高仁浩，陳 歡，趙開軍，王海麗，成 俊，黃 芳*

枳術(shù)顆粒對功能性消化不良大鼠胃動力的改善作用

高仁浩1，陳 歡1，趙開軍2, 3，王海麗2, 3，成 俊2，黃 芳1*

1. 中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇 南京 211198 2. 南京中山制藥有限公司 江蘇省中藥經(jīng)典名方工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210046 3. 江蘇弘典中藥產(chǎn)業(yè)研究院有限公司 南京市臨床經(jīng)驗方現(xiàn)代化工程研究中心，江蘇 南京 210023

研究枳術(shù)顆粒對功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）大鼠的藥效及作用機制。復(fù)合因素造模法誘導(dǎo)大鼠FD模型，造模成功后給予枳術(shù)顆粒治療2周，觀察枳術(shù)顆粒對FD大鼠胃殘留率、小腸推進率、血清中胃泌素（gastrin，GAS）、胃饑餓素（growth hormone releasing peptide，Ghrelin）、降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）及生長抑素（somatostatin，SS）含量的影響；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法觀察胃竇組織、十二指腸組織病理變化；利用qRT-PCR檢測下丘腦及胃組織中、、、mRNA表達和胃及十二指腸組織中腎上腺素能受體β1（β1-adrenergic receptor，）、生長抑素受體（somatostatin receptor，）、胃饑餓素--乙酰轉(zhuǎn)移酶（ghrelin--acyltransferase，）、胃饑餓素受體（growth hormone secreting hormone receptor，）、酪氨酸激酶受體（c-kit protooncogene protein，）、干細胞因子（stem cell factor，）、鈣激活氯離子通道蛋白Anoctamin-1（）、肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，）mRNA表達；利用Western blotting檢測胃及十二指腸組織中C-kit、SCF蛋白表達。枳術(shù)顆?？梢燥@著降低FD大鼠胃殘留率（＜0.05），提高小腸推進率（＜0.01）；升高血清中Ghrelin、GAS含量（＜0.01），降低CGRP、SS含量（＜0.05、0.01）；升高下丘腦及胃竇組織中、mRNA表達水平（＜0.05、0.01），降低下丘腦及胃竇組織中、mRNA表達水平（＜0.01）；顯著升高胃及十二指腸組織SCF、C-kit蛋白表達水平（＜0.05、0.01），升高胃及十二指腸組織、、、、、、mRNA表達水平（＜0.05、0.01），降低mRNA表達水平（＜0.05、0.01）。枳術(shù)顆?？梢愿纳艶D大鼠的胃動力異常，其作用機制可能與調(diào)節(jié)腦腸肽水平、激活SCF/C-kit通路有關(guān)。

枳術(shù)顆粒；功能性消化不良；腦腸肽；Cajal間質(zhì)細胞；胃饑餓素

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是最常見的功能性胃腸道疾病之一，發(fā)病部位主要在胃十二指腸區(qū)域，癥狀包括上腹部疼痛或灼燒感，餐后飽脹感、早飽等，且通常無器質(zhì)性病變[1]。FD的發(fā)病機制尚未完全闡明，一般認為FD的發(fā)生是由于腸道和大腦之間的交流障礙而導(dǎo)致的胃腸道運動障礙，并多伴隨內(nèi)臟高敏反應(yīng)，胃腸道微生物群、免疫功能以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的失調(diào)[2]。目前西醫(yī)在藥物治療上常根據(jù)個體癥狀選用促胃動力藥、抑酸劑和中樞調(diào)節(jié)劑等[3]，但在臨床上反應(yīng)出藥物療效不顯著，且患者癥狀易復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。

中醫(yī)將FD歸屬于“胃痞”“胃脘痛”范疇，認為FD病位在胃腑，與肝、脾密切相關(guān)，肝氣郁結(jié)，侮脾犯胃促使機體中焦氣機升降失調(diào)，進而導(dǎo)致FD發(fā)病與復(fù)發(fā)[4]。大量臨床試驗研究表明，中醫(yī)對FD的治療有著療效顯著且預(yù)后良好的優(yōu)勢[5-7]。枳術(shù)顆粒由枳術(shù)丸原方基礎(chǔ)上改良劑型制成，有健脾消食、行氣化濕、消積散癖之功效，多適用于脾胃虛弱、食少不化、脘腹脹滿等病癥，臨床上枳術(shù)顆粒對FD、消化性潰瘍和慢性萎縮性胃炎具有良好的治療效果[8]，但其潛在的作用機制還有待進一步的探討。近年來的研究表明，中醫(yī)藥可通過改善Cajal間質(zhì)細胞（interstitial cell of Cajal，ICC）數(shù)量缺失及結(jié)構(gòu)紊亂，調(diào)節(jié)腦腸肽的含量及表達發(fā)揮促胃腸運動的作用[9]。因此，本研究通過碘乙酰胺ig法、改良郭氏夾尾刺激聯(lián)合不規(guī)則飲食法構(gòu)建FD大鼠模型，從腦腸肽和ICC 2個角度研究枳術(shù)顆粒對FD大鼠的治療作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級6日齡SD乳鼠50只，體質(zhì)量8～12 g，母鼠5只，用于提供母乳喂養(yǎng)乳鼠，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號SCXK（魯）2022 0006。動物飼養(yǎng)于中國藥科大學(xué)藥學(xué)動物實驗中心，溫度18～22 ℃，相對濕度55%～65%，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)中國藥科大學(xué)倫理委員會批準（批準號2022-09-029）。

1.2 藥品與試劑

枳術(shù)顆粒（批號220201）由南京中山制藥有限公司提供；多潘立酮（批號MCJ7073）購自西安楊森制藥有限公司；碘乙酰胺（批號H2114239）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；大鼠胃饑餓素（growth hormone releasing peptide，Ghrelin）ELISA試劑盒（批號F21284-A）、大鼠胃泌素（gastrin，GAS）ELISA試劑盒（批號F8501-A）、大鼠生長抑素（somatostatin，SS）ELISA試劑盒（批號F3369-A）、大鼠降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）ELISA試劑盒（批號F3366-A）均購自上海泛柯檢測技術(shù)有限公司；HiScript II QRT SuperMix for qPCR（批號R223-01）、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（批號Q712-02）、VeZol Reagent（批號R411-01）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號60004-1-Ig）、酪氨酸激酶受體（c-kit protooncogene protein，C-kit）抗體（批號18696-1-AP）、干細胞因子（stem cell factor，SCF）抗體（批號26582-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

5415R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；PB303-N型電子天平（德國Mettler Toledo公司）；MULTSKAN Sky全波長酶標儀、可調(diào)式移液器（美國Thermo Fisher Scientific公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、CFX96型逆轉(zhuǎn)錄儀、實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；顯影儀（上海天能科技有限公司）；Direct-Q3實驗室純水/超純水一體化系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

動物適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將10日齡SD乳鼠隨機分為對照組（10只）和造模組（40只），對照組ig 2%蔗糖溶液（0.2 mL/只），模型組ig 0.1%碘乙酰胺蔗糖溶液（0.2 mL/只），1次/d，連續(xù)6 d，造模期間交由母鼠正常哺乳喂養(yǎng)。正常飼養(yǎng)至大鼠3周齡斷奶，分籠。至大鼠7周齡，對造模組大鼠進行改良郭氏夾尾法和不規(guī)則喂養(yǎng)造模。夾尾應(yīng)激法每日實施2次，時間分別為每日9: 00、15: 00時，每次持續(xù)30 min，夾尾前使用自制棉布包裹塑料夾，在靠近大鼠尾端的三等分點處放置塑料夾進行夾尾刺激，激怒大鼠與籠內(nèi)其他大鼠打斗。若打斗過程中出現(xiàn)傷口，則用0.5%碘伏進行處理，造模時間為14 d，期間對造模組大鼠實施單日禁食不禁水，雙日給予足量食物及飲水的不規(guī)則飲食刺激。對照組大鼠則按照常規(guī)方式飼養(yǎng)，每日予以足量飲食飲水。

造模后將大鼠隨機分為模型組及枳術(shù)顆粒低、高劑量（1.75、7.00 g/kg）組和多潘立酮（3 mg/kg）組，每組10只。各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組及模型組ig等體積的單蒸水，1次/d，連續(xù)給藥2周。

2.2 大鼠體質(zhì)量及一般狀態(tài)觀察

改良郭氏夾尾法和不規(guī)則喂養(yǎng)造模及給藥期間每隔1天測定并記錄大鼠體質(zhì)量，觀察記錄大鼠的一般狀態(tài)。

2.3 樣本采集

末次給藥后，大鼠更換墊料，禁食不禁水16 h。取10 g羧甲基纖維素鈉溶于250 mL蒸餾水中，分別加入16 g奶粉、8 g糖、8 g淀粉和2 g活性炭粉，攪拌均勻制成炭墨營養(yǎng)半固體糊[10]。每只大鼠ig半固體糊3 mL，30 min后用巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血處死大鼠。全血室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min，取上清，儲存于?80 ℃冰箱。取大鼠下丘腦放入液氮快速冷凍后?80 ℃冰箱保存。結(jié)扎賁門和幽門，分離全胃，用濾紙拭干后稱定胃全質(zhì)量。之后沿胃大彎剪開胃體，用生理鹽水洗去內(nèi)容物后拭干稱定胃凈質(zhì)量。收集小腸，測定半固體糊狀物的推進距離和小腸全長。量取后每組剪取大鼠少部分胃竇組織及近幽門十二指腸置于4%多聚甲醛中固定，其余胃竇及十二指腸放入液氮快速冷凍后?80 ℃冰箱保存。

2.4 胃殘留率與小腸推進率的檢測

根據(jù)公式計算胃殘留率及小腸推進率。

胃殘留率＝(胃全質(zhì)量－胃凈質(zhì)量)/灌胃量

小腸推進率＝固體糊推進距離/小腸全長

2.5 ELISA法檢測大鼠血清腦腸肽含量

按照試劑盒說明書分別檢測大鼠血清中GAS、Ghrelin、CGRP、SS的含量。

2.6 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察胃竇及十二指腸組織病理變化

將固定在4%多聚甲醛溶液中的胃竇及十二指腸組織按照常規(guī)HE染色法進行脫水、包埋、切片、染色，中性樹膠封片后置于倒置顯微鏡下觀察組織病理變化并拍照。

2.7 qRT-PCR檢測胃竇及下丘腦組織中GAS、Ghrelin、CGRP、SS、腎上腺素能受體β1（β1-adrenergic receptor，ADRB1）、生長抑素受體（somatostatin receptor，SSTR）、胃饑餓素-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶（ghrelin-O-acyltransferase，GOAT）、胃饑餓素受體（growth hormone secreting hormone receptor，GHSR）、C-kit、SCF、鈣激活氯離子通道蛋白Anoctamin-1（ANO1）和肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）mRNA表達

取出?80 ℃保存的胃竇及下丘腦組織，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物由南京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

2.8 Western blotting檢測胃竇及十二指腸組織C-kit、SCF蛋白表達

分別稱取適量胃竇及十二指腸組織，剪碎并按照1∶10的比例加入RIPA強裂解液（含0.01%蛋白酶抑制劑），勻漿后靜置30 min，待充分裂解后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液。BCA法測定蛋白濃度，隨后加入Loading Buffer，沸水浴15 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜；次日TBST漂洗，加入二抗孵育，ECL顯影，采用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

表1 引物序列

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 枳術(shù)顆粒對FD大鼠一般狀況的影響

與對照組比較，模型組大鼠活動減少，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)枯燥，糞便稀軟；與模型組比較，各給藥組大鼠活動量增加，反應(yīng)相對較快，毛發(fā)潤澤度有所改善，糞便正常。如圖1所示，對照組大鼠體質(zhì)量正常升高，而造模大鼠體質(zhì)量增長速度明顯低于對照組（＜0.01）；與模型組比較，枳術(shù)顆粒治療后大鼠體質(zhì)量略有升高，但無顯著性差異。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖2同。

3.2 枳術(shù)顆粒對FD大鼠胃殘留率和小腸推進率的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠胃殘留率顯著升高（＜0.01），小腸推進率顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠胃殘留率顯著降低（＜0.05、0.01），小腸推進率顯著升高（＜0.01）。表明枳術(shù)顆?？梢杂行Т龠M胃排空及小腸蠕動，改善FD大鼠的胃腸動力。

圖2 枳術(shù)顆粒對FD大鼠胃動力的影響(, n = 8～10)

3.3 枳術(shù)顆粒對FD大鼠血清中腦腸肽含量的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中Ghrelin和GAS含量均顯著降低（＜0.01），CGRP和SS含量均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組Ghrelin和GAS含量顯著升高（＜0.01），CGRP和SS含量顯著降低（＜0.05、0.01）。表明枳術(shù)顆粒可以調(diào)節(jié)大鼠血清中腦腸肽的含量，從而調(diào)節(jié)大鼠腦腸之間的交流。

表2 枳術(shù)顆粒對FD大鼠血清中Ghrelin、GAS、CGRP和SS水平的影響(, n = 8)

與對照組比較：P＜0.05P＜0.01；與模型組比較：P＜0.05P＜0.01，下表同。

< 0.05P< 0.01control group;P< 0.05P< 0.01model group, same as below tables.

3.4 枳術(shù)顆粒對FD大鼠胃竇及十二指腸組織病理變化的影響

如圖3所示，對照組和各給藥組大鼠胃竇組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)均完整，黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層4層層次清楚；模型組黏膜層排列疏松，可見極少量炎癥細胞散在。對照組大鼠十二指腸組織絨毛及腺體結(jié)構(gòu)完整正常；各給藥組大鼠十二指腸組織少部分絨毛表面黏膜上皮脫落，腺體結(jié)構(gòu)完整正常；模型組大鼠十二指腸部分區(qū)域絨毛長度縮短，黏膜上皮扭曲呈鋸齒狀。結(jié)果顯示，各組大鼠胃竇和十二指腸組織結(jié)構(gòu)無器質(zhì)性病變，符合FD造模標準。

3.5 枳術(shù)顆粒對FD大鼠下丘腦及胃竇組織中Ghrelin、GAS、CGRP和SS mRNA表達的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組大鼠下丘腦組織中、mRNA表達水平顯著降低（＜0.01），、mRNA表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，枳術(shù)顆粒各劑量組和mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），mRNA表達水平顯著降低（＜0.01）；枳術(shù)顆粒高劑量組mRNA表達水平顯著降低（＜0.01）；多潘立酮組mRNA表達水平顯著升高（＜0.01），、mRNA表達水平顯著降低（＜0.01）。

黑色箭頭表示黏膜層排列疏松，紅色箭頭表示絨毛縮短。

表3 枳術(shù)顆粒對FD大鼠下丘腦組織中Ghrelin、GAS、CGRP和SS mRNA表達的影響(, n = 6)

如表4所示，與對照組比較，模型組大鼠胃竇組織、mRNA表達水平顯著降低（＜0.01），、mRNA表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），mRNA表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）；枳術(shù)顆粒高劑量組和多潘立酮組mRNA表達水平顯著降低（＜0.01），mRNA表達水平顯著降低（＜0.01）。表明枳術(shù)顆?？梢哉{(diào)節(jié)FD大鼠下丘腦及胃竇組織中腦腸肽基因的表達，提示枳術(shù)顆?？赡芡ㄟ^改善腦腸之間的交流障礙以增強大鼠胃腸道動力。

3.6 枳術(shù)顆粒對FD大鼠胃竇及十二指腸組織中ADRB1、SSTR、GOAT和GHSR mRNA表達的影響

如表5所示，與對照組比較，模型組大鼠胃竇組織中、、mRNA表達水平顯著降低（＜0.01），mRNA表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，枳術(shù)顆粒低劑量組mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）；枳術(shù)顆粒各劑量組、mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），mRNA表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）；多潘立酮組mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）。

如表6所示，與對照組比較，模型組大鼠十二指腸中、、mRNA表達水平顯著降低（＜0.01），mRNA表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組、mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），mRNA表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）；枳術(shù)顆粒低劑量組mRNA表達水平顯著升高（＜0.01）。表明枳術(shù)顆?？梢源龠M胃及十二指腸中Ghrelin的產(chǎn)生和作用，進而刺激ICC產(chǎn)生慢波，以增強大鼠胃腸動力。

表4 枳術(shù)顆粒對FD大鼠胃竇組織中Ghrelin、GAS、CGRP和SS mRNA表達的影響(, n = 6)

表5 枳術(shù)顆粒對FD大鼠胃竇組織中ADRB1、SSTR、GOAT和GHSR mRNA表達的影響(, n = 6)

表6 枳術(shù)顆粒對FD大鼠十二指腸組織中ADRB1、SSTR、GOAT和GHSR mRNA表達的影響(, n = 6)

3.7 枳術(shù)顆粒對FD大鼠胃竇和十二指腸組織中C-kit及SCF蛋白表達的影響

如圖4和表7所示，模型組大鼠胃竇和十二指腸組織中SCF、C-kit蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組胃竇組織中SCF、C-kit蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；枳術(shù)顆粒各劑量組十二指腸組織中C-kit蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05），枳術(shù)顆粒高劑量組和多潘立酮組十二指腸組織中SCF蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01）。表明枳術(shù)顆?？梢源龠MFD大鼠胃及十二指腸中ICC的增殖分化以增強大鼠胃腸動力。

3.8 枳術(shù)顆粒對FD大鼠胃竇及十二指腸組織中C-kit、SCF、ANO1和MLCK mRNA表達的影響

如表8所示，與對照組比較，模型組大鼠胃竇組織中、、、mRNA表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，枳術(shù)顆粒各劑量組、、、mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01），多潘立酮組、、mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）。

圖4 枳術(shù)顆粒對FD大鼠胃竇(A) 和十二指腸組織(B) 中SCF、C-kit蛋白表達的影響

表7 枳術(shù)顆粒對FD大鼠胃竇和十二指腸組織中SCF、C-kit蛋白表達的影響(, n = 3)

表8 枳術(shù)顆粒對FD大鼠胃竇組織中C-kit、SCF、ANO1和MLCK mRNA表達的影響(, n =6)

如表9所示，與對照組比較，模型組大鼠十二指腸中、、、mRNA表達水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，枳術(shù)顆粒各組、、mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），枳術(shù)顆粒高劑量組mRNA表達水平顯著升高（＜0.05），多潘立酮組mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）。表明枳術(shù)顆粒可能通過改善ICC的功能受損以治療FD大鼠胃腸運動延遲。

表9 枳術(shù)顆粒對FD大鼠十二指腸組織中C-kit、SCF、ANO1和MLCK mRNA表達的影響(, n =6)

4 討論

FD的發(fā)病機制復(fù)雜，目前普遍認為胃腸動力障礙及內(nèi)臟高敏感性是FD發(fā)生的主要病理機制。近年來，有關(guān)FD動物模型的造模方法也逐漸成熟，臨床上FD多見肝郁脾虛證型，該證型的動物模型構(gòu)建方法各異，但普遍認為多因素疊加刺激的造模方法能更好地模擬FD復(fù)雜的發(fā)病過程[11]。研究發(fā)現(xiàn)，碘乙酰胺ig法可輕度刺激新生兒時期大鼠的胃腸道，導(dǎo)致大鼠成年期的慢性胃過敏和運動紊亂[12]，該方法聯(lián)合夾尾刺激法能模擬FD大鼠內(nèi)臟高敏感、胃順應(yīng)性降低、胃排空延遲癥狀[13]。夾尾刺激法和不規(guī)則喂食法雙因素刺激可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)飲食不佳、大便糖稀、暴躁易怒等癥狀，常用于構(gòu)建中醫(yī)學(xué)中的肝郁脾虛證模型[14]。因此，本研究采用碘乙酰胺ig乳鼠，正常飼喂到大鼠成年再采用改良夾尾刺激法和飲食不節(jié)法繼續(xù)造模，以復(fù)制大鼠FD模型。結(jié)果顯示，與對照組比較，造模后大鼠精神萎靡，倦怠，毛發(fā)干枯呈暗黃色，大便稀溏呈黃綠色，活動減少，反應(yīng)遲鈍且煩躁易怒。通過觀察大鼠胃殘留率、小腸推進率及胃腸組織結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)造模后大鼠胃腸動力顯著降低，組織結(jié)構(gòu)均無明顯病變，證明FD大鼠造模成功。經(jīng)過枳術(shù)顆粒治療后，大鼠胃殘留率顯著降低、小腸推進率顯著升高，提示大鼠胃腸道動力得到了明顯改善。

羅馬IV研究共識中強調(diào)，腦-腸軸（brain-gut axis，BGA）功能障礙為功能性胃腸?。╢unctional gastrointestinal disorders，F(xiàn)GID）的生物學(xué)基礎(chǔ)[15]。BGA包括中樞神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)（central nervous system，CNS）、自主神經(jīng)系統(tǒng)（autonomic nervous system，ANS）、腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS)、下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）等結(jié)構(gòu)。BGA的調(diào)節(jié)功能主要表現(xiàn)在ANS將腸道內(nèi)的信息（如化學(xué)、機械和疼痛等）通過ENS、脊髓神經(jīng)和迷走神經(jīng)傳遞到CNS；同時，CNS也通過ANS調(diào)控胃腸道的運動、感覺和分泌功能[16]。BGA正常的調(diào)控作用有賴于兼有神經(jīng)遞質(zhì)和激素雙重作用的腦腸肽。腦腸肽作為腦和胃腸道中雙重分布的小分子多肽類物質(zhì)，調(diào)節(jié)著胃腸運動、分泌、吸收等功能[17]。GAS是由胃和十二指腸中胃泌素細胞分泌的腦腸肽，可刺激胃壁細胞促進胃酸分泌，增強胃腸動力[18]。Ghrelin主要由胃底X/A細胞產(chǎn)生，可與GHSR結(jié)合刺激機體對食物的攝入，促進胃酸分泌及胃腸蠕動，加快胃排空及小腸轉(zhuǎn)運速度[19]。CGRP參與胃腸生理功能的調(diào)節(jié)及疼痛的傳遞，被推測可能與FD患者的腹痛和噯氣癥狀相關(guān)[20]。SS可以抑制胃腸道激素的釋放，抑制胃腸道蠕動，并減少平滑肌收縮[21]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中Ghrelin、GAS含量下降，CGRP、SS含量升高，下丘腦及胃竇組織中、基因表達水平下降，、基因表達水平升高，提示模型大鼠胃腸道運動障礙可能與胃腸道和大腦之間的交流障礙有關(guān)。給予枳術(shù)顆粒治療后，F(xiàn)D大鼠血清中Ghrelin、GAS含量及組織中、基因表達水平均顯著升高，CGRP、SS的含量及基因表達水平則出現(xiàn)顯著降低。結(jié)果表明枳術(shù)顆?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)FD大鼠的腦腸肽水平，改善BGA紊亂而達到增強FD大鼠胃腸動力的治療作用。

ICC位于胃腸道的神經(jīng)末梢和平滑肌細胞之間，作為胃腸道運動的起搏細胞發(fā)揮關(guān)鍵作用。ICC可以產(chǎn)生電慢波，慢波去極化傳導(dǎo)到平滑肌細胞，從而使胃腸正常蠕動收縮，而FD是ICC功能障礙相關(guān)的代表性疾病之一[22]。ICC通過神經(jīng)遞質(zhì)和激素的多種受體刺激而發(fā)揮作用，如毒蕈堿乙酰膽堿M3受體、血清素5-HT3受體以及G蛋白偶聯(lián)受體[23-24]。腎上腺素和生長抑素已被證實能夠影響生長素釋放肽的產(chǎn)生和分泌，其中ADRB1的激活能夠促進Ghrelin的釋放，而激活SSTR能抑制Ghrelin的釋放[25]。釋放出的Ghrelin可經(jīng)GOAT催化，轉(zhuǎn)化為活性形式與ICC上的GHSR結(jié)合[26]。GHSR是一種G蛋白偶聯(lián)受體，可激活細胞膜上的磷脂酶C，誘導(dǎo)產(chǎn)生肌醇三磷酸（inositol 1,4,5-triphosphate，IP3），IP3刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+[27]，進而激活I(lǐng)CC衍生電慢波。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠胃竇及十二指腸組織中、和基因表達顯著下降，基因表達顯著升高，而枳術(shù)顆?？梢燥@著改善這一現(xiàn)象，提示枳術(shù)顆?？赡艽龠M了腦腸肽Ghrelin的分泌和乙?；?，使其作用于ICC上的GHSR，進而刺激了ICC產(chǎn)生電慢波而達到增強胃腸動力的作用。

C-kit是一種酪氨酸激酶受體，常用作ICC的生物標記物，通過與其配體SCF結(jié)合，促進ICC的發(fā)育和表型分化[28]。鄧靜等[29]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過枳實的治療后FD大鼠胃竇組織中ICC數(shù)量增多，SCF和C-kit表達上調(diào)，提示枳實促胃動力可能與激活SCF/C-kit信號通路、促進ICC的增殖有關(guān)。結(jié)果顯示，模型組大鼠胃竇、十二指腸組織中的SCF、C-kit蛋白及基因表達水平顯著下降，在高劑量枳術(shù)顆粒治療下，組織中蛋白及基因表達水平均得到顯著改善，提示枳術(shù)顆粒可能是通過激活SCF/C-kit通路，促進ICC細胞的增殖分化進而增強大鼠的胃腸道動力。ANO1是一種鈣離子激活氯離子通道，細胞內(nèi)局部鈣離子濃度升高可激活該氯離子通道，驅(qū)動胞內(nèi)氯離子外流，從而產(chǎn)生大量內(nèi)向電流，在ICC的起搏活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用[30]。MLCK廣泛分布于肌肉組織中，通過催化肌球蛋白輕鏈的磷酸化，促使肌動蛋白沿著肌動蛋白絲滑動，從而使腸道平滑肌收縮[31]。結(jié)果顯示，模型組大鼠胃竇及十二指腸組織中的、基因表達水平顯著下降，而枳術(shù)顆?？梢悦黠@改善這一現(xiàn)象，提示枳術(shù)顆粒促進了ICC的起搏活動和平滑肌的收縮（圖5）。

圖5 枳術(shù)顆粒改善胃腸道功能異常機制圖

綜上，枳術(shù)顆?？梢哉{(diào)節(jié)FD大鼠的腦腸肽水平，增強FD大鼠的胃腸動力。枳術(shù)顆粒的治療作用可能是通過增強Ghrelin對ICC的刺激作用、激活SCF/C-kit通路促進ICC增殖分化2方面實現(xiàn)的。本研究為枳術(shù)顆粒在改善胃腸道動力障礙方面提供了實驗依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Zhizhu Granules on improving gastric motility in rats with functional dyspepsia

GAO Renhao1, CHEN Huan1, ZHAO Kaijun2, 3, WANG Haili2, 3, CHENG Jun2, HUANG Fang1

1. School of Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China 2. Jiangsu Classical Prescriptions of Traditional Chinese Medicine Engineering Technology Research Center, Nanjing Zhongshan Pharmaceutical Co., Ltd., Nanjing 210046, China 3. Nanjing Clinical Experience Prescription Modernization Engineering Research Center, Jiangsu Hongdian Research Institute of Traditional Chinese Medicine Industry Co., Ltd., Nanjing 210023, China

To study the efficacy and mechanism of Zhizhu Granules (枳術(shù)顆粒) on functional dyspepsia (FD) rats.A composite factor modeling method was used to induce FD model in rats. After successful modeling, rats were treated with Zhizhu Granules for two weeks. The effects of Zhizhu Granules on gastric residual rate, small intestinal propulsion rate, serum gastrin (GAS), growth hormone releasing peptide (Ghrelin), calcitonin gene related peptide (CGRP) and somatostatin (SS) contents in FD rats were observed; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of gastric antrum tissues and duodenal tissues. The mRNA expressions of,,andin hypothalamus and gastric tissues, mRNA expressions of β1-adrenergic receptor (), somatostatin receptor (), ghrelin--acetyltransferase (), growth hormone secreting hormone receptor (), c-kit protooncogene protein (), stem cell factor (), anoctamin-1 (), myosin light chain kinase () in gastric tissues and duodenal tissues were detected by qRT-PCR; Western blotting was used to detect the protein expressions of C-kit and SCF in gastric tissues and duodenal tissues.Zhizhu Granules could significantly reduce the gastric residual rate (< 0.05), increase the small intestine propulsion rate (< 0.01), increase the contents of Ghrelin and GAS in serum (< 0.01), reduce the contents of CGRP and SS (< 0.05, 0.01), increase the expression levels ofandmRNA in hypothalamus and gastric antrum tissues (< 0.05, 0.01), decrease the expression levels ofandmRNA in hypothalamus and gastric antrum tissues (< 0.01), significantly increase the expression levels of SCF and C-kit proteins in gastric tissues and duodenal tissues (< 0.05, 0.01), increase the expression levels of,,,,,andmRNA in gastric tissues and duodenal tissues (< 0.05, 0.01), and reducemRNA expression level (< 0.05, 0.01).Zhizhu Granules can improve gastric motility abnormalities in FD rats, and its mechanism may be related to regulating brain gut peptide level and activating SCF/C-kit pathway.

Zhizhu Granules; functional dyspepsia; brain gut peptide; interstitial cell of Cajal; Ghrelin

R285.5

A

0253 - 2670(2024)08 - 2620 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.013

2023-12-14

企業(yè)知識產(chǎn)權(quán)戰(zhàn)略推進計劃項目（ZT20210180-33）

高仁浩（1998—），男，碩士研究生，研究方向為中藥藥理學(xué)。E-mail: 812240613@qq.com

通信作者：黃 芳（1971—），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail: chengtianle007@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]