黃廣文,黃明珠,2,劉斌,陳雪嵐,2*

1(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 國(guó)家淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)專(zhuān)業(yè)中心,江西 南昌, 330027)2(江西師范大學(xué) 健康學(xué)院,江西 南昌, 330027)

蝦青素(astaxanthin)是一種具有酮式結(jié)構(gòu)的類(lèi)胡蘿卜素,β-胡蘿卜素與天然蝦青素結(jié)構(gòu)大體一致,由一條長(zhǎng)的共軛雙鍵碳鏈和兩端α-羥基酮的六元環(huán)組成,共軛雙鍵碳鏈?zhǔn)怯?個(gè)異戊二烯結(jié)構(gòu)組成。蝦青素的抗氧化能力是維生素E的550倍,β-胡蘿卜素的10倍。正因?yàn)槲r青素超強(qiáng)的抗氧化能力,可以去除因陽(yáng)光或細(xì)胞老化產(chǎn)生的氧化自由基,從而保護(hù)人體的眼睛和皮膚,降低太陽(yáng)輻射對(duì)人體的傷害,防止心臟的血管老化、預(yù)防癌癥和老年癡呆等。蝦青素在保健品、化妝品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,這使得蝦青素的市場(chǎng)需求與日俱增。

目前,研究的主流方向是以微生物作為生產(chǎn)者,利用代謝工程手段獲得高產(chǎn)蝦青素的工程菌,常用的微生物有解脂耶氏酵母、大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌等。與化學(xué)合成法相比,微生物生產(chǎn)具有結(jié)構(gòu)明確、副產(chǎn)物少、對(duì)環(huán)境無(wú)污染,培養(yǎng)時(shí)間短,生產(chǎn)成本價(jià)格低廉,可以在發(fā)酵罐中,以超高的密度進(jìn)行培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)。

本文綜述了蝦青素的生物功能及其應(yīng)用、蝦青素的來(lái)源,并對(duì)蝦青素合成途徑及如何利用合成生物學(xué)提高微生物蝦青素積累的方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹,其目的是為蝦青素的高效合成研究提供一定的參考。

1 蝦青素的生物學(xué)功能及其應(yīng)用

科研人員一直都在研究具有抗氧化成分的物質(zhì)。從起初的維生素類(lèi)物質(zhì),到第二代擁有抗氧化功效的物質(zhì),如β-胡蘿卜素、過(guò)氧化物歧化酶、輔酶Q10等,再到近年來(lái)較為熱門(mén)的第三代抗氧化物質(zhì),如葡萄籽、花青素、藍(lán)莓提取物、番茄紅素、綠茶素等。目前最新的抗氧化成分即為蝦青素,也是第四代抗氧化成分。蝦青素極強(qiáng)的抗氧化能力使其在醫(yī)藥、食品及養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[1]。

1.1 醫(yī)藥中的應(yīng)用

在人體視網(wǎng)膜中富含不飽和脂肪酸,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中同樣也富含不飽和脂肪酸,氧化產(chǎn)生的自由基非常容易使視網(wǎng)膜細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生過(guò)氧化導(dǎo)致機(jī)體損傷[2]。有研究表明,蝦青素因?yàn)榫哂蟹侨苡谒奶厥夥肿訕?gòu)造很容易穿過(guò)細(xì)胞膜和血腦屏障[3],通過(guò)強(qiáng)力清除氧化自由基,保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng),最終起到保護(hù)大腦的作用[4],有效治療由于氧化自由基引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,如缺血再灌注損傷、脊髓損傷、帕金森綜合征等[5];通過(guò)直接清除掉細(xì)胞內(nèi)的氧化自由基,可以有效增強(qiáng)細(xì)胞的再生能力,維持人體機(jī)能平衡,并且減少體內(nèi)衰老細(xì)胞的積累,由內(nèi)而外保護(hù)細(xì)胞和DNA的健康;清除體內(nèi)細(xì)胞中的氧化自由基,防止損傷視網(wǎng)膜中的視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞[6]。另外,蝦青素治療視網(wǎng)膜黃斑變性的效果好于使用葉黃素治療的效果。蝦青素可克服因抗血小板藥物導(dǎo)致凝血功能的障礙,在美國(guó),已經(jīng)有公司將蝦青素作為藥物來(lái)研發(fā),其目的是防止腦梗塞后再次梗塞[7]。

1.2 食品中的應(yīng)用

脂溶性的蝦青素呈現(xiàn)出自然的艷麗紅色,具有著色力強(qiáng)、安全無(wú)害、用量不多、無(wú)異味、口感佳的特點(diǎn),被廣泛用于保健品、食用油脂、冰淇淋、糖果及調(diào)料的著色等,尤其是含脂類(lèi)較多的食品[8]。

蝦青素不僅充當(dāng)優(yōu)質(zhì)色素,還因其增強(qiáng)免疫、抗衰老等[9-10]作用而充當(dāng)保健品中的功能成分;因其極強(qiáng)的抗氧化性能,蝦青素能保持食品的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞,從而充當(dāng)了食品的保鮮、保味及保質(zhì)成分[11]。在日本,蝦青素通常被看作一種功能性食品添加劑,常常用來(lái)浸泡水果、海藻和蔬菜,同時(shí)蝦青素也作為蔬菜的紅色染料來(lái)使用[12]。

1.3 養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用

在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面,將蝦青素作為激素可以促進(jìn)魚(yú)卵受精,減少胚胎死亡率,加快個(gè)體生長(zhǎng),增加魚(yú)類(lèi)成熟速度[13]。在魚(yú)餌料中添加產(chǎn)蝦青素的紅法夫酵母碎片,鮭魚(yú)和鱘魚(yú)食用餌料后,蝦青素通常會(huì)積累在魚(yú)類(lèi)的皮膚和魚(yú)肉中,使魚(yú)呈現(xiàn)出紅色[14]。這些魚(yú)和不食用蝦青素的魚(yú)類(lèi)相比,呈現(xiàn)出較鮮艷的色澤,營(yíng)養(yǎng)豐富,口感更出色,在歐美市場(chǎng)很受消費(fèi)者的喜愛(ài)。顯然,富含蝦青素的魚(yú)的價(jià)格也要比普通魚(yú)更昂貴。但由于極大的市場(chǎng)需求,鱘魚(yú)和鮭魚(yú)在歐美國(guó)家的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展仍然很迅速。蝦青素在紅鮭魚(yú)體內(nèi)的含量要達(dá)到5～20 mg/kg鮮重,含有蝦青素濃度為40～150 mg/kg的餌料是紅鮭魚(yú)食用餌料的基本標(biāo)準(zhǔn),這樣一來(lái)紅鮭魚(yú)每年需要的蝦青素可達(dá)數(shù)十萬(wàn)噸,總價(jià)值超數(shù)億美元。我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速,添加蝦青素的飼料生產(chǎn)高檔水產(chǎn)品,有著十分廣闊的前景[15]。

蝦青素不僅可以用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,也可以用在禽業(yè)養(yǎng)殖中。研究表明,在雞的飼料中加入2.95%的紅法夫酵母來(lái)補(bǔ)充蝦青素,蛋黃會(huì)因蝦青素的增加使其特征吸收峰從571 nm 紅移到593 nm,遠(yuǎn)高于使用10.85%黃玉米為飼料的紅移,添加高濃度的黃玉米僅僅從571 nm紅移到575 nm[16]。添加了蝦青素的飼料能促進(jìn)家禽的生長(zhǎng),提高家禽的產(chǎn)蛋率,肉禽的皮膚、腳、喙也都呈現(xiàn)出消費(fèi)者喜愛(ài)的金黃色。蝦青素的添加能提高各種蛋和肉的商品價(jià)值。因此,蝦青素的使用能對(duì)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展起到有效的促進(jìn)作用[17]。

2 蝦青素的來(lái)源

目前國(guó)內(nèi)和國(guó)外制備蝦青素的方法有2類(lèi):一種是運(yùn)用化學(xué)合成法獲得蝦青素?；瘜W(xué)合成法是利用化工原材料或角黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)和葉黃素等類(lèi)胡蘿卜素制備蝦青素;但是化學(xué)合成法副產(chǎn)物多,結(jié)構(gòu)不明確,對(duì)環(huán)境不友好,其產(chǎn)品主要用做工業(yè)原料[18]。另一種方法是從藻類(lèi)、酵母和水生動(dòng)物中分離獲得天然蝦青素,這種來(lái)源獲取可以克服化學(xué)制備法的缺陷,且獲取的天然蝦青素可以作為食品添加劑使用[19]。

2.1 藻類(lèi)生產(chǎn)蝦青素

隨著生物技術(shù)發(fā)展,微藻的應(yīng)用范圍逐步從飼料向食品及藥品發(fā)展,從生產(chǎn)簡(jiǎn)單的生物物質(zhì)到生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)品邁進(jìn)。如雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)[20]和杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)[21]可以合成蝦青素和蝦青素前體β-胡蘿卜素,藍(lán)藻(cyanobacteria)[22]通過(guò)引入外源蝦青素的基因也可以成為蝦青素的生產(chǎn)宿主。雨生紅球藻是一種單細(xì)胞淡水微藻[23],分布在全球許多水生環(huán)境中,被認(rèn)為是最豐富且最有前途的天然蝦青素商業(yè)生產(chǎn)來(lái)源之一[24],成熟期其胞內(nèi)蝦青素含量約占胞內(nèi)類(lèi)胡蘿卜素總量的90%[25],重量可以達(dá)細(xì)胞干重的7%[26]。杜氏鹽藻是一種生存在海洋中的藻類(lèi),能夠產(chǎn)生β-胡蘿卜素,可通過(guò)代謝工程手段改造杜氏鹽藻來(lái)合成蝦青素[21]。藍(lán)藻可以利用太陽(yáng)能和CO2來(lái)合成有機(jī)物質(zhì),被認(rèn)為是可再生的微生物細(xì)胞工廠,其特點(diǎn)是培養(yǎng)簡(jiǎn)單、易于基因操作和相對(duì)明確的遺傳背景,通過(guò)代謝工程改造用來(lái)生產(chǎn)高價(jià)值的蝦青素[22]。

2.2 酵母生產(chǎn)蝦青素

除了藻類(lèi),蝦青素也能從酵母中合成。紅法夫酵母(Phaffiarhodozyma)[19]是一種耐寒擔(dān)子菌酵母。蝦青素是其主要合成的類(lèi)胡蘿卜素。研究發(fā)現(xiàn),在該菌中,蝦青素約占總類(lèi)胡蘿卜素的84%[27],其可利用多種糖類(lèi)作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝,不需光照,培養(yǎng)時(shí)間短,可在發(fā)酵罐進(jìn)行超高密度的培養(yǎng);且該菌細(xì)胞含有17%的脂類(lèi)物質(zhì),蝦青素是屬于脂溶性的,可以更加均勻地分布于細(xì)胞質(zhì)中,有利于蝦青素在細(xì)胞內(nèi)的儲(chǔ)存[19];酵母提取蝦青素后,其副產(chǎn)物含有豐富的蛋白質(zhì)、酯類(lèi)和維生素B等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),可作為富含營(yíng)養(yǎng)的飼料添加劑使用。

2.3 原核生物生產(chǎn)蝦青素

部分原核生物中亦存在蝦青素前體物質(zhì)合成途徑,可以合成蝦青素前體β-胡蘿卜素、番茄紅素以及蝦青素前體異戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)。因?yàn)榇嬖谶@些前體,添加外源蝦青素基因可以實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)蝦青素。作為常用的外源基因表達(dá)宿主——大腸桿菌,大腸桿菌是應(yīng)用最多、最成功的一種表達(dá)體系,大腸桿菌的遺傳背景很清晰,操作技術(shù)與培養(yǎng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單。將外源的蝦青素合成基因引入到大腸桿菌中,使大腸桿菌成功生產(chǎn)出蝦青素[28-29]。谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是在20世紀(jì)50年代首次被發(fā)現(xiàn)的一種天然可以生產(chǎn)谷氨酸的革蘭氏陽(yáng)性菌。近幾十年,已成為上百萬(wàn)噸的各種氨基酸的生產(chǎn)菌株,用于飼料和食品工業(yè)中。谷氨酸棒桿菌可以合成番茄紅素,番茄紅素是蝦青素的前體物質(zhì),重組谷氨酸棒桿菌的末端工程可構(gòu)建蝦青素合成途徑。因此,谷氨酸棒桿菌這種無(wú)毒的典型工業(yè)微生物具有生產(chǎn)蝦青素的巨大潛力[30]。

8.牛呼吸道合胞體病毒感染。剖檢可見(jiàn)肺出現(xiàn)彌漫性水腫或氣腫，間質(zhì)性肺炎灶，并見(jiàn)大小不等的肝變區(qū)；繼發(fā)細(xì)菌性支氣管肺炎時(shí)，肺前腹側(cè)區(qū)域呈現(xiàn)暗紅色、堅(jiān)實(shí)、有纖維素覆蓋和實(shí)變。

3 蝦青素合成途徑

上述不同來(lái)源菌種依靠其自身產(chǎn)蝦青素的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)蝦青素的需求。要實(shí)現(xiàn)高產(chǎn),通常需要對(duì)微生物進(jìn)行工程改造,改造的前提是要清晰了解其合成途徑。

生物生產(chǎn)蝦青素的過(guò)程可分成3個(gè)階段[19],第一階段稱(chēng)為中心碳代謝循環(huán)階段(圖1-a),第二階段稱(chēng)為蝦青素前體物質(zhì)合成階段,蝦青素前體物質(zhì)異戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸的合成(圖1-b),第三階段為蝦青素合成階段(圖1-c)。

a-中心碳代謝循環(huán)階段。葡萄糖經(jīng)過(guò)糖酵解和磷酸戊糖途徑生成甘油三磷酸(G3P)、丙酮酸(pyruvate)和乙酰輔酶A(acyl-CoA);b-蝦青素前體物質(zhì)合成階段。MVA 途徑多存在于真核生物及古生菌。MEP 途徑常存在于植物及大多數(shù)細(xì)菌中;c-蝦青素合成階段。IPP和DMAPP作為類(lèi)胡蘿卜素前體合成蝦青素圖1 蝦青素生物合成代謝路徑圖Fig.1 Astaxanthin bioanabolic pathway注:AcAcCoA,乙酰乙酰輔酶 A;HMG-CoA,羥甲基戊二酰輔酶A;Mevalonate,甲羥戊酸;Mevalonate-5P,甲羥戊酸-5-磷酸;Mevalonate-5PP,甲羥戊酸二磷酸;DXP,1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸鹽;CDP-ME,4-二磷酸胞基-2-甲基赤蘚糖醇;CDP-MEP,4-二磷酸胞苷基-2-甲基赤蘚糖醇2-磷酸酯;ME-cPP,2-甲基赤蘚糖醇2,4-環(huán)焦磷酸鹽;HMBPP,4-羥基-3-甲基丁-2-烯基焦磷酸鹽;GGPP,牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸;Phytoene,八氫番茄紅素; Lycopene,番茄紅素;β-Carotene,β-胡蘿卜素。

3.1 中心碳代謝循環(huán)階段

第一階段的中心碳代謝循環(huán)是生物通過(guò)糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑消耗葡萄糖和果糖等碳源,合成大量的甘油三磷酸(G3P)、丙酮酸(pyruvate)和乙酰輔酶A(acyl-CoA)[31]。作為蝦青素合成的碳源, 甘油三磷酸、丙酮酸和乙酰輔酶A將會(huì)合成IPP和DMAPP流入下一個(gè)合成蝦青素的途徑中[32]。部分乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán),生成生物生存所必須的能量、糖類(lèi)、脂類(lèi)、氨基酸等物質(zhì)。合成的ATP、NADPH等供能物質(zhì)流向細(xì)胞代謝中,不僅為生物的生存提供了能量,也為蝦青素的合成提供了能量[33]。

3.2 蝦青素前體物質(zhì)合成階段

第二階段是蝦青素的前體異戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸合成。甲羥戊酸途徑(mevalonate,MVA)和甲基赤藻糖醇磷酸(mevalonate pathway,MEP)途徑是IPP和 DMAPP合成的2種天然的合成途徑[33]。MVA途徑(圖1-b中綠色箭頭)主要存在于古生菌、酵母及少部分的革蘭氏陽(yáng)性菌,也是這些生物體內(nèi)形成 IPP的唯一途徑[34];MEP途徑則存在于藻類(lèi)和大部分細(xì)菌中,在植物體內(nèi)也有此途徑存在[35]。IPP和DMAPP可由細(xì)菌、藻類(lèi)、酵母及植物中的 MVA途徑和 MEP途徑產(chǎn)生[36]。

在 MVA途徑中,乙酰輔酶A通過(guò)圖1中的6個(gè)蛋白酶:乙酰CoA-酰基轉(zhuǎn)移酶(acetyl-CoA acetyltransferase,AtoB)、3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA synthase,ERG13)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase,tHMG1)、甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase,ERG12)、磷酸甲羥戊酸激酶(phosphomevalonatekinase,ERG8)和甲羥戊酸二磷酸脫羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MVD1)合成IPP[20]。通過(guò)異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶異構(gòu)化反應(yīng),IPP生成同分異構(gòu)體DMAPP。

在MEP途徑(圖1-b中黃色箭頭)中,甘油三磷酸和丙酮酸分子經(jīng)過(guò)縮合及異構(gòu)化反應(yīng)形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸酯(1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate,DXP),由1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)參與催化。MEP再與三磷酸胞苷偶聯(lián)后經(jīng)過(guò)一系列的磷酸化反應(yīng)形成 IPP,這些磷酸酶分別是D-核糖醇-5-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶(D-ribitol-5-phosphate cytidylyltransferase,IspD)、4-(胞苷5′-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶[4-(cytidine 5′-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase,IspE]、2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸合酶(2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase,IspF)、(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶[(E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase (flavodoxin),IspG]、4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase,IspH)。在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)的作用下,IPP可與DMAPP互相轉(zhuǎn)化[37]。

3.3 蝦青素合成階段

第三階段是蝦青素的合成[38]。在牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,CrtE)的作用下,IPP或DMAPP被催化成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸。牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸在八氫番茄紅素合酶(phytoene synthase,CrtB)和八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,CrtI)2種酶的催化下,縮合形成番茄紅素。番茄紅素在番茄紅素β-環(huán)化酶(lycopene beta-cyclase,CrtY)催化下合成蝦青素的前體 β-胡蘿卜素。合成蝦青素的最后一步在不同生物體內(nèi)略有不同,但主要都是通過(guò)β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene hydroxylase,CrtZ)和β-胡蘿卜素酮醇酶(β-carotene ketolase,CrtW)催化β-胡蘿卜素來(lái)合成蝦青素的。

4 蝦青素合成細(xì)胞工廠的構(gòu)建及構(gòu)建策略

4.1 擴(kuò)大前體池增加蝦青素產(chǎn)量

在蝦青素前體合成階段,MEP途徑和MVP途徑最終都可以合成蝦青素的2種前體物質(zhì)IPP和DMAPP。HEIDER等[30]研究谷氨酸棒桿菌產(chǎn)蝦青素的過(guò)程中,將谷氨酸棒桿菌中的dxs單獨(dú)過(guò)表達(dá),蝦青素前體物質(zhì)中的番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到0.08 mg/g DCW,相比較沒(méi)過(guò)表達(dá)dxs之前,番茄紅素產(chǎn)量增加了2倍,而單獨(dú)過(guò)表達(dá)idi的菌株同樣也可以使番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到0.08 mg/g DCW,增加2倍的番茄紅素產(chǎn)量,但是在谷氨酸棒桿菌中同時(shí)過(guò)表達(dá)dxs和idi并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)疊加的效果。由于idi負(fù)責(zé)IPP和DMAPP的相互轉(zhuǎn)化,在大部分生物中都以IPP為前體,在消耗完IPP后,idi活性越高,DMAPP轉(zhuǎn)化為IPP的速度就會(huì)越快,因此idi成為了MEP途徑中的一個(gè)限速酶,過(guò)表達(dá)idi可以減少2種前體之間的比例發(fā)生劇烈變化而影響蝦青素的合成。在過(guò)表達(dá)idi的基礎(chǔ)上構(gòu)建了完整的蝦青素通路,蝦青素產(chǎn)量為0.1 mg/g DCW,由于產(chǎn)量較低,通過(guò)進(jìn)一步過(guò)表達(dá)蝦青素合成基因crtE、crtB、crtI、crtY、crtW、crtZ,最終使蝦青素產(chǎn)量達(dá)到了1.2 mg/g DCW,除了打開(kāi)限速酶的限速,擴(kuò)大整體的代謝通量可以顯著增加蝦青素的最終產(chǎn)量。

引入外源的前體供應(yīng)途徑可以增加IPP和DMAPP的產(chǎn)量,可以使蝦青素產(chǎn)量提高,以生產(chǎn)β-胡蘿卜素為例,MA等[41]在改造解脂耶氏酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的研究中引入外源的異戊烯醇利用途徑(isopentenol utilization pathway,IUP),表達(dá)膽堿激酶(choline kinase,CK)和異戊烯基磷酸激酶(isopentenyl phosphate kinase,IPK),IUP 途徑以異戊烯醇的同分異構(gòu)體異戊二烯醇或戊烯醇為底物,經(jīng)過(guò)兩步磷酸化酶反應(yīng)有效地增加了蝦青素前體IPP和DMAPP,最終使解脂耶氏酵母的β-胡蘿卜素產(chǎn)量從3.43 g/L增加到4.22 g/L,β-胡蘿卜素作為蝦青素合成前體,其β-胡蘿卜素產(chǎn)量的提高對(duì)于蝦青素產(chǎn)量的增加具有指導(dǎo)意義。

XIE等[42]在解脂耶氏酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的研究中發(fā)現(xiàn)番茄紅素底物抑制作用,過(guò)量的番茄紅素抑制了番茄紅素環(huán)化酶的活性,導(dǎo)致番茄紅素被積累,不能快速地轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素,最終影響蝦青素的生產(chǎn)。XIE等[42]研究發(fā)現(xiàn)雙功能番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合成酶(bifunctional lycopene cyclase/phytoene synthase,CarRP)是一種雙功能酶,擁有番茄紅素環(huán)化酶活性的P區(qū)和番茄紅素β-環(huán)化酶活性的R區(qū),將R區(qū)的序列進(jìn)行隨機(jī)突變后,篩選出有效去除番茄紅素底物抑制的最佳突變位點(diǎn)Y27R,β-胡蘿卜素在類(lèi)胡蘿卜素總量的占比從18%提升到了98%,有效地去除了番茄紅素底物抑制。他們還從另一種角度出發(fā),在不去除番茄紅素底物抑制的情況下,用限制代謝流的方法緩解底物抑制,控制番茄紅素前體GGPP生成的量,使番茄紅素生成的量低于觸發(fā)底物抑制水平的量,間接地去除了番茄紅素底物抑制,增加了β-胡蘿卜素的產(chǎn)量,最終通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)使其產(chǎn)量達(dá)到了39.5 g/L,比初始菌株提高了1 441倍,解除代謝中間體的反饋抑制效應(yīng),可以顯著提高蝦青素前體β-胡蘿卜素的產(chǎn)量,對(duì)蝦青素的生產(chǎn)同樣具有指導(dǎo)意義。

4.2 級(jí)聯(lián)酶增加反應(yīng)速率

圖1顯示,從β-胡蘿卜素到蝦青素合成過(guò)程中要經(jīng)歷7種中間產(chǎn)物[43],分別是海膽酮(echinenone)、角黃素(canthaxanthin)、金盞花紅素(adonirubin)、羥基海膽酮(hydroxyechinenone)、β-隱黃質(zhì)(β-cryptoxanthin)、玉米黃質(zhì)(zeaxanthin)、阿多尼紅素(adonixanthin)。如此多的中間產(chǎn)物生產(chǎn)線影響了蝦青素最終產(chǎn)量。為縮短中間產(chǎn)物與催化酶之間的距離, HENKE等[43]在谷氨酸棒桿菌產(chǎn)蝦青素的研究中使用了一種簡(jiǎn)單的方法將酶連接在一起,即在β-胡蘿卜素羥化酶和β-胡蘿卜素酮醇酶之間連上一段Linker,拉近了酶與底物的距離,最終使蝦青素產(chǎn)量達(dá)到了3.1 mg/g DCW,相比改造前產(chǎn)量提高了7倍。

KANG等[44]在大腸桿菌產(chǎn)蝦青素的研究中采用Mi3(一種球狀蛋白籠)作為支架,將MVP途徑中的3個(gè)酶AtoB、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-synthase,HmgS)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase,HmgR)通過(guò)SpyCatcher和SpyTag固定在Mi3表面,使酶與底物的距離拉近。結(jié)果顯示,異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)使最終蝦青素前體物質(zhì)番茄紅素效價(jià)達(dá)151.6 mg/L,是原始菌株的8.5倍。SUN等[45]通過(guò)模仿模塊化聚酮合成酶(modular polyketide synthases,PKSs)在原核生物大腸桿菌中將蝦青素合成途徑中的酶進(jìn)行組裝,拉近酶與底物的距離,減少中間產(chǎn)物的游離,發(fā)酵后蝦青素產(chǎn)量為16.9 mg/g DCW,是目前原核生物生產(chǎn)蝦青素的最高產(chǎn)量。

真核生物由于存在多種細(xì)胞器,使得細(xì)胞代謝涉及廣泛的串?dāng)_和復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制,如MA等[46]在解脂耶氏酵母產(chǎn)蝦青素的研究中發(fā)現(xiàn),脂溶性的β-胡蘿卜素隨著脂質(zhì)合成從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)體,最后隨著游離脂肪酸轉(zhuǎn)移到過(guò)氧化物酶體中,這種現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致終產(chǎn)物產(chǎn)量低并形成不良副產(chǎn)物。MA等[46]將外源引入解脂耶氏酵母的β-胡蘿卜素羥化酶(CrtZ,來(lái)自雨生紅球藻)和β-胡蘿卜素酮醇酶(CrtW,來(lái)自副球菌)融合表達(dá),再通過(guò)添加膜蛋白定位標(biāo)簽的方式分別同時(shí)定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、脂質(zhì)體和過(guò)氧化物酶體上,有效地解決了由細(xì)胞器隔離機(jī)制導(dǎo)致的底物和酶距離遠(yuǎn)的問(wèn)題,使解脂耶氏酵母在補(bǔ)料分批發(fā)酵中蝦青素產(chǎn)量為16.7 mg/g DCW,是目前真核生物生產(chǎn)蝦青素的最高產(chǎn)量。

5 結(jié)論

蝦青素具備極強(qiáng)的抗氧化功能,因而在食品營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)療保健、飼料等領(lǐng)域擁有非常大的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展空間。近年來(lái),蝦青素在市場(chǎng)上的需求量不斷加大,構(gòu)建蝦青素合成細(xì)胞工廠生產(chǎn)蝦青素也備受關(guān)注。合成生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展也為蝦青素合成細(xì)胞工廠的構(gòu)建提供了新的契機(jī),為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)、改造與應(yīng)用蝦青素細(xì)胞工廠提供了更多可能。微生物合成蝦青素分為3個(gè)階段,分別為中心碳代謝循環(huán)階段、蝦青素前體物質(zhì)合成階段和蝦青素合成階段。構(gòu)建高產(chǎn)蝦青素的菌株,就要從這3個(gè)階段出發(fā),綜合設(shè)計(jì),通過(guò)打開(kāi)限速酶的限速、擴(kuò)大及平衡蝦青素前體池、采用多酶級(jí)聯(lián)等方法,及通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)控的方式來(lái)獲得更多的細(xì)胞工廠和更高的產(chǎn)量。

綜上所述,通過(guò)多種途徑對(duì)微生物進(jìn)行代謝工程改造以提高蝦青素產(chǎn)量顯示出巨大的潛力,未來(lái)還會(huì)有更多的微生物會(huì)被開(kāi)發(fā)作為蝦青素的生產(chǎn)宿主,從而逐步滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求。