黃景珠，莫 庸，黃森平，黃石鳳，周雅婷，陳冬梅，鄒蘭蘭，李杰鴻，程晴晴，周曉媛，方曉燕，黃麗娟

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

肝纖維化是繼發(fā)于各種原因引起的肝臟炎癥或損傷后肝組織修復(fù)過程的代償性反應(yīng)，是各種慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的共同病理過程，是肝硬化、肝癌發(fā)生和發(fā)展的中間環(huán)節(jié)[1]。而中藥在治療肝纖維化方面則有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，主要體現(xiàn)在中藥具有多種成分，可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，通過多種途徑、多個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)發(fā)揮其治療作用。傘形科植物茴香（Foeniculum vulgareMill.）是我國(guó)許多少數(shù)民族常用藥，其常作為一種治療肝病的藥物使用。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)小茴香（茴香果實(shí)）具有護(hù)肝[2-3]、抗氧化[4-5]及抗肝纖維化[6-8]作用。本課題組前期利用壯藥茴香莖葉進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茴香提取液對(duì)糖尿病肝損傷及急性酒精性肝損傷均有保護(hù)作用[2，9]。本研究擬通過四氯化碳（CCl4）復(fù)合酒精構(gòu)建小鼠肝纖維化模型，進(jìn)一步探討茴香提取液干預(yù)治療肝纖維化的效應(yīng)，為開發(fā)廣西壯藥茴香抗肝纖維化提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種雄性小鼠40只，體質(zhì)量為（23±2）g，由右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：（SCXK桂2017-0003），該實(shí)驗(yàn)經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理審查號(hào)：2018091503。實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，溫度為26 ℃，相對(duì)濕度為40%~70%。

1.2 藥品與試劑 茴香（Foeniculum vulgare），百色市市售原植物，經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)學(xué)覃道光教授鑒定為茴香的莖葉；北京二鍋頭56°白酒（批號(hào)：20180916）購(gòu)買于北京二鍋頭酒業(yè)股份有限公司；橄欖油（批號(hào)：GB723347）購(gòu)買于廣州糧油工業(yè)有限公司；CCl4（批號(hào)：20180718）購(gòu)買于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；蛋白定量、SOD、MDA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為：20181218、20181226、20181226）均購(gòu)買于南京建成生物工程研究所；透明質(zhì)酸（HA）、層黏連蛋白（LN）ELISA試劑盒（批號(hào)分別為：201901、201901）均購(gòu)買于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；Masson染液（批號(hào)：20181221）購(gòu)買于南京建成科技有限公司。

1.3 儀器 日立全自動(dòng)7600生化分析儀（株式會(huì)社日立高新技術(shù)公司）；722型可見分光光度計(jì)（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（德國(guó)Berthold公司）。

2 方法

2.1 茴香提取液的制備 將原植物茴香莖葉曬干，粉碎，取茴香500 g，用2 000 mL的水浸泡茴香40 min，將液體盛于玻璃容器內(nèi)，進(jìn)行微波處理,然后用5 000 mL的水分兩次浸提，每次30 min，最后將兩次藥液混合并濃縮至每1 mL含生藥分別為0.5、1.0 g、1.5 g，分裝于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組與造模 將健康雄性小鼠隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組8只、肝纖維化模型組32只。正常對(duì)照組腹腔注射橄欖油，肝纖維化模型組腹腔注射12%CCl4橄欖油溶液造模，用量0.1 mL/10 g，3 d/次，連續(xù)8周，同時(shí)肝纖維化模型組給予5%北京二鍋頭56°白酒飲用水，8周后，隨機(jī)抽取小鼠觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)改變證實(shí)肝纖維化模型已經(jīng)建立成功；將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組及茴香高、中、低劑量組（15、10、5 g/kg）。茴香高、中、低劑量組給予相應(yīng)的藥液灌胃給藥（1次/d），空白組和模型組給予等量的蒸餾水，連續(xù)灌胃給藥5周。給藥治療期間，除正常對(duì)照組給予腹腔注射橄欖油+蒸餾水飲用水外，其他組繼續(xù)腹腔注射12%CCl4橄欖油溶液+5%北京二鍋頭56°白酒飲用水造模，用量0.1 mL/10 g，1次/周，維持3周。

2.3 指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后禁食12 h，摘除眼球取血，收集血液標(biāo)本，離心取血清。采用日立全自動(dòng)7600生化分析儀測(cè)血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）；ELISA測(cè)定肝纖維化指標(biāo)：透明質(zhì)酸（HA）、層黏連蛋白（LN）。取肝左葉0.5 g，以1：9（m/V）的冰生理鹽水制成10%肝組織勻漿。用722型可見分光光度計(jì)按試劑盒說(shuō)明書操作，用考馬斯亮蘭法（波長(zhǎng)595 nm）測(cè)定肝組織蛋白，用羥胺法（波長(zhǎng)550 nm）測(cè)定肝組織超氧化物歧化酶（SOD），用硫代巴比妥酸法（TBA法，波長(zhǎng)532 nm）測(cè)定肝組織丙二醛（MDA）。另取肝組織甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，HE染色，觀察各組肝組織病理形態(tài)學(xué)改變；膠原纖維染色（Masson染色）觀察膠原纖維染色情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行各組之間的比較，各組數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 茴香提取液對(duì)肝纖維化小鼠血清ALT和AST的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組血清ALT和AST酶活性顯著增高（P＜0.01）。與模型組相比，茴香低、中、高劑量組ALT、AST酶活性顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；茴香高劑量組ALT酶活性明顯低于茴香低劑量組（P＜0.01）。（見表1）

表1 茴香提取液對(duì)小鼠血清ALT 和AST 的影響（±s，U/L）

表1 茴香提取液對(duì)小鼠血清ALT 和AST 的影響（±s，U/L）

注:與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01，與茴香低劑量組比較，eP＜0.01。

?

3.2 茴香提取液對(duì)肝纖維化小鼠血清HA和LN的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組HA、LN明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，茴香低、中、高劑量組HA和LN明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。茴香高劑量組HA和LN明顯低于茴香低劑量組（P＜0.01）。（見表2）

表2 茴香提取液對(duì)小鼠血清HA 和LN 的影響（±s，U/L）

表2 茴香提取液對(duì)小鼠血清HA 和LN 的影響（±s，U/L）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01，與茴香低劑量組比較，eP＜0.01。

?

3.3 茴香提取液對(duì)肝纖維化小鼠肝組織SOD和MDA的影響與正常對(duì)照組相比，模型組SOD活性水平降低，MDA水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，茴香高劑量組SOD活性明顯升高，MDA水平明顯降低，茴香中劑量組MDA水平明顯降低（P＜0.05）。（見表3）

表3 茴香提取液對(duì)小鼠肝組織SOD 和MDA 的影響（±s）

表3 茴香提取液對(duì)小鼠肝組織SOD 和MDA 的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05。

?

3.4 茴香提取液對(duì)肝纖維化小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響HE染色顯示，正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，Masson染色僅見少許膠原纖維染色，無(wú)膠原纖維增生。模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂，纖維結(jié)締組織增生，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見假小葉形成；Masson染色顯示匯管區(qū)和中央靜脈周圍有大量藍(lán)色膠原纖維增生，增多的膠原纖維形成條狀纖維間隔。茴香低、中、高劑量組對(duì)纖維化程度均有不同改善，以茴香高劑量組改善作用顯著。（見圖1）

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)變化

4 討論

肝纖維化是指多種原因?qū)е赂闻K損害，肝細(xì)胞發(fā)生炎癥刺激及壞死,肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）異常增生而過多沉積于肝內(nèi)，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積的病理過程。ECM包括膠原蛋白、HA、LN等多種成分，其中HA、LN是肝臟基質(zhì)代謝產(chǎn)物。血清HA、LN水平可側(cè)面反映出肝臟ECM的代謝情況，同時(shí)也能反映出肝纖維化的進(jìn)展情況[10]。肝纖維化時(shí)，HA的合成與降解失衡，肝星狀細(xì)胞合成HA增加，而肝內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)HA降解能力降低，從而導(dǎo)致血清中HA水平明顯增高[11]。LN是基底膜的主要成分。肝纖維化時(shí)，隨肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的膠原沉著形成基膜而毛細(xì)血管化，血清中LN增高[12]。一項(xiàng)臨床研究[13]表明，HA和LN可反映肝組織肝纖維化程度，增高程度與纖維化程度呈正相關(guān)。這些指標(biāo)可用于判斷肝纖維化的嚴(yán)重程度。肝纖維化進(jìn)程中也常伴有不同程度的肝臟損傷。相關(guān)研究[14]顯示，ALT與AST常被用于評(píng)估肝臟損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射CCl4復(fù)合5%北京二鍋頭56°白酒飲用水構(gòu)建小鼠肝纖維化模型。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組ALT、AST、HA、LN顯著升高（P＜0.01），肝組織中有大量膠原纖維的增生，說(shuō)明肝纖維化造模成功并出現(xiàn)明顯的肝功能損害，肝臟有大量的膠原蛋白沉積。經(jīng)茴香提取液干預(yù)治療的各實(shí)驗(yàn)組ALT、AST、HA和LN顯著降低（P＜0.05），其中茴香高劑量組ALT酶活性、HA和LN明顯低于茴香低劑量組（P＜0.01）。進(jìn)一步病理形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，茴香各給藥組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞程度減輕，膠原纖維程度明顯減輕且增生的膠原纖維較模型組纖細(xì)菲薄。茴香低、中、高劑量組對(duì)纖維化程度均有不同改善，以茴香高劑量組改善作用顯著。說(shuō)明茴香提取液可以減輕肝細(xì)胞損傷和膠原纖維的增生，改善肝纖維化程度，提示茴香提取液具有緩解和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的功效。

此外，抗氧化應(yīng)激在逆轉(zhuǎn)肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15-16]。在肝纖維化的形成過程中，肝臟的脂質(zhì)過氧化損傷使ROS激活，ROS激活后HSC大量增殖。高水平的氧化應(yīng)激可刺激ECM過度分泌，致使膠原沉積[17]，同時(shí)持續(xù)的慢性炎癥和氧化應(yīng)激失衡可能促進(jìn)肝纖維化功能障礙，最終導(dǎo)致肝硬化[18]。已有研究[19-20]顯示，SOD活性、MDA含量可反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷發(fā)生情況。SOD主要清除體內(nèi)過多的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，可反映自由基的清除速度；MDA可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化物的代謝水平。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在肝組織中，模型組SOD活性水平降低，MDA水平升高，而與模型組比較，茴香高劑量組SOD活性明顯升高，MDA水平明顯降低，說(shuō)明茴香提取液可通過減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、清除自由基而緩解和改善肝纖維化的作用。

綜上所述，茴香對(duì)CCl4復(fù)合酒精誘導(dǎo)肝纖維化小鼠具有治療作用，可以改善肝臟功能，保護(hù)肝細(xì)胞和緩解肝纖維化，減輕CCl4復(fù)合酒精誘導(dǎo)小鼠肝纖維化程度。