何清華，徐 偉,2，楊云芝,2，范潤(rùn)勇,2，周 茜

（1.南充市中醫(yī)醫(yī)院，四川 南充 637000；2.筋骨病中醫(yī)藥防治南充市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637000）

損傷中期合劑[1]是南充市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科常用中藥制劑。該方來(lái)源于院內(nèi)臨床老專家的協(xié)定方“損傷合劑系列”之一，由陳皮、麩炒枳殼、骨碎補(bǔ)、黃芪等中藥組成，具有益氣活血、續(xù)筋接骨的功效，用于治療骨傷疾病中期階段。損傷中期合劑20世紀(jì)90年代初就已應(yīng)用于臨床骨傷科，并于2007年經(jīng)四川省食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)注冊(cè)為損傷中期合劑。后歷經(jīng)幾次再注冊(cè)，損傷中期合劑于2022年轉(zhuǎn)為備案品種，備案號(hào)為：川藥制備字20220363000。損傷中期合劑臨床使用至今已達(dá)三十余年，療效確切。南充市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科為四川省中醫(yī)重點(diǎn)專科，骨傷疾病患者人數(shù)眾多，年門診人次達(dá)15萬(wàn)余人次。該方臨床骨傷患者使用率占比95%以上。由于該制劑為傳統(tǒng)合劑，藥液有效成分純度不高，且為多劑量玻璃瓶大包裝，易碎。患者服用時(shí)需撬開鋁蓋分劑量服用，且服用量大。損傷中期合劑開蓋后還需冷藏保存，導(dǎo)致患者攜帶、服用、保存不方便。由于該制劑臨床應(yīng)用較早，早期研究?jī)H對(duì)提取質(zhì)量進(jìn)行了簡(jiǎn)單的定性研究，而未進(jìn)行藥物成分含量的定量研究，導(dǎo)致制備工藝簡(jiǎn)單，不易判斷藥物提取質(zhì)量的優(yōu)劣。因此，本研究以提取溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷4種成分含量[2-5]及收膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)損傷中期口服液的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)通過(guò)對(duì)處方中的多種成分含量的測(cè)定分析，篩選最佳提取工藝參數(shù)，以全面客觀地評(píng)價(jià)提取工藝的優(yōu)劣，以期為該制劑生產(chǎn)的高效提取提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器 LCK2000型煎藥機(jī)（天津三延精密機(jī)械有限公司）；ES1035B型十萬(wàn)分之一分析天平（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；G-100S型超聲波清洗器（深圳市哥能清洗設(shè)備有限公司）；SYG-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器廠）；WGL-45B型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；TD5A醫(yī)用離心機(jī)（常州市金壇高科儀器廠）。

1.2 試劑與藥物 黃芪飲片（批號(hào)：220709-11）、陳皮飲片（批號(hào)：220518-21）、麩炒枳殼飲片（批號(hào)：221214-31）、骨碎補(bǔ)飲片（批號(hào)：220415-11）、當(dāng)歸飲片（批號(hào)：220528-21）、羌活飲片（批號(hào)：230108-11）、白芍飲片（批號(hào)：220921-11）、酒川芎飲片（批號(hào)：220912-11）均購(gòu)自成都吉安康藥業(yè)有限公司，經(jīng)南充市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部主任中藥師楊云芝鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[6]的要求；對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)：111920-201907，純度：96.8%）、橙皮苷（批號(hào)：110721-202220，純度：97.2%）、新橙皮苷（批號(hào)：111857-201804，純度：99.4%）、柚皮苷（批號(hào)：110722-202116，純度：93.5%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜醇，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法 根據(jù)處方藥物比例稱取原料，加水煎煮提取、過(guò)濾，濃縮，離心，加純化水定容至1 000 mL的樣品溶液，備用。

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 以Agilent Zorbax SB-18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；以乙腈-0.2%磷酸溶液（18：82）為流動(dòng)相等度洗脫；流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷對(duì)照品適量，分別加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為217.03、765.94、1 006.92、2 750.80 μg/mL的溶液。精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷溶液1 mL、柚皮苷溶液2 mL、橙皮苷溶液2 mL、新橙皮苷溶液4 mL至10 mL容量瓶中，定容至刻度，配制成毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷質(zhì)量濃度分別為21.70、153.19、402.77、550.16μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密吸取“2.1”項(xiàng)下制備的樣品溶液1 mL置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 根據(jù)處方藥物比例分別稱取缺黃芪、缺陳皮、缺麩炒枳殼、缺骨碎補(bǔ)的原料，按照“2.1”提取方法制備陰性溶液，再按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備缺黃芪、缺陳皮、缺麩炒枳殼、缺骨碎補(bǔ)的陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 精密吸取供試品溶液，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷混合對(duì)照品溶液，陰性對(duì)照溶液各5 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，供試品溶液與混合對(duì)照品溶液色譜中相同的保留時(shí)間處有對(duì)應(yīng)峰，陰性對(duì)照溶液無(wú)對(duì)應(yīng)峰，表明該方法專屬性強(qiáng)。色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照高效液相色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液配置成分別含毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.36、2.71、5.43、10.85、21.70 μg/mL，橙皮苷4.79、9.57、19.15、38.30、76.60、153.19 μg/mL，新橙皮苷12.59、25.17、50.35、100.69、201.39、402.77 μg/mL，以及柚皮苷17.19、34.39、68.77、137.54、275.08、550.16 μg/mL的梯濃度，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為Y=0.157 8X-0.000 5（r=1.000 0），Y=0.146 2X-0.012 5（r=1.000 0），Y=0.160 9X-0.007 8（r=1.000 0），Y=0.155 7X+0.011 8（r=1.000 0），線性范圍分別為1.36～21.70 μg/mL，4.79～153.19 μg/mL，12.59～402.77 μg/mL，17.19～550.16 μg/mL，表明各成分質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷峰面積的RSD值分別為0.21%，0.11%，0.13%，0.11%，表明該儀器的精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷峰面積的RSD值分別為0.95%，0.28%，0.25%，1.79%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液，分別按照“2.2.3”項(xiàng)下制備方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷平均質(zhì)量濃度分別為3.98，30.45，69.92，94.79 μg/mL，RSD值分別為0.45%，1.12%，0.20%，0.43%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別加入一定量的混合對(duì)照品溶液，平行制備供試品溶液6份，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷平均加樣回收率分別為97.46%，98.56%，96.90%，97.30%，RSD值分別為1.22%，1.13%，0.83%，1.41%。

2.4 評(píng)價(jià)指標(biāo) 以有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量及收膏率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.4.1 多指標(biāo)綜合評(píng)分[7-9]根據(jù)中藥君、臣、佐、使的配伍原則，以及各指標(biāo)在處方中的相對(duì)重要性不同，對(duì)上述各指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重系數(shù)分配[10-11]，分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量0.40、橙皮苷含量0.15、新橙皮苷含量0.15、柚皮苷含量0.20、收膏率0.10。綜合得分=毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量/毛蕊異黃酮葡萄糖苷最大含量×0.40×100+橙皮苷含量/橙皮苷最大含量×0.15×100+新橙皮苷含量/新橙皮苷最大含量×0.15×100+柚皮苷含量/柚皮苷最大含量×0.20×100+收膏率/最大收膏率×0.10×100。

2.4.2 提取液收膏率的測(cè)定與計(jì)算 精密量取“2.1”項(xiàng)下制備的樣品溶液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿（ma）中，水浴蒸干后于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，立即稱定質(zhì)量（mb），收膏率=（m為處方藥材質(zhì)量，V為樣品溶液體積）[12-13]。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)選損傷中期口服液的最佳提取工藝

2.5.1 因素水平選擇 前期研究考察了影響提取效率的多種因素：浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)、濃縮溫度。浸泡時(shí)間與濃縮溫度對(duì)提取效率的影響不明顯，不作為此次考察的重點(diǎn)。本研究主要考察了加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素。結(jié)果表明，隨著加水量的增加，綜合得分升高。當(dāng)加水量增加到9倍以上時(shí)，綜合得分相差不明顯。因此本研究選擇了綜合得分較高的5倍、7倍、9倍加水量，得分分別為55.58分、72.07分、97.05分。提取時(shí)間考查了40 min至2.5 h時(shí)間段。本研究隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，綜合得分升高。當(dāng)時(shí)間超過(guò)2 h后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，綜合得分反而降低，說(shuō)明在提取2 h后，隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，有效成分含量減少。因此本研究確定了1～2 h作為考查時(shí)間段，重點(diǎn)考察了綜合得分較高的提取時(shí)間1、1.5、2 h，得分分別為95.54分、99.52分、96.06分。本研究考查了1～5次的提取次數(shù)，隨著次數(shù)增加，綜合得分升高。當(dāng)提取第4次及以上時(shí)，綜合得分變化不明顯，說(shuō)明藥物溶出已趨于穩(wěn)定。4次以后的提取物占比較少，因此本研究選擇了綜合得分較高的提取次數(shù)1次、2次、3次作為重點(diǎn)考查，得分分別為79.86分、94.02分、99.17分。另外同時(shí)也考濾生產(chǎn)效率和成本，本研究最終確定了加水量為5倍、7倍、9倍3個(gè)水平，提取時(shí)間為1、1.5、2 h 3個(gè)水平，提取次數(shù)為1次、2次、3次3個(gè)水平，為正交試驗(yàn)因素水平的選擇提供依據(jù)。

2.5.2 正交試驗(yàn)[14-16]按處方藥物比例分別稱取藥物9份，在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷含量及收膏率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選損傷中期口服液的最佳提取工藝。因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

A因素影響綜合得分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），影響程度依次為A＞C＞B，優(yōu)選出最佳的工藝為A3B1C3，即加水量9倍，提取1 h，提取3次。

2.6 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證優(yōu)選提取工藝的穩(wěn)定性與合理性，需進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)處方藥物比例稱取藥物3份，按照正交試驗(yàn)優(yōu)選出的提取工藝制備供試品溶液3份，分別測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量及收膏率。（見表4）

表4 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3批驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)間無(wú)明顯差異，表明優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定可靠，重復(fù)性良好。

3 討論

根據(jù)骨折不同階段的癥狀特點(diǎn)，臨床常采用三期療法進(jìn)行治療[17-18]。中期階段瘀血未盡，治療以益氣活血、祛瘀生新、接骨續(xù)筋為主，常使用黃芪、陳皮、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷等中藥。損傷中期口服液處方由黃芪、當(dāng)歸、陳皮、茯苓、麩炒枳殼、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷等藥物制成，具有益氣活血、續(xù)筋接骨的功效。本試驗(yàn)選取處方中具有重要治療作用的君藥與臣藥的活性成分為研究對(duì)象，代表處方藥物的綜合提取成分，對(duì)提取工藝進(jìn)行考察。方中黃芪具有補(bǔ)氣健脾、益衛(wèi)固表之功，為君藥；陳皮可理氣健脾，燥濕化痰；麩炒枳殼具有理氣寬中、行滯消脹的功效；骨碎補(bǔ)具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨、活血止痛的功效，與陳皮、麩炒枳殼共為臣藥。黃芪的活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、陳皮的活性成分橙皮苷、麩炒枳殼的活性成分新橙皮苷、麩炒枳殼與骨碎補(bǔ)的共同活性成分柚皮苷4種成分均為苷類化合物，都易溶于水，因此本研究采用加水煎煮提取[19-22]。中藥復(fù)方成分復(fù)雜，治療疾病時(shí)往往不是單一成分起治療作用，而是多成分多靶點(diǎn)協(xié)同作用。藥物的綜合提取成分為其治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，多指標(biāo)綜合評(píng)分法已廣泛應(yīng)用于復(fù)方藥物制劑工藝的篩選。該方法通過(guò)對(duì)多個(gè)指標(biāo)分配權(quán)重系數(shù)，計(jì)算綜合評(píng)分。因此，為了能更好地評(píng)價(jià)中藥處方藥物提取的綜合療效，本次試驗(yàn)對(duì)多種活性成分的含量進(jìn)行測(cè)定，以總提取物收膏率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，來(lái)優(yōu)選損傷中期合劑的最佳提取工藝，并進(jìn)行了驗(yàn)證。與早期一般的定性研究比較，該方法能更全面、更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)提取工藝的優(yōu)劣。根據(jù)中藥君、臣、佐、使的配伍原則，以及各指標(biāo)在處方中的相對(duì)重要性不同，本研究針對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷4種成分和收膏率指標(biāo)，劃分了權(quán)重系數(shù)，分別定為0.40、0.15、0.15、0.20、0.10。根據(jù)正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果，優(yōu)選出的最佳提取工藝為：加水量9倍，提取1 h，提取3次。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量及收膏率數(shù)據(jù)無(wú)明顯差異，說(shuō)明篩選出的提取工藝重復(fù)性好，質(zhì)量穩(wěn)定，提取率高，為損傷中期口服液生產(chǎn)的高效提取提供了理論依據(jù)。但本次試驗(yàn)只對(duì)提取工藝進(jìn)行了考察，未考察不同濃縮方法、濃縮時(shí)間對(duì)成分含量的影響，后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)將上述因素納入考察。