陳瑞喜,馬云翔,李建剛,張曉萌,周治屹,陳金鳳,汪月,張盛貴*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)2(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)

淀粉具有良好的生物相容性和生物降解性,可作為運(yùn)輸功能分子理想載體使用[1]。但是,天然馬鈴薯淀粉(native starch, NS)顆粒較差的孔隙結(jié)構(gòu),限制了對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的吸附和運(yùn)輸方面的潛力[2]。多孔淀粉(porous starch, PS)作為一種通過(guò)物理、化學(xué)或酶處理獲得的具有蜂窩狀孔洞的變性淀粉,與NS相比,其表面及內(nèi)部形成了大量的孔洞,這種結(jié)構(gòu)顯著增加了比表面積和總孔隙體積[3]。在醫(yī)藥、食品等行業(yè)中,PS可用于對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、控釋以及對(duì)光、氧化或高溫敏感分子的保護(hù)。WU等[4]用多孔淀粉微球泡沫對(duì)疏水性較高的洛伐他汀進(jìn)行吸附,與商業(yè)膠囊相比,多孔淀粉為載體時(shí)可顯著提升洛伐他汀的溶解性和生物利用度。

丁香酸(syringic acid, SA)是水果、蔬菜以及谷物中常見(jiàn)的酚酸類化合物,在植物中通過(guò)莽草酸途徑合成[5],其具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗內(nèi)毒素等生物活性[5],在預(yù)防疾病(如糖尿病、心血管疾病、癌癥、腦缺血)等方面具有廣泛的治療應(yīng)用。SA的多種生物醫(yī)學(xué)活性主要取決于芳香環(huán)上羥基(—OH)和甲氧基(—OCH3)的存在,取代的數(shù)量和位置決定了其作用的廣泛范圍和效力[6]。目前,SA與多糖的研究主要集中于殼聚糖成膜性方面的改善。YANG等[7]通過(guò)把不同濃度的SA加入到殼聚糖薄膜中制備復(fù)合膜,發(fā)現(xiàn)SA對(duì)復(fù)合膜的力學(xué)性能和抗菌性能均有影響;LIU等[8]把不同結(jié)構(gòu)羥基苯甲酸接枝到殼聚糖上,結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸接枝殼聚糖薄膜具有最高的紫外線和濕氣阻隔、機(jī)械和抗氧化性能。淀粉和殼聚糖都是可生物降解性、安全性較高的生物質(zhì)材料。與殼聚糖相比,多孔淀粉具有良好的包埋能力,且其孔隙、孔道和空腔的存在使更多的羥基暴露,增加了與SA分子作用的敏感性,使酯化反應(yīng)易于發(fā)生。因此,綜合多孔淀粉良好的包埋能力和酚類物質(zhì)的生物活性,研究酚類物質(zhì)對(duì)淀粉改性,使淀粉攜帶酚類功能,制備具有轉(zhuǎn)運(yùn)、控釋和保護(hù)活性物質(zhì)功能的材料,是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

本研究以溶劑交換法制備出納米級(jí)孔結(jié)構(gòu)PS為反應(yīng)主體,SA為客體,在有機(jī)體系中對(duì)PS進(jìn)行酯化改性,旨在制備高取代度且具備大量孔隙結(jié)構(gòu)的丁香酸多孔淀粉酯(syringic acid porous starch ester, SA@PS),并對(duì)其結(jié)構(gòu)性能進(jìn)行表征,為改性淀粉作為載體材料提供一個(gè)可行的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異丙醇,二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO),天津市北辰方正試劑廠;馬鈴薯淀粉、丁香酸、N,N′-羰基二咪唑、DMSO-d6(純度≥99.9%)、DPPH,上海麥克林生化科技有限公司;所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

B11-2型恒溫磁力攪拌水浴鍋,上海司樂(lè)儀器有限公司;HXLG-10-50B型真空冷凍干燥機(jī),上海滬析實(shí)業(yè)有限公司;JSM-6701F型冷場(chǎng)發(fā)射型掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM),日本電子光學(xué)公司;ASAP 2020型全自動(dòng)比表面積及孔隙度分析儀,美國(guó)麥克公司;NEXUS 670型傅里葉紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR),美國(guó)Thermo公司;AVance NEO型600 MHz核磁共振波普儀,德國(guó)布魯克科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 馬鈴薯多孔淀粉的制備

參考CHANG等[9]的方法稍作修改,稱取馬鈴薯淀粉10.0 g并加入100 mL去離子水,放置于磁力攪拌水浴鍋中溫度設(shè)為40 ℃攪拌20 min形成均勻分散的淀粉懸浮液,然后持續(xù)升溫到90 ℃并攪拌1 h淀粉完全糊化,4 ℃下貯存72 h形成淀粉凝膠,將淀粉凝膠切成立方體小塊(0.6～0.8 cm3),浸入無(wú)水乙醇(200 mL×6次,每次1 h)置換后冷凍真空干燥,研磨備用。

1.3.2 丁香酸多孔淀粉酯的制備

參考HAN等[10]和WEN等[11]的方法并改進(jìn),采用兩步法合成丁香酸多孔淀粉酯(合成路線如圖1所示)。第一步:將等摩爾的丁香酸和CDI加入至100 mL單口平底燒瓶中,再加入25 mL DMSO,置于恒溫磁力攪拌油浴鍋中,燒瓶在60 ℃、N2氣氛下加熱15 h,生成丁香酸咪唑化合物。取1.0 g多孔淀粉加入到丁香酸咪唑化合物中,混合物在75 ℃、N2氣氛下磁力攪拌反應(yīng)7 h后停止。第二步:反應(yīng)物用異丙醇多次洗滌離心(6 000 r/min,10 min),沉淀物裝入透析袋(截留分子質(zhì)量為8～14 kDa)中用DMSO透析24 h,然后用異丙醇再進(jìn)行透析48 h后,進(jìn)行真空冷凍干燥,得到丁香酸多孔淀粉酯(SA@PS)。

圖1 丁香酸多孔淀粉酯的合成路線圖Fig.1 The synthetic route of preparing SA@PS

1.3.3 N2-吸附/脫附等溫線測(cè)定

低溫N2吸附法是測(cè)定多孔材料孔隙度最常用的方法之一,采用非定域密度泛函理論,從多孔淀粉的吸附數(shù)據(jù)中得到孔徑的尺寸分布曲線。依據(jù)Brunauer-Emmett-Teller(BET)多層吸附理論計(jì)算樣品的比表面積。

1.3.4 取代度的測(cè)定

丁香酸多孔淀粉酯的取代度(degree of substitution, DS)參考KAPUSNIAK等[12]的方法稍作修改。在1H NMR譜圖中,4.58～5.50 ppm的峰對(duì)應(yīng)于淀粉脫水葡萄糖單元(anhydro glucose unit, AGU)的4個(gè)質(zhì)子的信號(hào),而SA@PS結(jié)構(gòu)中的甲氧基(—OCH3)質(zhì)子信號(hào)峰在3.83 ppm左右處[13]。因此,取代度由3.83處甲氧基的3個(gè)質(zhì)子峰面積與4.58～5.50淀粉脫水葡萄糖單元中1號(hào)位氫和2、3、6號(hào)位羥基的質(zhì)子峰面積和之比計(jì)算而來(lái)。計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:Isignal、3分別是樣品在3.83處的峰面積、質(zhì)子數(shù);IAGU、4分別是淀粉在4.58～5.50的4個(gè)質(zhì)子的峰面積之和、質(zhì)子數(shù)。

1.3.5 SEM表觀形態(tài)觀察

利用SEM觀察不同倍數(shù)下樣品的表觀形態(tài)特征。將樣品座置于離子濺射儀中鍍金60 s后,加速電壓為5 kV時(shí)觀察。

1.3.6 FT-IR測(cè)定

FT-IR測(cè)定采用KBr壓片法。將樣品與KBr按1∶50(mg∶mg)的比例混合均勻,反復(fù)碾磨至無(wú)顆粒感后壓片,在4 000～500 cm-1進(jìn)行掃描測(cè)定。

1.3.7 液態(tài)核磁分析

在使用600 MHz核磁共振氫譜儀(1H NMR)測(cè)定之前,稱取一定量樣品于核磁管中,加入DMSO-d6,在75 ℃下超聲波處理30 s使淀粉樣品充分溶解并去除溶解氧對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響,使用TXISz探針(8 μs 90°脈沖,重復(fù)時(shí)間15.07 s,包括采集時(shí)間3.07 s和松弛延遲12 s),測(cè)量溫度25 ℃。所有化學(xué)位移以百萬(wàn)分之幾(ppm)為單位報(bào)告,使用通常用作核磁共振測(cè)量?jī)?nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的四甲基硅烷信號(hào)作為參考。

1.3.8 X-射線衍射測(cè)定

使用多晶粉末X射線衍射儀(X-ray diffraction, XRD)來(lái)測(cè)定樣品的晶體結(jié)構(gòu),掃描范圍為10°～40°。

1.3.9 DPPH自由基清除活性測(cè)定

將PS和不同取代度的SA@PS均勻分散在4 mL的DPPH乙醇溶液中(0.2 mmol/L),并制備一系列質(zhì)量濃度梯度(0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL)。將制備好的樣品渦漩振蕩3 min后,在室溫條件下,黑暗環(huán)境中反應(yīng)30 min進(jìn)行測(cè)定,以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照,混合物的吸光度在517 nm處測(cè)定[14]。樣品的DPPH自由基清除活性的計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:A1,樣品吸光值;A2,乙醇溶液代替DPPH溶液所測(cè)吸光值;A0,空白樣品吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

利用Origin 2018和SPSS 25軟件進(jìn)行處理和分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SEM形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

如圖2所示,NS顆粒在形狀和大小上表現(xiàn)出很大的差異,淀粉顆粒形狀呈球形或橢圓形,顆粒表面光滑,觀察不到孔隙或裂縫(圖2-a);經(jīng)溶劑交換法制備得到的PS表面粗糙、不規(guī)則、呈蜂窩狀(圖2-b)。馬鈴薯淀粉經(jīng)高溫糊化、冷凍之后,大量的水分子變成冰晶被固定在淀粉凝膠中,經(jīng)乙醇置換、干燥揮發(fā)后,從而形成表面孔隙及內(nèi)部的孔結(jié)構(gòu),這提供了大的比表面積和總孔隙體積,同時(shí)也增加了與化學(xué)基團(tuán)或酶反應(yīng)的可能性[15]。多孔淀粉經(jīng)過(guò)酯化改性后,顆粒形狀不規(guī)則,相互堆積。低DS的SA@PS-1(圖2-c)孔大小不一,分布不均勻,與圖2-c、圖2-d相比,高取代度淀粉酯(圖2-e)的孔呈蜂窩絮狀結(jié)構(gòu),這是由于淀粉表面及顆粒內(nèi)部發(fā)生了酯化反應(yīng),從而影響其外觀形態(tài)。

a-NS(500×);b-PS(5 000×);c-FA@PS-1(5 000×);d-FA@PS-2(5 000×);e-FA@PS-3(5 000×)圖2 馬鈴薯淀粉、多孔淀粉和丁香酸多孔淀粉酯的SEM圖Fig.2 SEM images of native starch、porous starch and SA@PS

2.2 多孔淀粉的BET分析

為表征制備材料的孔徑,采用Barret、Joyner和Halenda(BJH)理論計(jì)算了孔隙分布,根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)將孔隙分為三大類:微孔(<2 nm)、介孔(2～50 nm)、大孔(>50 nm)。如圖3-a所示,PS的平均孔徑為18.03 nm,表明所制備的PS可歸屬于介孔材料范疇。參照王宇霞等[16]NS的比表面積僅為0.02 m2/g,經(jīng)溶劑交換法制備的PS的表面積達(dá)到了14.69 m2/g(圖3-b)。但是,多孔淀粉經(jīng)過(guò)酯化之后,SA@PS-3(圖3-d)比表面積為7.64 m2/g,這表明酯化過(guò)程中破壞了原來(lái)的孔結(jié)構(gòu),且平均孔徑(圖3-c)由原來(lái)的18.03 nm減小為13.88 nm。

a-孔徑大小;b-多孔淀粉BET;c-SA@PS-3孔徑;d-SA@PS-3比表面積圖3 多孔淀粉和多孔淀粉酯的孔徑分布及BET表面積圖Fig.3 Pore diameter distribution and BET surface area plots of PS and SA@PS-3

2.3 丁香酸多孔淀粉酯取代度分析

DS是指淀粉聚合物的每個(gè)AUG被反應(yīng)試劑取代的羥基數(shù)[17]。實(shí)驗(yàn)中設(shè)定不同反應(yīng)底物比例(表1),用1H NMR譜圖對(duì)取代度進(jìn)行定量分析。如表1所示,SA@PS的取代度隨著SA/PS摩爾比例的增大而增加,這可歸因于丁香酸濃度增加,另一方面PS的孔結(jié)構(gòu)以及內(nèi)部的空腔暴露出更多的活性位點(diǎn)與丁香酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng),使丁香酸分子靠近主體PS的可能性增大,進(jìn)而提升了反應(yīng)效率。這與LU等[18]在混合離子液體中脂肪酶催化合成棕櫚酸淀粉酯的結(jié)果相似。

表1 丁香酸多孔淀粉酯的取代度Table 1 Degree of substitution of SA-PS

2.4 1H NMR液態(tài)核磁分析

圖4顯示了溶解在d6-DMSO中PS(圖4-a),SA(圖4-b),以及SA@PS-3(圖4-c)的核磁共振氫譜圖。質(zhì)子在3.64 ppm的1H化學(xué)位移歸屬于H-3,3.57 ppm歸屬于H-5,3.31 ppm歸屬于H-2,3.15 ppm歸屬于H-4,H-1和OH-2、3、6位的化學(xué)位移被指定為4.58～5.50 ppm的峰[19];而2.5 ppm和3.3 ppm分別對(duì)應(yīng)的是溶劑d6-DMSO和水的質(zhì)子峰[20](圖4-a)。相比PS,SA@PS-3的1H NMR譜有額外的信號(hào),包括7.36～7.54 ppm(苯環(huán)上的亞甲基質(zhì)子)的多重信號(hào),3.83 ppm的強(qiáng)峰[13](—OCH3,圖4-c)。這些附加信號(hào)的存在證實(shí)了PS和SA已成功合成。此外,指定給—COOH的峰為12.62 ppm的SA(圖4-b)在SA@PS-3不存在,表明未反應(yīng)的SA從目標(biāo)產(chǎn)物中完全脫除。

a-PS;b-SA;c-SA@PS-3圖4 多孔淀粉、丁香酸及丁香酸多孔淀粉酯的核磁共振氫譜圖Fig.4 1H NMR images of PS、SA and SA@PS-3

2.5 紅外光譜分析

圖5 多孔淀粉和不同取代度丁香酸多孔淀粉酯的紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of PS、SA@PS of different degree of substitution

2.6 X-衍射分析

NS、PS和不同取代度的SA@PS進(jìn)行XRD分析(圖6)。NS的X射線衍射圖顯示出典型的B型晶體結(jié)構(gòu)特征,分別在15.2°、17.1°、22.5°處有3個(gè)較強(qiáng)的特征衍射峰[22]。PS的圖譜中觀察到無(wú)定形分散的寬峰,這可能是PS制備過(guò)程N(yùn)S經(jīng)高溫糊化、淀粉晶核熔化,破壞了分子之間的氫鍵,使更多的淀粉分子長(zhǎng)鏈發(fā)生分離,導(dǎo)致淀粉結(jié)構(gòu)分解程度增加,最終呈現(xiàn)為單一的、非晶態(tài)的衍射峰[23]。而SA@PS在12.8°、19.2°、26.6°處有3個(gè)新的衍射峰,表明PS經(jīng)酯化作用形成了新的晶體結(jié)構(gòu),SA@PS 3個(gè)新衍射峰的峰強(qiáng)度隨著取代度的增大而增強(qiáng),這可能是酯化過(guò)程中短鏈直鏈淀粉發(fā)生了回生重新聚集形成了新的晶體結(jié)構(gòu),確切的形成機(jī)理有待深入研究[24]。

圖6 丁香酸、多孔淀粉及不同取代度的丁香酸多孔淀粉酯的X射線衍射圖譜Fig.6 The X-ray diffraction pattern of SA、PS and SA@PS of different degree of substitution

2.7 DPPH自由基清除能力分析

PS和不同取代度的SA@PS對(duì)DPPH自由基的清除率如圖7所示。在DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中,抗氧化劑能夠?qū)⒎€(wěn)定的DPPH自由基(紫色)還原為非自由基形式的DPPH-H(黃色)[25]。結(jié)果表明PS對(duì)DPPH自由基的清除能力非常弱;相同濃度的條件下,SA@PS對(duì)DPPH自由基的清除率隨著取代度的增加而增加,這可能由于丁香酸通過(guò)酯化反應(yīng)連接到PS骨架中。當(dāng)SA@PS的質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL,SA@PS-3對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最高17.68%。取代度越大說(shuō)明有更多的丁香酸分子參與酯化反應(yīng),丁香酸的酚羥基能與自由基反應(yīng)形成穩(wěn)定的苯氧基,且兩側(cè)的甲氧基有效加強(qiáng)了苯氧基的穩(wěn)定性[26],從而使SA@PS具備了較強(qiáng)的抗氧化性。

圖7 多孔淀粉和不同取代度的丁香酸多孔淀粉酯的DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH free radical scavenging ability of PS and SA@PS of different degree of substitution

3 結(jié)論

化學(xué)改性是一種廣泛應(yīng)用于改善淀粉性能以滿足某些特定應(yīng)用要求的有力手段。以溶劑交換法對(duì)NS進(jìn)行多孔化改性,完全破壞了淀粉顆粒原有的表觀形貌,制備出PS 顆粒形狀不規(guī)則,表面形成了大量分布不均的孔隙結(jié)構(gòu),孔隙及內(nèi)部的空腔暴露出更多的反應(yīng)位點(diǎn),使靠近主體分子的可能性增大,提升了反應(yīng)效率,且隨著丁香酸分子濃度的增加,DS也隨之增加,表明多孔處理有利于淀粉改性反應(yīng)的發(fā)生。利用CDI介導(dǎo)的反應(yīng)將丁香酸酯化到馬鈴薯多孔淀粉上。1H NMR和FT-IR譜圖結(jié)果表明,丁香酸羧基與淀粉羥基之間通過(guò)酯鍵完成骨架連接;酯化反應(yīng)后XRD顯示,SA@PS的晶體結(jié)構(gòu)由PS無(wú)定形狀態(tài)在酯化過(guò)程中發(fā)生部分回生,從而形成新的晶體結(jié)構(gòu)。SA@PS因攜帶了酚類物質(zhì),獲得了較強(qiáng)的抗氧化活性,取代度和樣品濃度與DPPH自由基的清除率呈正相關(guān)關(guān)系。制備的淀粉酯化物可用于生物活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、控釋和保護(hù)材料,有望在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域應(yīng)用。