD,被廣泛認同的發(fā)病機制假說是“二次打擊學說”:即胰島素抵抗導致肝的脂肪過量聚集從而引起肝脂肪變性,成為發(fā)病時的第一次打擊,隨后而來的炎癥、纖維化、壞死、氧化應激等則被認為是第二次打擊[3]。NAFLD的發(fā)展和肝脂質(zhì)含量密切相關,在NAFLD患者中肝脂肪變性程度越重,其肝纖維化的程度越嚴重[4]。上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉分化(epithelial-mesenchumaltransition, EMT)在多種組織纖維化中都發(fā)揮重要作用,其主要特征是上皮細胞失去極性,同時表型發(fā)生改變,獲得間質(zhì)表型等[5],其在肝纖維化中也扮演了重要的角色[6]。NAFLD的主要治療形式是控制生活方式的改變,如飲食和運動,然而藥物治療是十分重要的,因為多數(shù)患者的依從性不佳,無法達到相應的減重目標。最近研究提示,在2型糖尿病的情況下,對抗糖尿病藥物的選擇可能會促進肝內(nèi)脂肪的減少,抑制纖維化的進展有直接或間接的優(yōu)勢[7]。因此,減少肝內(nèi)的脂肪積累,延緩EMT過程阻止NAFLD向纖維化的發(fā)展是治療的關鍵。

樹豆酮酸A(cajanonic acid A, CAA)是源于樹豆的提取物,是一種具有全新結構的芪類衍生物,可以通過抑制過氧化物酶增殖物激活受體γ(perpxisome proliferation activated rceptor gamma, PPARγ)和CCAAT/增強子結合蛋白α(CCAAT enhancer blinding protein alpha, C/EBPα)的表達有效減少激素誘導的脂質(zhì)堆積,抑制小鼠的體重增長、降低空腹血糖以及改善高脂血癥所帶來的器官損害[8-13]。

E2F轉錄因子1(E2F transcription factor 1, E2F1)是細胞周期相關轉錄因子E2F家族成員之一。E2F家族可分為3大類:基因轉錄的激活物(E2F1-E2F3a)、轉錄阻遏物(E2F3b-E2F5)和轉錄抑制劑(E2F6-E2F8)[14]。目前,對于E2F家族的研究多集中于與各類腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關系,涉及的器官部位很廣泛,包括肝、乳腺、肺、膀胱、前列腺、皮膚和胰腺等,相關研究認為,E2F在癌癥中是EMT的信號[15-17]并且E2F1可調(diào)節(jié)糖酵解和通過PPARγ刺激脂肪的合成。在不同的NAFLD小鼠模型中,E2F1的缺失完全消除肝脂肪變性[18-19]。因此,E2F1可能參與NAFLD脂質(zhì)沉積的過程,并且是CAA改善NAFLD的一個潛在作用靶點,E2F轉錄因子7(E2F transcription factor 7, E2F7)作為一種主要的轉錄抑制劑,其可抑制E2F1的表達[20]。近年的研究發(fā)現(xiàn),E2F7可以抑制腎小管中EMT的發(fā)生發(fā)展[21]。綜上所述,現(xiàn)通過db/db自發(fā)性非酒精性脂肪性肝病小鼠模型,旨在探究CAA對NAFLD的保護作用,同時為尋找治療有效靶點提供一定的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物來源 清潔級健康雄性6周齡C57BL小鼠6只及6周齡db/db小鼠12只,品系名稱為BKS. Cg - m + / + Leprdb/J(db/ + ),基因型為Leprdb/J(db/db),購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 CAA由貴州醫(yī)科大學藥物化學重點實驗室提供(自制)。血糖、甘油三酯、總膽固醇測定試劑盒(南京建成公司);谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)及谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)組織上清液測定試劑盒(南京建成公司);免疫組織化學SP兩步法檢測試劑(中杉金橋生物公司);E2F1和E2F7引物(上海生物工程公司);ELISA測定試劑盒(Elabscience);兔抗鈣黏著蛋白(E-cadherin, E-ca)(Proteintech);兔抗纖維連接蛋白(fibronectin, FN)(Abcam);兔抗E2F1(Abcam);兔抗E2F7(Abcam);兔抗α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)(武漢三鷹);抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自武漢普美克技術有限公司。M5 Universal RNA Mini Kit組織/細胞RNA快速提取試劑盒(北京聚合美生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.2 生化指標檢測 所有小鼠處死前空腹4～6 h,戊巴比妥鈉麻醉后眼球取血,離心(4 ℃、4 000 r/min)取血清,置于冰箱保存(-20 ℃)。根據(jù)葡萄糖氧化酶法、COD-PAP法、GPO-PAP酶法分別測血糖、總膽固醇、甘油三酯指標。將新鮮肝組織用無菌生理鹽水研磨后離心(2 500 r/min)10 min,取得組織上清,按照試劑盒說明書操作,采用微板法測AST和ALT。

1.2.3 HE染色和天狼星紅染色觀察肝組織病理變化和膠原沉積 小鼠處死后用4%多聚甲醛立即固定部分肝組織72 h,然后制備石蠟切片(約4 μm);石蠟切片于烤箱中烤片后下行入水,再依次放入二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水,進行HE染色和天狼星紅染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,顯微鏡下觀察并拍片,利用Fuji Image軟件進行圖像分析。

1.2.4 油紅O染色觀察肝組織脂肪沉積 從-80 ℃冰箱取出肝組織制備冰凍切片(約7 μm),切片靜置在室溫15 min,然后進入PBS洗滌3次,每次5 min,4%多聚甲醛固定10 min再用PBS洗滌3次,每次5 min,然后依次放入60%異丙醇和油紅O染液中各10 min(染液根據(jù)說明書操作稀釋);60%異丙醇洗1次,直至背景干凈,蘇木精染液染色5 min,PBS洗1次,甘油封片,顯微鏡下觀察并拍照,利用Fuji Image軟件進行圖像分析。

1.2.5 免疫組織化學法觀察肝組織E2F1和E2F7的表達部位 4 μm石蠟切片于烤箱65 ℃烘1 h溶蠟,切片脫蠟至水。清水洗滌(3 min),洗滌后行微波抗原修復,滅活內(nèi)源性過氧化物酶,滴加稀釋的E2F1、E2F7一抗(抗體濃度為1∶200,以1∶50用3%牛血清蛋白稀釋),4 ℃孵育過夜,次日PBS洗滌,加入相應二抗,室溫孵育20 min,PBS洗滌后用DAB染色。蘇木素染液復染,自來水終止反應,然后上行脫水、透明和封片,光鏡下觀察并拍照。

1.2.6 Western印跡檢測肝組織E2F1、E2F7、Fibronectin、E-cadherin、α-SMA蛋白質(zhì)水平 -80 ℃取出肝組織0.1 g,研磨后取上清。按BCA試劑盒說明書操作檢測濃度,按比例加入5×的上樣緩沖液,煮沸后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳跑膠分離,300 mA電流轉移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,TBST洗膜后分別加E2F1(1∶1 000)、E2F7(1∶ 800)、E-cadherin(1∶5 000)、Fibronectin(1∶1 000)、α-SMA(1∶8 000)抗體4 ℃冰箱搖床孵育過夜,PBS洗滌后加入相應的2抗(1∶8 000)室溫孵育1 h,Smart-ECL試劑顯影曝光,Tanon凝膠成像,目的條帶用Image J圖像分析軟件處理并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測肝組織E2F1、E2F7 mRNA水平 從-80 ℃取出肝組織,稱取0.025 g組織采用組織RNA快速提取試劑盒提取總RNA,并測定提取的總RNA的濃度;然后再取總RNA進行逆轉錄,合成cDNA,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板進行E2F1、E2F7、β-肌動蛋白的擴增。PCR反應體系為20 μL,其中2×Talent qPCR PreMix 10 μL,上下游引物各1 μL,cDNA 2 μL,RNase-Free ddH2O 6 μL。擴增程序為95 ℃預變性15 min,95 ℃變性10 s,分別以53 ℃、55.3 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán);E2F1正向引物為5′-GAGAAGTCACGCTATGAAACCTC-3′,反向引物為5′-CCCAGTTCAGGTCAACGACAC-3′;E2F7正向引物為5′-CCGAGTGTGTGCAAAAGA-3′,反向引物為5′-TCCAGGGAATAGGCTGAC-3′;β-肌動蛋白正向引物為5′-CCTCACTGTCCACCTTCC-3′,反向引物為5′-GGGTGTAAAACGCAGCTC-3′。以β-肌動蛋白為內(nèi)參照,E2F1和E2F7的相對表達量以2-ΔΔCt表示并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.8 酶聯(lián)免疫吸附法(ELASA)檢測肝組織上清液炎癥因子白細胞介素1β(interlecukin-1β, IL-1β)含量 肝組織上清液按照ELISA試劑盒說明書詳細操作,檢測炎癥因子IL-1β含量。按BCA試劑盒說明書操作檢測上清中蛋白質(zhì)濃度。IL-1β與組織上清中蛋白質(zhì)濃度之比為有意義值。

2 結果

2.1 小鼠生化指標檢測結果表明db/db小鼠存在肝損傷及脂代謝異常

db/db小鼠12只與同期C57BL小鼠6只,db/db小鼠分為NAFLD組和CAA組,在自由飲食和飲水的條件下,CAA組給予溶于0.5%羧甲基纖維素鈉的CAA 50 mg/(kg·d)灌胃給藥,NC組和NAFLD組均予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃,與NC組相比,NAFLD組小鼠血糖、甘油三酯和總膽固醇明顯升高(P<0.05),表明db/db小鼠出現(xiàn)糖尿病典型臨床表現(xiàn)以及脂肪代謝異常,CAA治療后,血糖、甘油三酯、總膽固醇水平較NAFLD組均有所降低,但未降至正常值(P<0.05),提示CAA可以改善血糖血脂水平(Fig.1A、1B、1C)。肝組織上清液中ALT、AST檢測結果顯示,NAFLD組ALT、AST表達量較NC組明顯升高(P<0.05),提示NAFLD組存在肝損傷,給予CAA治療后,血清中ALT、AST水平顯著降低(P<0.05),表明CAA有降低血脂和改善肝功能的作用(Fig.1D)。

遲恒只能拋開半信半疑，他一個小記者操不上紀檢、也可能是審計部們那分心。遲恒抽煙抽續(xù)火，掏煙出來也只剩一根，他遞給魏，再掏出5元的“黃果樹”擱桌上，二只彰顯尊貴的煙盒已空無一物，剩下兩盒寒酸地擺在一起，魏昌龍看出點意思。

Fig.1 The levels of glucose, triglyceride and total cholesterol in the serum and the levels of ALT and AST in the supernatant of liver tissues in the mice of different groups

2.2 樹豆酮酸A處理可改善小鼠肝組織形態(tài)及緩解肝的脂肪堆積

光鏡下HE染色結果顯示:NC組胞漿紅染均勻,可見完整的肝細胞及細胞核,肝板走形整齊,未見空泡樣病變;NAFLD組可見由脂肪堆積所引起的的空泡樣變,彌漫性分布,胞漿疏松化,肝小葉破壞嚴重;CAA處理后肝細胞胞核較完整,胞質(zhì)清晰,肝細胞脂肪變性程度輕,細胞空泡樣病變的數(shù)量明顯減少,但相對NC組仍散在分布。油紅O染色可見NC組肝細胞排列整齊,無紅色脂滴產(chǎn)生,細胞核呈藍紫色,間質(zhì)無色;NAFLD組肝細胞大量鮮紅色脂滴,脂質(zhì)浸潤明顯(P<0.05);與NAFLD組比較,經(jīng)CAA干預后紅色脂滴明顯減少,脂質(zhì)浸潤有所改善(P<0.05)(Fig.2)。

Fig.2 Pathological changes and fat accumulation in different groups of mice and quantitative analysis (n=3, (A) and (B)

2.3 樹豆酮酸A處理可降低非酒精性脂肪性肝病肝組織上清中炎癥因子IL-1β的表達

NAFLD組小鼠肝組織上清中IL-1β的含量明顯高于NC組(P<0.05)。給予CAA治療8周后,與NAFLD組相比IL-1β含量有所下降(P<0.05),提示CAA可降低NAFLD小鼠的炎癥反應(Fig.3)。

Fig.3 The expression of IL-1β (n=6,

2.4 樹豆酮酸A處理改善非酒精性脂肪性肝病膠原纖維的沉積和纖維化程度

天狼星紅染色觀察發(fā)現(xiàn)與NC組相比,NAFLD組膠原纖維表達面積顯著增加(P<0.05),CAA組小鼠肝組織膠原表達有明顯改善(P<0.05)。與NC組相比,NAFLD組E-鈣黏著蛋白表達水平明顯減少,纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的蛋白質(zhì)表達水平明顯增多,NAFLD組小鼠出現(xiàn)明顯的纖維化;經(jīng)CAA處理E-鈣黏著蛋白表達水平增多,纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的蛋白質(zhì)水平表達降低,提示CAA可有效延緩EMT過程及纖維化的進展(Fig.4)。

Fig.4 Representative images of Sirius scarlet staining (n=3,

2.5 樹豆酮酸A處理后肝組織中E2F1、E2F7基因表達發(fā)生改變

Western 印跡和實時 PCR結果顯示,與NC組相比,NAFLD組肝組織E2F1蛋白和mRNA水平的表達明顯增多,E2F7表達量明顯降低,提示E2F1、E2F7可能參與NAFLD的病理過程。經(jīng)CAA處理后E2F1在蛋白質(zhì)和mRNA水平表達降低,E2F7表達增多(P<0.05)(Fig.5)。免疫組織化學結果顯示,與NC組相比,NAFLD組E2F1在核質(zhì)中表達增加,E2F7在核質(zhì)中表達明顯減少,經(jīng)CAA治療后二者的表達均有所變化,并與Western 印跡和實時PCR表達變化具有一致性(Fig.6),E2F1和E2F7可能是CAA治療NAFLD的中間靶點。

Fig.5 The expression levels of E2F1 and E2F7 proteins and mRNA in the liver tissues of each group (n=6,

Fig.6 The expression levels of E2F1 and E2F7 protein in the liver tissue of db/db in each group

2.6 樹豆酮酸A處理后db/db小鼠肝組織E2F1和E2F7基因表達呈負相關

運用Spearman相關性分析對E2F1和E2F7蛋白質(zhì)水平表達進行相關性分析。結果顯示,在NAFLD組小鼠肝組織中E2F1和E2F7蛋白質(zhì)水平表達呈顯著負相關(r=-0.9690,P<0.01)(Fig.7A);在CAA組小鼠肝組織中E2F1和E2F7蛋白質(zhì)水平表達呈顯著負相關(r=-0.8857,P<0.05)(Fig.7B)。

Fig.7 Correlation analysis of the protein expression of E2F1 and E2F7 before (A) and after (B) CAA treatment (n = 6,

3 討論

NAFLD是世界上最常見的慢性肝病,全球患病率約為25%,易從單純脂肪肝發(fā)展為NASH和肝硬化,且可能惡化成肝癌,嚴重威脅人類生命和健康。NAFLD的臨床特點為肝細胞脂質(zhì)貯積與脂肪變性,脂質(zhì)沉積是慢性炎癥和纖維化的前提條件[22-23],且NAFLD由單純脂肪肝向NASH和纖維化的進展過程也并非為線性,而是具有波動性,部分疾病階段可以逆轉[24]。早期干預和個體化藥物治療是延緩和阻斷NAFLD向肝纖維化進展的治療關鍵。

樹豆酮酸A是一種從豆科植物樹豆中提取的藥物,可開發(fā)為醫(yī)治糖尿病或肥胖癥的藥物或保健食品,有益于糖尿病患者或肥胖者[25]。研究顯示,CAA具有降血糖的活性,且可減少肝細胞的壞死,不僅對2型糖尿病具有良好的治療作用,而且還可以降低總膽固醇、甘油三脂,治療糖尿病伴肝損傷[8、13]。本研究通過建立db/db小鼠自發(fā)性NAFLD模型,模型小鼠血糖、總膽固醇、甘油三酯和肝功能指標ALT和AST顯著升高,肝組織出現(xiàn)病理改變,脂質(zhì)和膠原過量沉積,表現(xiàn)出肝損傷和纖維化典型癥狀。CAA干預能夠顯著降低NAFLD血糖、總膽固醇、甘油三酯以及組織上清液中的ALT和AST水平,抑制肝組織內(nèi)脂質(zhì)沉積,提示CAA可以減輕NAFLD的血糖血脂水平和逆轉肝損傷。在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中,炎癥是最重要的病理生理過程之一。缺乏IL-1β的NAFLD小鼠模型由脂肪變性向脂肪性肝炎和肝纖維化的轉化明顯減少[26]。在本研究中,CAA干預后IL-1β水平下降,發(fā)揮抗炎作用,同時膠原纖維沉積也顯著減少,提示CAA可延緩NAFLD病程向纖維化的發(fā)展。在EMT過程中表型標志的改變,主要包括上皮細胞分子標志(如E-鈣黏著蛋白)的表達下降或喪失和一些間質(zhì)細胞標志(如纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白)的新表達或表達上升[6]。本研究中CAA干預后纖連蛋白、α-平滑肌肌動蛋白在蛋白質(zhì)水平表達降低,E-鈣黏著蛋白的表達增加,延緩EMT過程。但具體機制尚不清楚。

通過高脂肪肥胖小鼠模型探究植物Tecomella undulata bark的抗肥胖作用的相關研究發(fā)現(xiàn),在用其培養(yǎng)的脂肪細胞中PPARγ、C/EBPα、E2F1、瘦素等基因表達降低,發(fā)揮抗脂肪生成作用[27]。CAA也可下調(diào)PPARγ和C/EBPα來減少脂肪和脂肪細胞的生成,由此本文猜測,CAA有可能下調(diào)E2F1基因的表達。肝內(nèi)EMT過程可通過獨特的信號通路激活加速肝纖維化的發(fā)展[28],有研究發(fā)現(xiàn),E2F1在發(fā)生纖維化的器官組織中呈現(xiàn)一種高表達狀態(tài),對瘢痕組織中細胞的增殖發(fā)揮重要的作用[29-30]。并且在腎組織中E2F1/mTOR可通過抑制自噬水平促進糖尿病腎病小鼠的腎纖維化和EMT過程[31],高表達E2F7可抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞中EMT的發(fā)生,延緩糖尿病腎小管間質(zhì)纖維化的進展[21]。本文研究發(fā)現(xiàn),NAFLD小鼠中E2F1基因表達增加,E2F7基因表達降低,CAA干預后E2F1表達減少,E2F7表達增加。提示E2F1和E2F7可能參與了CAA減少脂質(zhì)沉積和減輕纖維化的過程,具體機制尚不明確。相關性分析表示,E2F1和E2F7二者呈顯著負相關,提示在NAFLD中E2F1與E2F7之間可能存在負調(diào)控關系,CAA可能通過恢復E2F7的表達,進而抑制E2F1的增多產(chǎn)生的病理作用,但要明確CAA是否通過E2F1/E2F7來發(fā)揮作用,仍需要更加嚴謹?shù)捏w外基因干預實驗。

綜上所述,樹豆酮酸A可以改善非酒精性脂肪性肝損傷和血糖血脂代謝紊亂、減少肝的脂質(zhì)和膠原沉積、減輕炎癥反應,延緩EMT過程,從而延緩疾病向肝纖維化的發(fā)展,并且E2F1和E2F7可能參與了該保護過程,但仍需要設計嚴謹?shù)捏w內(nèi)和體外實驗進一步驗證,未來計劃深入探討CAA是否是直接通過E2F1/E2F7來對NAFLD進行保護作用。