張川,李倩文,王曉楠,陳樹興*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽,471000)2(中原食品實驗室,河南 漯河,462000)

蛋清蛋白(egg white protein, EWP),一種營養(yǎng)豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白,具有較高的消化率及人體所必需的8種氨基酸,因其具有乳化性、起泡性、凝膠性等優(yōu)良特性,常作為功能性原料應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)中[1]。其乳化性和凝膠性不僅有利于食品的質(zhì)地、形態(tài)及持水性,同時可改善食品風(fēng)味和口感等[2],因此被廣泛應(yīng)用于肉制品、焙烤等食品中。食品工業(yè)中為提高蛋清粉凝膠性、乳化性等加工特性,通常使用的3種改性方法有物理[3]、化學(xué)[4]和酶法改性[5],其中物理改性中的熱誘導(dǎo)因能耗低、效率高、產(chǎn)品品質(zhì)高且安全等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用[6]。其機理為將蛋白質(zhì)加熱至變性后部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開和聚集,一定量的蛋白質(zhì)之間或與蛋白質(zhì)包裹的脂肪滴形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[7]。研究表明,脂質(zhì)和蛋白質(zhì)間的相互反應(yīng)對凝膠體系的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)具有較大影響[8]。CHANG等[4]研究發(fā)現(xiàn)熱改性能可有效提高蛋白質(zhì)油水界面的吸附力,從而提升EWP的起泡性、乳化性、熱穩(wěn)定性及凝膠特性。方艾虎等[9]制備了不同油相質(zhì)量分數(shù)下的卵清分離蛋白-亞麻籽油乳液體系,并研究其流變特性、粒徑分布、微觀結(jié)構(gòu)等特性,結(jié)果表明在高油相質(zhì)量分數(shù)下凝膠體系穩(wěn)定性增強,黏度提高,粒徑減小,證明了高油相乳液體系具有良好的可行性。

黃油具有易消化吸收、較好的溶化性及加熱融化后的獨特乳香等優(yōu)勢[10],是乳制品焙烤食品的必備原料之一。此外黃油含有維他命、短鏈脂肪酸、礦物質(zhì)(如鈣、磷、鉀)等營養(yǎng)物質(zhì)[11-12],并具有提高免疫力、改善貧血和胃腸道疾病等作用[13],適量食用可改善因食用不飽和脂肪酸或人造奶油造成的貧血癥狀,且與蛋白結(jié)合應(yīng)用到食品中可改善產(chǎn)品質(zhì)地、乳化性及質(zhì)構(gòu)特性。EWP具有與乳化鹽相似的乳化特性,黃油又因其營養(yǎng)價值及質(zhì)地和口感成為制備乳制品的必備原料。目前,通過添加油脂改善凝膠品質(zhì)的研究有較多報道,但關(guān)于EWP和黃油制作復(fù)合凝膠并探討其性質(zhì)的研究鮮少報道。

本研究以EWP和黃油為原料,通過熱誘導(dǎo)的處理方法制備含有不同濃度黃油的EWP/黃油復(fù)合凝膠,并研究其質(zhì)構(gòu)特性、持水性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、流變特性及微觀結(jié)構(gòu)的變化,以利用其乳化性及凝膠特性,為后續(xù)部分替代乳化鹽,減少食品中乳化鹽的用量,制備低鈉食品提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

EWP粉(蛋白含量78%,食品級),山東碩豐生物科技有限公司;黃油(食品級),淶水縣金谷糧油食品有限公司;檸檬酸(食品級),河南萬邦化工科技有限公司;十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、Na2HPO4、NaH2PO4(分析純),天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;Nile Red、Nile Blue(分析純),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速均質(zhì)乳化機,常州越新儀器制造有限公司;TG16-WS臺式高速離心機,湖南湘儀實驗室儀器有限公司;Instron Universal 5544 型食品物性分析儀,美國Instron公司;TA DHR-2流變儀,美國TA儀器有限公司;TM3030plus SEM臺式掃描電鏡,日本日立高新技術(shù)公司;LGJ-10D型冷凍干燥機,北京四環(huán)科技儀器有限公司;T6新世紀紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;LSM 900激光掃描共聚焦顯微鏡,蔡司光學(xué)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 EWP/黃油復(fù)合凝膠的制備

用去離子水制備140 g/L的EWP粉溶液,置燒杯中磁力攪拌1 h后,9 000 r/min均質(zhì)EWP溶液3 min,55 ℃水浴加熱1 h水合,以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的質(zhì)量比倒入融化后的黃油(55 ℃乳化10 min),10 000 r/min均質(zhì)5 min使其完全均質(zhì)化,調(diào)pH值至6.0,隨后90 ℃熱處理變性30 min,流水冷卻后即得EWP/黃油復(fù)合凝膠,取部分樣品于4 ℃保存24 h后測定質(zhì)構(gòu)特性及持水性,部分樣品真空凍干后用以乳化性、乳化穩(wěn)定性及掃描電鏡檢測,其中未添加黃油的EWP凝膠作為空白對照。

1.3.2 質(zhì)構(gòu)特性測定

參照ZHENG等[14]方法,稍作改動。取1.3.1節(jié)所制樣品置于燒杯中(樣品直徑5.0 cm、高度1.5 cm)待測。物性分析儀參數(shù)設(shè)定:測試前速率5 mm/s,測試速率2 mm/s,測試后速率5 mm/s,測試形變30%;探頭為P/36 R,測定樣品的硬度、彈性、膠黏性及內(nèi)聚性,每個樣品平行測定3次。

1.3.3 持水性測定

參照ZHAO等[15]方法,以10 mL離心管質(zhì)量記為m0(g),將1.3.1節(jié)制備好的凝膠樣品轉(zhuǎn)至離心管中,樣品與離心管總質(zhì)量記為m1(g),室溫下10 000 r/min離心10 min,濾紙將上層及表面水分吸干后稱質(zhì)量記為m2(g),重復(fù)3次,按公式(1)計算復(fù)合凝膠樣品的持水性(water holding capacity,WHC)。

(1)

式中:m0,離心管的質(zhì)量,g;m1,離心管和樣品總質(zhì)量,g;m2,離心后離心管和樣品總質(zhì)量,g。

1.3.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

參照劉麗莉等[16]檢測方法,將1.3.1節(jié)所制凍干樣品溶解于pH 6.0,100 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中(1 mg/mL),取18 mL樣品加入6 mL大豆油于室溫下10 000 r/min均質(zhì)1 min以形成乳化液。分別在均質(zhì)后0 min和10 min時從乳化液底部吸取100 μL,使用4.9 mL的0.1%(體積分數(shù))的SDS稀釋混勻后,于500 nm測定吸光值,以0.1%的SDS溶液為空白。根據(jù)公式(2)、公式(3)計算乳化性(emulsifying activity index,EAI)及乳化穩(wěn)定性(ESI)。

(2)

式中:N,稀釋倍數(shù);A0,均質(zhì)0 min的吸光度值;ρ,蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度,g/mL;φ,溶液中加入油的體積比。

(3)

式中:A0,均質(zhì)0 min的吸光度值;A10,均質(zhì)10 min的吸光度值。

1.3.5 流變特性測定

根據(jù)PEYRANO等[17]的測定方法并略作改動。取1 mL變性前樣品溶液置于流變儀的40 mm平行板夾具上,除去氣泡,于樣品邊緣滴加硅油后進行動態(tài)溫度測定。掃描條件:掃描頻率1 Hz,應(yīng)變幅度1%,溫度以5 ℃/min從25 ℃升至90 ℃保持30 min后,再降至25 ℃,記錄樣品的儲存模量G′和損耗角tanδ隨溫度變化的趨勢。

1.3.6 掃描電鏡測定

參照張詩佳等[18]方法,將1.3.1節(jié)所制凍干樣品置于已固定導(dǎo)電膠的樣品臺上,進行離子濺射噴金處理后,移至掃描電鏡樣品倉進行觀察,于10 kV電壓下對其進行觀察(200倍)。

1.3.7 激光共聚焦測定

根據(jù)LI等[19]的測定方法并略作改動。通過1%的Nile Red和1% Nile Blue[1∶1(體積比)]進行染色,1 mL樣品滴加20 μL染液,混勻后取10 μL到載玻片上,并覆蓋蓋玻片,除去氣泡后置于載物臺上,使用20×目鏡在488 nm與633 nm激發(fā)光波長下采集圖像。

1.3.8 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS statistics 25進行顯著性分析,運用Excel 2019進行統(tǒng)計分析,利用Origin 8.5軟件作圖,每組試驗平行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)構(gòu)特性分析

質(zhì)構(gòu)檢測中的硬度、彈性、膠黏性及內(nèi)聚性通常是凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的表現(xiàn),在一定程度上反應(yīng)了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整性和強度[20]。不同EWP/黃油比例下復(fù)合凝膠的質(zhì)構(gòu)分析如表1所示,隨著黃油濃度的增加,復(fù)合凝膠的硬度及膠黏性逐漸增大,彈性及內(nèi)聚性均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,且在EWP/黃油質(zhì)量比為1∶3時復(fù)合凝膠的彈性及內(nèi)聚性均達到了最大值(P<0.05),此時混合凝膠的組織狀態(tài)細膩無氣孔;當EWP/黃油質(zhì)量比達到1∶4及1∶5時,復(fù)合凝膠彈性及內(nèi)聚性下降(P<0.05),這表明在熱處理過程中蛋白受熱聚集,乳化后的油脂分子填補至蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔隙中,使其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密,從而影響復(fù)合凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。此外經(jīng)熱變性后蛋白質(zhì)分子充分暴露,導(dǎo)致疏水基團暴露,氫鍵和疏水鍵發(fā)生相互作用促進凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的增強,其彈性和內(nèi)聚性也隨之增強。但當黃油達到一定量時,部分黃油填充復(fù)合凝膠的孔隙提高了凝膠強度,剩余部分乳化后的黃油會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致彈性及內(nèi)聚性減弱,相關(guān)研究也表明,添加預(yù)乳化后的油脂更有助于凝膠結(jié)構(gòu)的形成[21]。

表1 不同比例EWP/黃油對復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Table 1 Effects of different proportions of EWP/butter on the texture of the composite gel

2.2 持水性分析

持水性作為凝膠的重要指標之一,在一定程度上反映了復(fù)合凝膠的水合程度。在凝膠化過程中,蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)因熱變性松動,分子交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而捕獲復(fù)合凝膠中的自由水,使其具有一定的持水性[22]。不同比例下EWP/黃油復(fù)合凝膠的持水性如圖1所示。隨著黃油濃度的增加,復(fù)合凝膠的持水性呈現(xiàn)先逐漸增大后趨于平緩的趨勢(P<0.05)。EWP/黃油復(fù)合凝膠相較未添加黃油的蛋清蛋白凝膠而言,因蛋白質(zhì)與脂質(zhì)經(jīng)均質(zhì)剪切作用被束縛在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中,持水性得到顯著增高(P<0.05),當EWP/黃油質(zhì)量比為1∶3時,與對照組相比,持水性增至(67.84±1.73)%,這是因為隨著黃油濃度的增加,更多油滴排列在復(fù)合凝膠網(wǎng)絡(luò)中,兩親性的蛋白吸附在油水界面的同時暴露了疏水區(qū)域并與油滴和蛋白分子反應(yīng),這一過程使蛋白質(zhì)的極性氨基酸殘基被暴露,并通過氫鍵與蛋白質(zhì)分子和水分子水合,因此持水性增大,其凝膠硬度也隨之增加。當EWP/黃油質(zhì)量比為1∶4及1∶5時差異不顯著(P>0.05),此外當EWP/黃油質(zhì)量比設(shè)置為1∶6時,因油脂過多未能形成凝膠狀外觀及形態(tài),故后續(xù)試驗不以其作為研究對象。

圖1 不同EWP/黃油比例的復(fù)合凝膠持水性Fig.1 WHC of blended gels with different EWP/butter ratios

2.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性分析

蛋白質(zhì)分子具有乳化劑的特征結(jié)構(gòu),即“兩親”結(jié)構(gòu),是食品的重要表面活性物質(zhì),其乳化特性表征了蛋白質(zhì)吸收至油水界面的能力[23]。圖2為復(fù)合凝膠的EAI及ESI情況,與未處理組相比,復(fù)合凝膠的EAI和ESI均得到顯著提高(P<0.05),同時隨著二者比例的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,此結(jié)果與質(zhì)構(gòu)特性結(jié)果趨于一致,且當EWP/黃油質(zhì)量比為1∶3時,EAI和ESI達到了最大值,分別從(40.74±1.66) m2/g增加至(89.87±2.36) m2/g,從(36.85±1.99)%增加至(65.97±1.51)%,表明適量油脂的添加顯著改善復(fù)合凝膠的乳化特性。其原因為熱處理后被包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性殘基暴露,蛋白質(zhì)在油水界面的吸附能力增加,從而形成致密且具有黏彈性的蛋白質(zhì)膜,防止油滴聚集及其乳化狀態(tài)被破壞,有效截留了水分,形成了更穩(wěn)定的乳化液。此外黃油和EWP均具有乳化特性,二者結(jié)合復(fù)配制得的復(fù)合凝膠也具有乳化特性,楊淼等[24]研究表明適當?shù)挠拖啾壤梢愿纳拼蠖狗蛛x蛋白的凝膠持水性和乳化特性,這與本研究結(jié)果相似。

圖2 不同EWP/黃油比例的復(fù)合凝膠EAI及ESIFig.2 Composite gel emulsification and emulsification stability with different EWP/EG ratios

2.4 流變特性分析

凝膠形成過程可以通過動態(tài)流變學(xué)中的參數(shù)儲存模量(G′)及損耗因子(tanδ)了解,G′表示凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的彈性性能,也代表其凝膠強度,tanδ反映復(fù)合凝膠加熱過程中的整體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。EWP/黃油復(fù)合凝膠的G′溫度掃描結(jié)果如圖3-a所示。空白組及不同比例下的復(fù)合凝膠變化趨勢一致,在升溫階段前期,蛋白質(zhì)分子未完全變性,G′隨著溫度升高而降低;隨著加熱溫度到達凝膠點,G′急劇升高,這是因為蛋白質(zhì)受熱變性形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),凝膠體系由液體轉(zhuǎn)向固體,此時凝膠體系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)充分展開,疏水基團暴露且蛋白質(zhì)分子間相互作用發(fā)生交聯(lián)聚集從而形成凝膠[25]。在恒溫階段,G′隨溫度掃描穩(wěn)步上升,尤其是EWP-黃油質(zhì)量比為1∶1、1∶3、1∶4時較為明顯,可能是由于未變性蛋白開始變性,即隨著溫度升高,蛋白質(zhì)和油脂作為活性填充劑的作用強化了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。隨著掃描溫度降低,復(fù)合凝膠的G′持續(xù)增大,尤其是質(zhì)量比為1∶3時的G′最大,質(zhì)量比為1∶5時次之,此時蛋白分子間的氫鍵導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)分子運動性下降,且形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)愈加穩(wěn)定,蛋白質(zhì)交聯(lián)趨向完成狀態(tài)。

a-G′;b-tanδ圖3 不同EWP/黃油比例對復(fù)合凝膠G′和tanδ流變特性的影響Fig.3 Effect of different EWP/butter ratios on the rheological properties of mixed gels, G′ and tanδ

EWP/黃油復(fù)合凝膠的損耗因子(tanδ)溫度掃描結(jié)果如圖3-b所示,空白組及不同比例下的復(fù)合凝膠變化趨勢一致。在升溫階段,tanδ先隨溫度升高小幅度降低,隨后急劇下降,表明蛋白在升溫過程中構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變,固體性質(zhì)增強,流體性質(zhì)減弱;恒溫階段的凝膠體系由溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)閺椥园牍腆w;降溫過程中,EWP/黃油質(zhì)量比為1∶3時的tanδ(0.165)最低,表明復(fù)合體系具有較好的凝膠結(jié)構(gòu),可能是因為油脂和蛋白的相互交聯(lián)導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的增強。

2.5 掃描電鏡分析

為能夠更直觀地表征復(fù)合凝膠的結(jié)構(gòu),使用掃描電鏡對其進行觀察。圖4為掃描電鏡在200倍下的掃描結(jié)果。圖4-a為未添加黃油的EWP凝膠,其凝膠結(jié)構(gòu)孔洞多且不均勻,圖4-b～圖4-f為添加黃油后的復(fù)合凝膠,其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對致密均勻,說明乳化后的油脂充當活性填充物的作用被包裹在蛋白質(zhì)中,增強了復(fù)合凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),結(jié)合持水性及凝膠強度結(jié)果分析,乳化后的油脂還促進了EWP分子間的交聯(lián)和聚集及與蛋白質(zhì)之間的相互促進作用。當EWP/黃油質(zhì)量比為1∶3時,復(fù)合凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)最為均勻緊湊,基本看不到孔洞,這是因為在熱變性過程中EWP分子疏水基團暴露,蛋白質(zhì)和油脂間相互作用力增強,形成致密的蛋白質(zhì)膜,顯著改變且形成較致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),凝膠強度和持水性也因此得到改善。當EWP/黃油質(zhì)量比為1∶4和1∶5時導(dǎo)致復(fù)合凝膠結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)孔隙,主要是過量的油脂不能完全被蛋白質(zhì)包裹,增大了空間位阻,導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)孔隙變大,致密程度減小。此結(jié)果與凝膠強度、乳化特性及持水性一致,在一定程度上與XU等[26]的研究相符。因此添加適當黃油能顯著改變蛋清蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),且影響其凝膠特性。

a-1∶0;b-1∶1;c-1∶2;d-1∶3;e-1∶4;f-1∶5圖4 不同EWP/黃油比例的掃描電鏡圖Fig.4 SEM plots of different EWP/butter ratios

2.6 激光共聚焦分析

采用激光共聚掃描顯微鏡對其結(jié)構(gòu)進行表征。EWP凝膠及不同EWP/黃油比例下經(jīng)熱誘導(dǎo)制得的復(fù)合凝膠激光共聚焦結(jié)構(gòu)如圖5所示。

a-1∶0;b-1∶1;c-1∶2;d-1∶3;e-1∶4;f-1∶5圖5 不同EWP/黃油比例的激光共聚焦圖Fig.5 Laser confocal plots of different EWP/butter ratios

紅色代表被Nile Red染色的蛋白,綠色代表被Nile Blue染色的油脂。隨著黃油比例的增加,復(fù)合凝膠的顆粒及孔徑逐漸增大且更均勻,當EWP/黃油質(zhì)量比為1∶3時,形成了較致密均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),且無析水無孔隙,此結(jié)果與掃描電鏡結(jié)果趨于一致,質(zhì)量比為1∶4及1∶5時,過多的黃油出現(xiàn)了擠壓變形的不規(guī)則現(xiàn)象,結(jié)合凝膠強度結(jié)果進一步說明添加黃油一定程度上有利于提高復(fù)配EWP形成致密均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這與BEMER等[27]關(guān)于蛋白結(jié)合油脂凝膠化有利于形成致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究通過熱誘導(dǎo)利用不同比例的EWP和黃油制備EWP/黃油復(fù)合凝膠,并探究其特性。研究結(jié)果表明EWP/黃油質(zhì)量比為1∶3時,EWP/黃油復(fù)合凝膠的持水性、質(zhì)構(gòu)特性、乳化特性、流變特性得到顯著提高,通過掃描電鏡和激光共聚焦結(jié)果顯示添加黃油的復(fù)合凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更致密均勻。綜上所述,黃油在一定程度上改善了EWP的凝膠特性及乳化特性,也賦予其良好的質(zhì)構(gòu)特性,本文研究結(jié)果將為EWP/黃油復(fù)合凝膠在乳制品和烘焙等食品領(lǐng)域中的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。