安中原，馮白茹，申 茹，張新忠，余 巧

（惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院/惠州市藥用植物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 惠州 516025）

牙周病是發(fā)生于牙齒組織的慢性感染性疾病，臨床表現(xiàn)有牙齦的發(fā)炎和出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收，導(dǎo)致牙齒松動、移位、脫落[1]，牙周病已經(jīng)嚴(yán)重影響人們的口腔健康。雙黃補是由黃連、黃芩和骨碎補按一定比例配伍而成，通過3種中藥綜合作用防治牙周病。國內(nèi)學(xué)者對其進(jìn)行了大量研究。研究[2-7]表明雙黃補在牙周組織再生修復(fù)，抑制炎癥反應(yīng)、抗菌及抗內(nèi)毒素等方面具有治療效果，雙黃補是傳統(tǒng)植物藥，不易產(chǎn)生耐藥性和不良反應(yīng)，更易被患者接受。

原位凝膠（in situ gel）是以液體狀態(tài)給藥后，能在用藥部位發(fā)生相轉(zhuǎn)變，由液體狀態(tài)轉(zhuǎn)化形成半固態(tài)凝膠的制劑，常見為溫度敏感型、離子敏感型和pH敏感型3類。原位凝膠在牙周炎治療中有諸多優(yōu)勢，注入牙周袋后形成藥物貯庫，緩慢釋放，提高了藥物的生物利用度，原位凝膠對于口腔中形態(tài)復(fù)雜或難以到達(dá)的牙槽缺陷部位具有更好的形狀適應(yīng)性，可與傷口緊密接觸[8]。將雙黃補開發(fā)成溫度敏感型原位凝膠防治牙周病，為雙黃補的應(yīng)用提供新劑型。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；DTY-124/223型電子天平（萬分之一，華志電子科技有限公司）；JA3003型電子天平（千分之一，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500VSM型雙頻靜音型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PB-10酸度計（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Direct-Pure RO 10型純水儀（上海樂楓生物科技有限公司）；SHA-C型水浴恒溫振蕩器（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；800Y型高速多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）;MD25型透析袋（截留分子量14 000，比克曼生物科技有限公司）；DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，西隴科學(xué)股份有限公司）；磷酸、磷酸二氫鉀、乙醇為分析純；超純水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；黃芩苷對照品（批號：20220309）、鹽酸小檗堿對照品（批號：20220524），均購自北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院，純度大于98%；泊洛沙姆407（批號：GNF09421B）、泊洛沙姆188（批號：GNF19922B），均購自德國BASF公司；黃芩（山西，批號：220401）、黃連（四川，批號：220201）和骨碎補（貴州，批號：2022030101）均購于惠州百姓大藥房醫(yī)藥連鎖有限公司，經(jīng)惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院祁銀德教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材提取及濃縮

2.1.1 煎煮法 將藥材粉碎，過2號篩（24目），按照黃連：黃芩：骨碎補=2：1：1比例稱取藥材粗粉（黃連2 g，黃芩1 g，骨碎補1 g），加入20倍量純化水煎煮1 h，濾過，定容至250 mL。

2.1.2 回流法 稱取一定量的處方藥材粗粉（同“2.1.1”），加入20倍量60%乙醇回流提取1 h，濾過，定容至250 mL備用。

2.1.3 超聲法 稱取一定量的處方藥材粗粉（同“2.1.1”），加入20倍量60%乙醇超聲提取1 h，濾過，定容至250 mL備用。

2.1.4 結(jié)果分析 將“2.1.1”～“2.1.3”項下濾液進(jìn)行測定，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果顯示，黃芩苷含量較高，故評分時設(shè)定權(quán)重為0.7，而鹽酸小檗堿為0.3，測定結(jié)果見表1，因此選擇回流法。

表1 提取方法考察

2.1.5 溶劑濃度的考察 稱取一定量的處方藥材粗粉，分別用體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%的乙醇對藥材進(jìn)行回流提取，平行3份，乙醇用量為20倍量，80 ℃水浴1 h，過濾、定容，進(jìn)樣測定，計算綜合評分。50%、60%、70%、80%的乙醇提取綜合評分分別是9.703、10.160、9.825、9.532，故選擇60%乙醇作為溶劑濃度。

2.1.6 正交試驗 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選擇提取時間（A）、料液比（B）、提取次數(shù)（C）為考察對象，采用L9（34）正交表設(shè)計試驗，對雙黃補提取工藝進(jìn)行考察，因素水平見表2，結(jié)果見表3~4。

表2 正交試驗因素與水平

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

由表3分析結(jié)果可知，各因素對綜合得分的影響大小依次是料液比>提取次數(shù)>提取時間。雙黃補最佳提取工藝是A1B3C3，即提取時間0.5 h，料液比1：20，提取3次。由表4方差分析結(jié)果可知，料液比具有明顯差異（P＜0.05），其它因素不顯著。

表4 方差分析結(jié)果

將處方量藥材放大10倍，按優(yōu)化工藝進(jìn)行回流提取，進(jìn)行3批驗證試驗，結(jié)果見表5，可知工藝穩(wěn)定可行。

表5 驗證實驗結(jié)果

2.1.7 提取物的制備 將回流液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，再65 ℃水浴蒸干，得到干浸膏，粉碎過100目篩備用。

2.2 制備工藝優(yōu)化

2.2.1 雙黃補溫敏凝膠的制備 采用“冷溶法”制備[9-10]，稱取一定比例量的泊洛沙姆188（P188）和泊洛沙姆407（P407）于燒杯中，加入適量純化水，不斷攪拌使其分散均勻，冰箱冷藏保存24 h，使之充分溶脹至澄清透明，即得空白溫敏原位凝膠。再將處方量雙黃補提取物加入到空白原位凝膠中，混合分散均勻，最后加水至全量，即得。

2.2.2 膠凝溫度（gelation temperature，Tg）測定 采用傾斜法[11]，取約4 mL凝膠放置于西林瓶中，瓶蓋鉆孔插入精密溫度計（精確到0.1 ℃），放于水浴鍋中，使水浴鍋持續(xù)緩慢升溫，每升高0.5 ℃恒溫5 min，每10~20 s傾斜一次，傾斜角度約45°，觀測西林瓶中凝膠不再流動時溫度計的讀數(shù)，即為膠凝溫度。每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值。

2.2.3 基質(zhì)用量篩選

2.2.3.1 P407用量的考察 固定P188質(zhì)量濃度為1%，分別配制P407質(zhì)量濃度為14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%的溫敏凝膠，測定膠凝溫度，結(jié)果見表6。隨著P407濃度的增加，膠凝溫度逐漸降低，當(dāng)P407質(zhì)量濃度低至15%時，在50 ℃條件下仍無法膠凝，當(dāng)P407質(zhì)量濃度為20%時，其膠凝溫度為26.5℃，故選擇P407的質(zhì)量濃度范圍為16%～18%。（見表6）

表6 不同濃度P407 對膠凝溫度的影響

2.2.3.2 P188用量的考察 配制質(zhì)量濃度為16%、17%、18%的P407溶液，在每個質(zhì)量濃度水平下分別加入1%、2%、3%的P188，得到不同配比的溫敏凝膠溶液，測定膠凝溫度，如表7所示。人體正?？谇粶囟葹?6.3～37.2 ℃，理想的凝膠應(yīng)在室溫下是液體，在體溫條件下迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w，故考慮膠凝溫度34～37 ℃之間，綜合以上結(jié)果及生產(chǎn)成本，采用17%的P407，1%的P188作為最優(yōu)基質(zhì)配比。

表7 不同凝膠配比對膠凝溫度的影響

2.2.4 凝膠載藥量的考察 固定P407的質(zhì)量濃度為17%，P188的質(zhì)量濃度為1%，加入0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、1.0%（m/V）雙黃補提取物（提取物黃芩苷含量為96.53 mg/g，鹽酸小檗堿含量為93.55 mg/g），當(dāng)加入雙黃補提取物超過0.8%時，會有渾濁、沉淀產(chǎn)生。因此雙黃補提取物的質(zhì)量濃度控制在0.8%以下。雙黃補提取物加入量小于0.8%時對膠凝溫度影響較小，本處方載藥量為0.7%的提取物。

2.3 含量測定方法

2.3.1 色譜條件 采用Thermo ODS-2 HYPERSIL 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05 moL/L磷酸二氫鉀（磷酸調(diào)節(jié)PH至3.20）；洗脫條件為（0～5 min，乙腈21%；＞5～25 min，21%～33%乙腈）；檢測波長為265 nm；流速為0.8 mL/min；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為10 μL。黃芩苷和鹽酸小檗堿的分離度均大于1.5，黃芩苷理論塔板數(shù)為2 739，鹽酸小檗堿理論塔板數(shù)為5 127。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 供試品溶液的制備 精密移取雙黃補溫敏凝膠2 mL，置于50 mL容量瓶中，加入40 mL甲醇，超聲（功率250 W、頻率35 kHz）20 min，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.3.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷0.017 7 g和鹽酸小檗堿0.015 0 g，分別置于20 mL和25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即得黃芩苷和鹽酸小檗堿儲備液。精密吸取上述對照品儲備液各5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到黃芩苷和鹽酸小檗堿混合對照品溶液。

2.3.2.3 陰性對照品溶液的制備 取不含雙黃補的空白溫敏凝膠2 mL，依照供試品溶液的制備方法，即得陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 專屬性試驗 取“2.3.2”項下對照品、供試品、陰性對照品溶液，按“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣，色譜圖結(jié)果見圖1。由色譜圖可知，供試品和對照品在相同保留時間內(nèi)有較大吸收，分離度好，陰性對照品溶液對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液適量，用甲醇配制成黃芩苷和鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度分別為6.914、13.828、27.656、55.312、110.625、221.250、442.500 μg/mL和4.688、9.375、18.750、37.500、75.000、150.000、300.000 μg/mL的一系列對照品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣10 μL測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到黃芩苷的回歸方程為Y＝31.701X-223.90，R2＝0.999 9（n=7），鹽酸小檗堿的回歸方程為Y＝57.194X-84.59，R2＝0.999 9（n=7）。結(jié)果表明，黃芩苷在6.914～442.500 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，鹽酸小檗堿在4.688～300.000 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.3.3.3 精密度試驗 按照“2.3.2”項下方法配制供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測定6次，每次10 μL，記錄黃芩苷和鹽酸小檗堿的峰面積，結(jié)果其RSD值分別為1.36%和0.97%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.3.4 穩(wěn)定性試驗 按照“2.3.2”項下方法配制供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)行測定，測得黃芩苷含有量RSD值為1.45%，鹽酸小檗堿RSD值為1.60%（n=6），表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3.5 重復(fù)性試驗 取同一批溫敏凝膠，按“2.3.2”項下方法制備平行供試品溶液6份，按“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)行測定，測得黃芩苷含有量RSD值為1.78%，鹽酸小檗堿含有RSD值為1.91%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.6 加樣回收率試驗 精密移取已知黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的凝膠樣品1 mL，共9份，加入質(zhì)量濃度已知的對照品溶液，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算2種成分的回收率。結(jié)果黃芩苷、鹽酸小檗堿的平均回收率分別97.65%、98.54%（RSD＝2.09%、2.65%，n＝9）。（見表8）

表8 加樣回收率結(jié)果

表9 含量測定結(jié)果

2.3.4 樣品含量測定 按優(yōu)選工藝制備3批凝膠，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算含有量，結(jié)果見表8。

2.4 雙黃補溫敏凝膠體外釋放考察

2.4.1 人工唾液的配制[12]稱取氯化鉀0.400 g、氯化鈉0.400 g、氯化鈣0.795g、磷酸二氫鈉0.780g、硫化鈉0.005g、尿素1.000g，加純化水至1000 mL，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8。

2.4.2 體外釋放度 采用透析袋法[13]。精密移取2 mL雙黃補溫敏凝膠放置于已經(jīng)活化的透析袋中，兩端用細(xì)繩扎好，放在37 ℃烘箱中預(yù)熱5 min，使之完全膠凝。將透析袋放入250 mL帶塞錐形瓶中，加入新鮮配制的已預(yù)熱37 ℃的人工唾液100 mL,將錐形瓶放于37 ℃的恒溫振蕩器中，振蕩頻率為130 r/min，分別在1、2、3、5、7、8、10、12、24 h均取樣5 mL，同時補加等量的人工唾液5 mL，移出液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣測定，各個時間點的累計釋放率按以下公式計算。

其中，Q0是溫敏凝膠中黃芩苷或鹽酸小檗堿含量，V0是介質(zhì)體積（100 mL），V為每次取樣體積（5 mL），Cn和Ci為第n次和第i次取樣時的實測濃度。

結(jié)果顯示，黃芩苷在10 h釋放50%以上，鹽酸小檗堿在7 h釋放50%以上，兩者的釋放時間均超過24 h，雙黃補溫敏凝膠具有良好的緩釋作用。采用零級、一級、Higuchi方程模型對黃芩苷、鹽酸小檗堿體外釋放進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，黃芩苷的釋放符合Higuchi方程，鹽酸小檗堿的釋放符合一級動力學(xué)方程。（見圖2、表10）

圖2 黃芩苷、鹽酸小檗堿的體外累積釋放曲線

表10 黃芩苷、鹽酸小檗堿體外釋放擬合情況

3 討論

本實驗采用乙醇回流法，通過正交實驗，篩選了雙黃補最佳提取工藝，本方法簡單可行，并且黃芩苷與鹽酸小檗堿提取率較高，為提取物制備奠定了基礎(chǔ)。

溫敏凝膠是目前研究最廣泛的一類原位凝膠，室溫下為液體，在體溫條件下迅速轉(zhuǎn)為半固體，目前逐漸運用到中藥新劑型開發(fā)中。P407和P188作為溫敏凝膠基質(zhì)，生物相容性好，對人體基本無毒性、無局部刺激性[14]，且能對藥物起到增溶作用[15]。P407和P188單獨使用時都有一定的局限性，二者要按照一定比例搭配才能達(dá)到良好的效果。本實驗通過二者不同的比例組合來優(yōu)化溫敏凝膠處方，達(dá)到最佳凝膠溫度。研究發(fā)現(xiàn)隨著P407濃度的增大，膠凝溫度逐漸下降，隨著P188濃度的增加，膠凝溫度逐漸上升。膠凝溫度的測定有攪拌子法、粘度計法、傾斜法，各有一定的優(yōu)缺點[11]，本實驗最終采用傾斜法，結(jié)果直觀，操作方便。據(jù)研究報道，1.0 μg/mL黃芩苷可降低實驗性牙周炎大鼠牙齦組織中IL-1βmRNA和其外周血中1L-1β的表達(dá)水平，抑制1L-1β的分泌和合成，減輕機體炎性反應(yīng)，抑制牙槽骨吸收[16]。0.010～0.020 mg/mL的鹽酸小檗堿能增強人牙周膜細(xì)胞活性[17]。綜合考量，本實驗載藥量為0.7%提取物。

體外釋放度是評價緩控釋制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)，目前關(guān)于原位凝膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未形成共識，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[18]。本實驗采用透析袋法對體外釋放行為進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示黃芩苷的釋放符合Higuchi方程，鹽酸小檗堿的釋放符合一級動力學(xué)方程，實驗中也發(fā)現(xiàn)振蕩頻率、釋放介質(zhì)體積對藥物的釋放度有一定的影響。

本法制備的雙黃補溫敏凝膠工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控，可以通過特制的注射器直接注射于牙周袋內(nèi)，以不規(guī)則的半固態(tài)形式分布于牙周袋內(nèi)，發(fā)揮持續(xù)釋藥作用。