劉曉鳳,盧曉琴,鐘浩,HUSSAIN Muhammad,王麗娜,楊夢雨,張嘉寧,關榮發(fā)

(浙江工業(yè)大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州,310014)

人參皂苷又稱三萜皂苷,是從人參屬藥材中提取的一類固醇類化合物。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷具有多種藥理學特性,包括免疫調(diào)節(jié)[1]、抗腫瘤和抗炎[2]等,對中樞神經(jīng)、心腦血管和免疫系統(tǒng)均有顯著的保護作用,可廣泛用于相關疾病的治療[3]。人參皂苷作為一種天然抗氧化劑,可以清除自由基,在抗氧化方面具有巨大潛力。

氧化應激是指抗氧化防御機制受到破壞,體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài),細胞內(nèi)會大量產(chǎn)生和積累活性氧(reactive oxygen species,ROS)。ROS的生成會通過體外的異常刺激而增加,過量積累的ROS會直接破壞細胞內(nèi)的生物分子,比如蛋白質(zhì)氧化、破壞DNA[4-5]等,使得細胞結構和功能受損。H2O2是ROS的主要來源,通過產(chǎn)生羥自由基(·OH)直接損傷細胞內(nèi)生物分子。引起腸道屏障功能喪失的主要原因之一就是氧化應激能夠造成腸細胞上皮損傷。小腸上皮細胞是人體腸道重要的物理性防御結構,這種腸道屏障可以有效阻礙毒素、細菌和其他有害物質(zhì)侵入血液系統(tǒng)[6],進而避免侵犯其他器官。人結腸癌(Caco-2)細胞與人類正常小腸上皮細胞結構和功能類似,具有與正常細胞類似的微絨毛和相關酶系,Caco-2細胞可用于腸上皮損傷和修復的體外研究[7-9]。因此本研究以H2O2誘導的Caco-2細胞建立氧化應激損傷模型,評估人參皂苷的抗氧化保護作用,為后續(xù)研究人參皂苷抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞

人結腸癌Caco-2細胞株,上海啟達科技有限公司,本實驗室保存。

1.1.2 藥品與試劑

人參皂苷(純度≥99.5%),中國計量大學,實驗室提取;30% H2O2,上海泰坦科技股份有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶,上海啟達科技有限公司;CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測試試劑盒(P0012)、細胞毒性檢測試劑盒(C0016),上海碧云天生物技術有限公司;谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒(A005-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒(A001-3)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)(A003-1)試劑盒,南京建成生物工程研究所有限公司。

1.1.3 儀器與設備

TS100倒置顯微鏡,日本尼康公司;SpectraMax iD3/iD5多功能酶標儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;HERAcell 240細胞恒溫培養(yǎng)箱,賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Caco-2細胞培養(yǎng)及分組

Caco-2細胞用DMEM細胞培養(yǎng)液(含體積分數(shù)10% FBS與1%青-鏈霉素雙抗液)置于37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每1～2 d換1次培養(yǎng)液。待長至80%進行傳代培養(yǎng)。細胞分別接種于6孔(1×105個/孔)和96孔(1×104個/孔)細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),對照組為未經(jīng)任何處理的正常Caco-2細胞;損傷模型組以DMEM細胞培養(yǎng)液(含有200 μmol/L H2O2)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,制備H2O2誘導的Caco-2細胞氧化損傷應激模型。氧化損傷模型細胞以不同濃度的人參皂苷繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,進行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活性

Caco-2細胞經(jīng)過孵育后,向每孔中加入10 μL CCK-8溶液,在37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,采用多功能酶標儀在450 nm處測吸光值。根據(jù)CCK-8試劑盒提供公式(1)計算細胞存活率。

(1)

式中:A,吸光值。

1.2.3 氧化應激模型的建立及毒性檢測

細胞經(jīng)過傳代之后,待其長至80%左右,消化細胞,將Caco-2細胞分為對照組和氧化損傷模型組,每孔設置3個平行孔。將細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板,每孔100 μL,對照組加入相同體積細胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h,待細胞完全貼壁后,對照組和模型組分別加入10 μL細胞培養(yǎng)基,再向模型組加入不同濃度的H2O2,繼續(xù)孵育2、4、6、8 h。最后加入CCK-8試劑并繼續(xù)孵育2 h,用酶標儀檢測450 nm處吸光度。

1.2.4 胞內(nèi)ROS含量檢測

細胞以4×104個/孔的密度接種至96孔板中,按照1.2.1節(jié)中的分組及實驗要求干預細胞后,吸取細胞培養(yǎng)液,PBS沖洗2遍,再用無血清培養(yǎng)基稀釋樣品,加入新鮮培養(yǎng)基置于恒溫箱中孵育30 min后,取出用PBS沖洗2遍,15 min內(nèi)用酶標儀檢測胞內(nèi)ROS含量,并與模型組對比。

1.2.5 氧化損傷模型中胞內(nèi)指標的檢測

收集細胞并以5×105個/孔的密度接種于6孔板中進行孵育,將細胞分為對照組、H2O2組(200 μmol/L+4 h)和保護組(人參皂苷預處理+200 μmol/L+4 h),收集細胞,使用BCA蛋白濃度試劑盒測定每組細胞蛋白濃度,根據(jù)試劑盒說明書進行胞內(nèi)抗氧化指標GSH-Px和MDA的測定。

采用WST-1法測定細胞中SOD活性,根據(jù)前段分組方法,孵育之后,去除培養(yǎng)基,加入細胞裂解液,每孔100 μL,低溫下裂解10 min,裂解液4 ℃、離心(100×g,10 min)后,收集上清液采用BCA蛋白濃度試劑盒測定每組細胞蛋白濃度,再根據(jù)試劑盒說明書測定胞內(nèi)SOD水平。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析

所有試驗重復3次,結果以均值±標準偏差表示,實驗數(shù)據(jù)使用SPSS和Excel處理,由Origin繪圖,通過單因素方差分析(ANOVA)進一步分析差異顯著性,組間比較采用Duncan法進行顯著性分析,P<0.05、P<0.01分別表示差異顯著、極顯著。

2 結果與分析

2.1 H2O2對Caco-2細胞存活率的影響

H2O2作為ROS主要成分之一,能夠通過細胞膜結構,性質(zhì)比較穩(wěn)定,當與胞內(nèi)Fe3+反應時會形成具有極強毒性的·OH,具有強氧化性,能引起細胞氧化應激,可作為細胞建立氧化應激損傷模型的誘導劑[10-11]。構建細胞氧化應激模型要求在適宜環(huán)境下,使細胞產(chǎn)生明顯的氧化應激損傷,誘導時控制細胞存活率在50%左右為最佳[12],因為細胞存活率過高導致誘導不明顯,不具目的性;過低會發(fā)生不可逆轉的細胞損傷,即使添加抗氧化物質(zhì),也不能使細胞氧化損傷恢復。H2O2誘導Caco-2細胞氧化應激損傷模型的建立如圖1所示。

圖1 不同濃度H2O2對Caco-2細胞存活率的影響Fig.1 Effect of different concentration of H2O2 on survival rate of Caco-2 cells

采用100、200、300、400 μmol/L H2O2分別作用Caco-2細胞2、4、6、8 h,細胞活力均隨時間的延長而逐漸下降,當H2O2濃度200 μmol/L,作用Caco-2細胞4 h時,細胞存活率為(53±2)%(P<0.05),具有統(tǒng)計學意義,因此采用該濃度和作用時間作為誘導Caco-2細胞氧化損傷的最佳條件。

2.2 人參皂苷預處理后每組Caco-2細胞的存活率

實驗設置10、20、40、100、200、500 μg/mL的人參皂苷進行毒性試驗,以基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)Caco-2細胞的存活率為100%進行對照,對不同濃度人參皂苷的安全計量進行分析,篩選人參皂苷最適濃度進行后續(xù)試驗,結果如圖2所示,人參皂苷的質(zhì)量濃度在0～500 μg/mL時,每組對應的細胞存活率在95%～100%,即在此濃度范圍內(nèi)人參皂苷不具毒性。本實驗選擇0～50 μg/mL進行后續(xù)試驗。

圖2 不同濃度的人參皂苷對Caco-2細胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of ginsenosides on survival rate of Caco-2 cells

2.3 Caco-2細胞形態(tài)學觀察

由圖3可知,未經(jīng)任何處理的Caco-2細胞緊密貼壁生長,細胞膜完整光滑;經(jīng)H2O2處理后的細胞明顯受到破壞,部分細胞膜破裂,細胞間孔隙增加,細胞數(shù)量急劇減少;而加入人參皂苷處理后可明顯改善這些情況,添加10～500 μg/mL的人參皂苷可以明顯改善H2O2引起的細胞損傷,使細胞恢復光滑完整的形態(tài)。

a-正常Caco-2細胞;b-H2O2誘導的Caco-2細胞;c-10 μg/mL人參皂苷預處理;d-100 μg/mL人參皂苷預處理;e-500 μg/mL人參皂苷預處理圖3 細胞形態(tài)觀察(×20)Fig.3 Observation of cell morphology(×20)

2.4 人參皂苷對H2O2氧化損傷Caco-2細胞活性的影響

以200 μmol/L H2O2作用4 h建立Caco-2細胞損傷模型,采用不同質(zhì)量濃度(10、20、50 μg/mL)的人參皂苷干預H2O2誘導后的Caco-2細胞。如圖4所示,與模型組相比干預組細胞存活率明顯升高,分別達到(82.58±1.2)%、(86.5±0.8)%、(91.04±1.5)%,由此說明人參皂苷預處理可以使H2O2誘導的Caco-2氧化應激損傷得到緩解,同時也說明在選定濃度范圍下呈劑量依賴關系,人參皂苷對H2O2誘導的Caco-2細胞氧化應激損傷具有一定保護作用。

圖4 人參皂苷對氧化損傷細胞活性的影響Fig.4 Effect of ginsenosides on the activity of cells damaged by oxidation注:*表示與H2O2誘導損傷組相比差異性顯著(P<0.05),**表示極顯著(P<0.01);#表示與對照組相比顯著性差異顯著(P<0.05),##極顯著(P<0.01)(下同)。

2.5 人參皂苷對氧化應激模型中ROS產(chǎn)生的影響

氧化應激的形成是由于ROS的過量產(chǎn)生導致氧化失衡的結果,當自由基與抗氧化劑的水平失衡時,自由基會與人體細胞發(fā)生化學結合,導致細胞損傷而引起許多疾病[13-14]。因此,加強機體氧化系統(tǒng)的防御是拮抗氧化應激的重要手段。酶標儀檢測Caco-2細胞內(nèi)ROS含量結果顯示,加入H2O2的Caco-2細胞內(nèi)的ROS含量明顯增加(P<0.01),當采用不同濃度的人參皂苷進行干預后,可以顯著降低細胞內(nèi)ROS水平,如圖5所示,隨著人參皂苷濃度的增加,胞內(nèi)ROS含量下降,表現(xiàn)出良好的量效關系。因此人參皂苷可以抑制由于H2O2誘導所致的Caco-2細胞內(nèi)ROS的生成量。

圖5 人參皂苷對H2O2誘導損傷Caco-2細胞的ROS含量的影響Fig.5 Effects of ginsenosides on ROS content in Caco-2 cells damaged by H2O2

2.6 人參皂苷對H2O2損傷Caco-2細胞中氧化酶的影響

SOD和GSH-Px是細胞中重要的抗氧化酶類,能有效清除自由基,具有解毒作用,同時也是細胞內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化作用的主要成分,可以防御外源物質(zhì)的刺激,阻止胞內(nèi)脂質(zhì)氧化,進而提高機體的抗氧化能力[15-16]。

如圖6所示,與對照組相比,模型組中Caco-2細胞受到H2O2的刺激后,胞內(nèi)SOD和GSH-Px的含量明顯降低(P<0.01),與模型組相比,經(jīng)過人參皂苷處理后,Caco-2細胞SOD的含量明顯升高;與模型組相比,當添加10 μg/mL人參皂苷時,細胞內(nèi)SOD的含量顯著增加(P<0.05),當人參皂苷質(zhì)量濃度≥20 μg/mL時,胞內(nèi)SOD的含量極顯著增加(P<0.01);此外,經(jīng)人參皂苷處理后,顯著提高了Caco-2細胞內(nèi)GSH-Px的水平,且呈一定劑量依賴關系。

a-SOD;b-GSH-Px圖6 人參皂苷對H2O2損傷Caco-2細胞中SOD和GSH-Px水平的影響Fig.6 Effects of ginsenosides on the levels of SOD and GSH-Px activity in Caco-2 cells damaged by H2O2

2.7 人參皂苷對H2O2損傷Caco-2細胞中MDA的影響

當細胞受到外界刺激后,氧化應激的程度被加深,打破原本平衡的狀態(tài),會引起細胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應,而MDA正是脂質(zhì)過氧化作用后的最終產(chǎn)物之一,細胞內(nèi)脂質(zhì)氧化程度可以用MDA水平來表示,其含量可以間接反映出氧化損傷的程度[17]。如圖7所示,與對照組相比,模型組的MDA極顯著提高(P<0.01);與損傷組相比,人參皂苷組(10～50 μg/mL)顯著降低MDA含量,從而抑制Caco-2受到H2O2的破壞,人參皂苷對氧化應激引起的細胞損傷有保護作用。

圖7 人參皂苷對H2O2誘導損傷Caco-2細胞的MDA含量的影響Fig.7 Effect of ginsenosides on MDA content in Caco-2 cells damaged by H2O2

3 結論

復雜的腸道環(huán)境使腸上皮細胞極易受到自由基的損傷,從而引發(fā)腸道炎癥,腸道細胞氧化應激模型在抗氧化活性的研究中發(fā)揮重要作用。研究表明人參皂苷具有多種生理功能,本研究以H2O2誘導Caco-2細胞氧化應激損傷模型,選擇SOD、GSH-Px和MDA作為評價腸細胞氧化損傷的指標,研究人參皂苷對細胞氧化應激的保護作用。試驗設計了對照組、模型組和實驗組,通過不同質(zhì)量濃度(10～50 μg/mL)人參皂苷對產(chǎn)生氧化應激的細胞進行干預,結果證實了人參皂苷具有一定的清除自由基的能力,能夠延緩氧化作用所造成的細胞死亡、提高細胞活力以及細胞自身的氧化損傷作用。在氧化損傷應激模型中,通過降低胞內(nèi)ROS的生成,提高細胞內(nèi)源性酶SOD和GSH-Px活性,降低胞內(nèi)MDA含量來保護Caco-2細胞。人參皂苷能夠預防和改善由氧化應激損傷帶來的損傷。當機體抗氧化酶受到誘導表達增高時,被認為是組織細胞對氧化應激因素的適應性保護反應。研究表明氧化應激會引起機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡,從而使細胞內(nèi)ROS等物質(zhì)大量積累,導致細胞損傷。隨著抗氧化深受重視,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),氧化應激損傷與老年性、慢性疾病密切相關,且其會引起一系列并發(fā)癥。越來越多的天然活性物質(zhì)抗氧化生理功效的相關研究表明,單一物質(zhì)的抗氧化效果可能無法達到精準快速的抗氧化作用,多種天然活性物質(zhì)的聯(lián)合可以實現(xiàn)增效的效果,未來對聯(lián)合使用多種物質(zhì)治療氧化應激引起的損傷是一種趨勢,本研究可以為氧化應激引起損傷的治療提供科學依據(jù)。