王斌,顧娟,閆華,趙寧靜,劉楠暉,張澎竹,姜啟興,許艷順,夏文水

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 無錫,214122)

睡眠不足是現(xiàn)代社會(huì)普遍存在的一個(gè)突出問題。睡眠不足導(dǎo)致白天過度困倦的發(fā)生率在9%～24%。睡眠不足被定義為在過去4周內(nèi)每晚6 h睡眠或更少。睡眠剝奪可能會(huì)影響學(xué)習(xí)能力和形成新記憶的能力,特別是對(duì)海馬體依賴性記憶任務(wù)的鞏固敏感[1]。越來越多的證據(jù)表明,睡眠剝奪可能導(dǎo)致神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成的變化,從而引發(fā)認(rèn)知記憶衰退[2]。

天然產(chǎn)物,例如來自海洋生物的生物活性材料和多糖,被認(rèn)為是神經(jīng)保護(hù)劑的寶貴來源[3]。殼聚糖低聚糖(chitooligosaccharide, COS)是一種來自殼聚糖的低聚糖,其聚合度(degree of polymerization, DP)<20,Mw<3 900。由于其相對(duì)分子質(zhì)量低、水溶性良好、黏度低、易吸收的特性和其他生物活性,成為了有價(jià)值的功能成分。最近研究表明,COS在體外和體內(nèi)均具有良好的血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)滲透能力[4]。文獻(xiàn)證據(jù)顯示,一些相對(duì)分子質(zhì)量<500的疏水性化合物和極性分子可以通過特定的運(yùn)輸工具穿過BBB進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞。因此,COS在體外和體內(nèi)的良好的神經(jīng)保護(hù)作用,引起了研究人員的興趣。WANG等[5]證明,COS通過減少α-突觸核蛋白的過度表達(dá),減輕神經(jīng)炎癥,激活PI3K/Akt(phosphotylinosital 3 kinase/protein kinase B)途徑,對(duì)帕金森小鼠的神經(jīng)行為障礙有良好的作用。DAI等[6]證明,COS可以通過抑制β淀粉樣蛋白1-42纖維的形成和分解預(yù)先形成的纖維,成為預(yù)防和治療阿爾茲海默癥的新型治療劑。ZHANG等[7]證明,COS可以通過調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件信號(hào)通路保護(hù)神經(jīng)元SH-SY5Y細(xì)胞免受氧化損傷和凋亡。WU等[8]證明,COS對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用,可改善早期神經(jīng)反射行為,減少氧化應(yīng)激損傷,減輕炎癥反應(yīng)。

目前,對(duì)殼寡糖的生物活性的研究大多是用混合物進(jìn)行的。然而,不同MW、DP、脫乙?；潭?degree of deacetylation, DD)和濃度的COS被證明具有各種治療效果。LI等[9]通過使用DP為2～6的COS測(cè)試抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)低DP的COS顯示出更好的羥自由基清除效果,并具有更好的還原能力。前期采用不同DP(2～5)的COS預(yù)防干預(yù)給藥后,對(duì)帕金森病均有顯著性的預(yù)防緩解作用,其中殼三糖(chitotriose,COS3)和殼五糖(chitopentaose,COS5)對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用優(yōu)于殼二糖和殼四糖[10]。

本研究采用改良多平臺(tái)水環(huán)境法(modified multiple platform method, MMPM)建立小鼠睡眠剝奪模型,通過新物體識(shí)別測(cè)定小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,并探究COS3和COS5對(duì)睡眠剝奪造成的學(xué)習(xí)記憶下降的改善作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

60只SPF級(jí)7周齡C57BL/6J雄性小鼠,由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010。

COS3、COS5,實(shí)驗(yàn)室自制[10];RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液、苯甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒、5×上樣緩沖液、電泳膠配制液、脫脂奶粉、一抗稀釋液、磷酸酶抑制劑、β-actin抗體、羊抗鼠免疫球蛋白G(H+L)抗體、羊抗兔免疫球蛋白G(H+L)抗體、蘇木精伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司;丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒,南京建成生物工程研究所;PI3K、p-PI3K(phospho-phosphotylinosital 3 kinase)、Akt、p-Akt(phospho-protein kinase B)抗體,Affinity Biosciences公司;聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜,美國Merck &Millipore公司;增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影液,天能生物公司;其他試劑均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

新物體識(shí)別系統(tǒng),江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;Axio Vert A1 型倒置熒光顯微鏡,德國蔡司公司;ASP 200S型組織脫水機(jī)、1150H型石蠟包埋機(jī)、RM2245型手動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī),德國萊卡公司;SCIENTZ-48型高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技股份有限公司;4K15型冷凍離心機(jī),德國Sigma公司;Tanon-1000型凝膠成像儀,上海天能科技有限公司;DYY-8C 型電泳儀,北京市六一儀器廠;UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì),日本島津公司;FC全自動(dòng)酶標(biāo)儀,美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組和睡眠剝奪模型建立

將60只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為4 組,每組15只,分別為空白組、模型組、COS3組、COS5組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,按照SPF小鼠飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn),給予小鼠以12 h為周期的光照循環(huán),保持飼養(yǎng)溫度為(22±2) ℃,空氣濕度為40%～70%。每籠5只小鼠,并在適應(yīng)環(huán)境7 d后,使用耳標(biāo)鉗,對(duì)每只小鼠進(jìn)行標(biāo)記。每7 d更換滅菌墊料,每天稱量小鼠體重。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作都通過江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理與動(dòng)物福利委員會(huì)的審核,倫理審核的編號(hào)為JN.No20220615c0600901[201]。

采用MMPM法建立睡眠剝奪模型。實(shí)驗(yàn)箱均為20 cm×30 cm×40 cm的透明箱,其中模型組的箱子底部安置20個(gè)小平臺(tái),直徑3 cm,高5 cm,每個(gè)平臺(tái)間隔4 cm;空白組的箱底安置15個(gè)大平臺(tái),直徑12 cm,高5 cm。把模型組、COS3組和COS5組的小鼠放到小平臺(tái)上,小鼠進(jìn)入睡眠后,由于肌張力降低而接觸水或掉到水中,突然驚醒,利用嚙齒類動(dòng)物畏水的生活習(xí)性,促使小鼠站立在水平臺(tái)上;把空白組小鼠放到大平臺(tái)上,小鼠可以正常睡眠。在箱內(nèi)裝入清水,使水面低于平臺(tái)約1 cm,箱頂蓋上籠蓋,放置水瓶和飼料,小鼠可在平臺(tái)間活動(dòng),每天及時(shí)更換箱內(nèi)的水。小鼠每天在箱內(nèi)活動(dòng)20 h后,放回小鼠飼養(yǎng)籠內(nèi)休息4 h。在睡眠剝奪過程(PD8～PD28,共21 d)中,觀察記錄各組小鼠的精神狀態(tài),每天稱量小鼠的體重,連續(xù)稱量3周,稱重后根據(jù)體重進(jìn)行灌胃。正式實(shí)驗(yàn)開始前將小鼠置于睡眠剝奪箱適應(yīng)5 d,每日1次,每次2 h。

1.3.2 COS干預(yù)給藥

通過灌胃法對(duì)小鼠進(jìn)行給藥,給藥情況如下:根據(jù)國家關(guān)于COS作為“食品新原料”的規(guī)定[11],COS的每人每日推薦量為≤0.5 g,換算成每只小鼠每日劑量為65 mg/kg(以體重計(jì))。用生理鹽水將COS3和COS5配制成質(zhì)量濃度為6.5 mg/mL的溶液,給藥體積為0.1 mL/10 g體重,給藥周期為PD8～PD28,共給藥21 d。每天對(duì)COS3組和COS5組分別進(jìn)行灌胃,空白組和模型組灌胃相同劑量生理鹽水。

1.3.3 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)分為學(xué)習(xí)階段和測(cè)試階段,2個(gè)階段間隔24 h。1)學(xué)習(xí)階段:將2個(gè)完全相同的物體放在靠近箱體一側(cè)壁的兩端,將小鼠從積木對(duì)面墻面的中心點(diǎn)背對(duì)積木放下,讓小鼠在箱體內(nèi)自由探索10 min,記錄學(xué)習(xí)階段小鼠探索2個(gè)完全相同物體A1、A2的時(shí)間;2)測(cè)試階段:間隔24 h后,將其中的一個(gè)物體換成新的物體B,讓小鼠在箱體內(nèi)自由探索10 min,記錄測(cè)試階段小鼠探索新物體和舊物體的時(shí)間以及辨別指數(shù)(discrimination index, DI)。DI的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:t1,新物體探索時(shí)間;t2,舊物體探索時(shí)間。

1.3.4 小鼠腦組織取材

各組小鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的戊巴比妥鈉溶液(10 mL/kg體重),麻醉后脫臼處死,在冰盒上取出全腦,分離出左右海馬體,-80 ℃保存,用于后續(xù)蛋白免疫印跡測(cè)定。同時(shí)每組隨機(jī)選擇3只小鼠,腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的戊巴比妥鈉溶液(10 mL/kg體重),麻醉后用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L、pH 7.4)進(jìn)行心臟灌注,灌注結(jié)束后脫臼處死小鼠,于冰上分離全腦,置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液中,用于后續(xù)HE染色實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 HE染色

取1.3.4節(jié)固定于多聚甲醛溶液中的小鼠全腦,經(jīng)過脫水、浸蠟包埋、切片、展片、烘片、水化、復(fù)水、HE染色、復(fù)水、封片處理后,采用倒置熒光顯微鏡觀察小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的組織形態(tài)。

1.3.6 海馬氧化還原狀態(tài)的測(cè)定

取1.3.4節(jié)凍存在-80 ℃的海馬組織,參考試劑盒說明書測(cè)定海馬中SOD、MDA、T-AOC水平,結(jié)果以蛋白質(zhì)含量計(jì)。

1.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡測(cè)定海馬蛋白表達(dá)

取1.3.4節(jié)凍存在-80 ℃的海馬組織,向每10 mg海馬樣本中加入100 μL的RIPA裂解液,勻漿后在冰上裂解30 min,離心后測(cè)定上清液的蛋白含量,根據(jù)溶液體積加入上樣緩沖液,煮沸使蛋白變性。SDS-PAGE凝膠,每孔上樣20～40 μg,待溴酚藍(lán)跑到底,停止電泳,將目標(biāo)條帶切下,在250 mA恒定電流作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用TBST(Tris buffered saline with Tween-20)洗滌膜3次,每次5 min。然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂乳封閉2 h,封閉結(jié)束后,用TBST洗滌膜3次。采用一抗稀釋液稀釋一抗:PI3K(體積比1∶1 000)、Akt(體積比1∶1 000)、p-PI3K(體積比1∶500)、p-Akt(體積比1∶500),將膜在4 ℃下與一抗孵育過夜。用TBST洗滌膜5次,每次5 min。然后與相應(yīng)的二抗(體積比1∶1 000)常溫孵育2 h,用TBST洗滌膜5次,每次5 min。采用ECL工作液進(jìn)行顯影拍照,并用ImageJ進(jìn)行光密度分析計(jì)算,進(jìn)行顯著性分析。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析與繪圖

采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素(ANOVA)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),事后檢驗(yàn)采用Duncan法,P<0.05表示有顯著差異。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 COS3和COS5對(duì)睡眠剝奪小鼠體重及精神狀態(tài)的影響

體重減輕、精神狀態(tài)下降是睡眠剝奪小鼠造模成功的典型性狀之一。如圖1所示,在睡眠剝奪初期(0～6 d),空白組小鼠體重呈現(xiàn)輕微下降的趨勢(shì),而在睡眠剝奪后期,空白組小鼠體重逐漸增長至初始體重。模型組小鼠從睡眠剝奪開始體重顯著降低,與空白組相比,模型組小鼠第21天的體重顯著降低9.16%(P<0.01)。而COS3和COS5均能夠在一定程度上緩解睡眠剝奪小鼠的體重下降,其中COS3組小鼠的體重顯著增加3.52%(P<0.01)。結(jié)果表明,COS3和COS5均能夠改善睡眠剝奪小鼠的體重下降,效果為COS3>COS5。同時(shí),模型組小鼠在睡眠剝奪初期出現(xiàn)互相攻擊增多、煩躁不安的表現(xiàn),隨著造模時(shí)間的增加,小鼠出現(xiàn)精神萎靡、行為呆板、落水明顯增加、對(duì)外界反應(yīng)遲鈍等癥狀。與模型組相比,COS3組和COS5組小鼠落水明顯減少,精神狀態(tài)得到顯著改善。

圖1 COS3和COS5對(duì)睡眠剝奪小鼠體重變化率的影響Fig.1 Effects of COS3 and COS5 on body weight change rate of sleep-deprived mice注:#與空白組比較差異顯著(P<0.05);##與空白組比較差異極顯著(P<0.01);*與模型組比較差異顯著(P<0.05);**與模型組比較差異極顯著(P<0.01)(下同)。

睡眠剝奪對(duì)小鼠體重的影響是多方面的,除了內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂,也會(huì)導(dǎo)致焦慮、消極等情緒變化。實(shí)驗(yàn)初期的體重下降可以部分歸因于小鼠對(duì)睡眠剝奪中水環(huán)境的不適應(yīng)。短時(shí)間(0～6 d)的睡眠剝奪帶來的焦慮行為導(dǎo)致了小鼠活動(dòng)量增加,體重呈下降趨勢(shì),而在長時(shí)間(9～21 d)的睡眠剝奪后,小鼠的焦慮行為向消極行為轉(zhuǎn)變,能量消耗減小,因此也帶來體重的回升[12]。LI等[13]發(fā)現(xiàn),患腸應(yīng)激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)會(huì)出現(xiàn)明顯的抑郁癥相關(guān)焦慮行為,而COS可以通過穿透BBB改善IBS引發(fā)的小鼠抑郁樣行為,這也與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

2.2 COS3和COS5對(duì)睡眠剝奪小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

對(duì)新物體的偏好降低程度是判斷睡眠剝奪小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的重要指標(biāo)之一。由表1可知,在學(xué)習(xí)階段中,各組小鼠對(duì)2個(gè)物體A1、A2的探索時(shí)間均無顯著差異。由圖2可知,在測(cè)試階段中,與空白組相比,模型組的DI值基本為0(P<0.01),說明模型組小鼠經(jīng)過學(xué)習(xí)后未對(duì)舊物體形成深刻記憶,睡眠剝奪明顯造成了工作記憶能力的缺陷,這與許多研究結(jié)果一致[14]。與模型組相比,COS3組和COS5組的DI顯著增加(P<0.01),其中,COS3的DI比COS5高11.49%。

表1 學(xué)習(xí)階段小鼠對(duì)物體A1、A2的探索時(shí)間 單位:sTable 1 Exploration time of object A1 and A2 in mice during learning phase

圖2 測(cè)試階段COS3和COS5對(duì)睡眠剝奪小鼠辨別指數(shù)的影響Fig.2 Effects of COS3 and COS5 on discrimination index in sleep-deprived mice during testing phase

新物體識(shí)別測(cè)試是一種高度驗(yàn)證海馬相關(guān)認(rèn)知功能的方法。利用小鼠對(duì)新穎物體的偏好特性,經(jīng)過學(xué)習(xí)后,在自然條件下對(duì)新舊物體進(jìn)行探索。在LIU等[15]的報(bào)道中,小鼠由于患肝性腦病導(dǎo)致認(rèn)知障礙、學(xué)習(xí)和記憶遲緩等缺陷,在口服COS后得到顯著緩解,100 mg/kg COS干預(yù)可以顯著提高肝性腦病小鼠在探索新物體上花費(fèi)的時(shí)間以及DI,與本研究結(jié)果一致。結(jié)果表明,COS3和COS5干預(yù)能夠顯著改善睡眠剝奪導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降,效果為COS3>COS5。

2.3 COS3和COS5對(duì)睡眠剝奪小鼠腦組織病理學(xué)的影響

學(xué)習(xí)記憶能力受大腦中多個(gè)部位的影響,而其中聯(lián)系最密切的是海馬體。有研究表明,無論是完全性睡眠剝奪還是部分睡眠剝奪,都會(huì)不同程度地造成海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷[16]。由圖3可知,與空白組相比,模型組腦神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯固縮變形,細(xì)胞間隙變大,且排列不規(guī)則,有一部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)壞死,說明睡眠剝奪導(dǎo)致小鼠腦組織形態(tài)損傷明顯。與模型組相比,COS3組和COS5組小鼠腦組織形態(tài)明顯恢復(fù),神經(jīng)細(xì)胞排列緊密,層次清楚,細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞核清晰。病理學(xué)結(jié)果表明COS3和COS5對(duì)緩解睡眠剝奪小鼠的腦神經(jīng)細(xì)胞損傷有一定作用。JIANG等[17]研究發(fā)現(xiàn),殼寡糖具有促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的作用,在5種COS單體中,COS3對(duì)于促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)外植體的神經(jīng)元生長具有最好的效果。

a-空白組;b-模型組;c-COS3組;d-COS5組圖3 COS3和COS5對(duì)睡眠剝奪小鼠腦組織形態(tài)的影響(400×)Fig.3 Effects of COS3 and COS5 on brain tissue morphology in sleep-deprived mice(400×)

2.4 COS3和COS5對(duì)睡眠剝奪小鼠海馬氧化應(yīng)激損傷的影響

睡眠缺失會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別容易受到氧化應(yīng)激的影響,導(dǎo)致MDA水平上升,SOD和T-AOC水平下降[18]。海馬是最容易受到氧化應(yīng)激損傷的腦區(qū)之一。由圖4-a和圖4-b可知,與空白組相比,模型組海馬SOD和T-AOC水平分別顯著降低30.96%和56.09%(P<0.01)。經(jīng)過COS3和COS5干預(yù)后,與模型組相比,COS3組和COS5組的SOD水平分別顯著上升27.23%、20.97%(P<0.01);COS3組和COS5組的T-AOC水平分別顯著上升92.91%、81.49%(P<0.01)。效果為COS3>COS5。由圖4-c可知,與空白組相比,模型組海馬MDA水平顯著升高67.08%(P<0.01)。經(jīng)過COS3和COS5干預(yù)后,與模型組相比,COS3組和COS5組的MDA水平分別顯著下降24.67%、23.81%(P<0.01)。效果為COS3>COS5。

a-SOD水平;b-T-AOC水平;c-MDA水平圖4 COS3和COS5對(duì)睡眠剝奪小鼠海馬氧化損傷的影響Fig.4 Effects of COS3 and COS5 on hippocampal oxidative damage in sleep-deprived mice

神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致認(rèn)知障礙的重要途徑。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,是氧化應(yīng)激最敏感的指標(biāo)之一,小鼠海馬MDA含量變化可以間接反映出細(xì)胞氧化損傷程度[19]。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑,異常的SOD活動(dòng)與神經(jīng)紊亂有關(guān)。而T-AOC是指抗氧化酶和抗氧化物等構(gòu)成的總抗氧化水平。陳逸倫[20]發(fā)現(xiàn)每日45 mg/kg體重COS干預(yù)能顯著緩解酒精誘導(dǎo)的抗氧化酶活力的下降,提高新生SD大鼠的清除自由基和抗氧化的能力,改善酒精性神經(jīng)損傷。KSADERE等[21]研究發(fā)現(xiàn)每日200 mg/kg體重COS可以抑制鎘誘導(dǎo)的海馬組織中MDA含量增加,緩解腦組織中由于超氧自由基的過量產(chǎn)生介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化,并通過提高海馬中抗氧化劑SOD活性,保護(hù)Wistar大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞。李克成[22]研究發(fā)現(xiàn),低聚合度的殼寡糖具有更強(qiáng)的羥自由基清除活性和還原能力,在所有殼寡糖樣品中,COS3的羥自由基清除活性最高,與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從氧化應(yīng)激角度印證了COS3和COS5具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用,效果為COS3>COS5。

2.5 COS3和COS5對(duì)睡眠剝奪小鼠PI3K/Akt相對(duì)表達(dá)水平的影響

PI3K/Akt通路是胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑,與細(xì)胞代謝、增殖、存活和生長密切相關(guān)[23]。睡眠剝奪可降低海馬體Akt、PI3K的磷酸化水平[24]。由圖5可知,各組小鼠的PI3K和Akt蛋白水平?jīng)]有顯著差異。與空白組相比,模型組海馬p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt表達(dá)水平分別顯著下降60.24%、46.31%(P<0.01),說明睡眠剝奪抑制了小鼠海馬PI3K/Akt信號(hào)通路。經(jīng)過COS3和COS5干預(yù)后,與模型組相比,COS3組和COS5組p-PI3K/PI3K表達(dá)水平顯著提升52.20%和50.94%(P<0.01);COS3組和COS5組p-Akt/Akt表達(dá)水平顯著提升98.15%和88.08%(P<0.01),說明COS3和COS5干預(yù)可能通過上調(diào)PI3K和Akt的磷酸化蛋白水平,激活PI3K/Akt信號(hào)通路,效果為COS3>COS5。

a-p-PI3K的相對(duì)表達(dá)量;b-p-Akt的相對(duì)表達(dá)量圖5 COS3和COS5對(duì)睡眠剝奪小鼠海馬PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt表達(dá)的影響Fig.5 Effects of COS3 and COS5 on expression of PI3K, p-PI3K, Akt, and p-Akt in hippocampus of sleep-deprived mice

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)能夠激活蛋白激酶B(Akt),并積極參與自噬的調(diào)節(jié)。Akt是絲氨酸/蘇氨酸激酶,是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)主要下游目標(biāo)。它是促進(jìn)細(xì)胞生存、抑制細(xì)胞凋亡和維持正常功能的關(guān)鍵信號(hào)分子。睡眠剝奪會(huì)導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路活性降低,引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和記憶認(rèn)知障礙。激活PI3K/Akt信號(hào)通路能夠預(yù)防睡眠剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和丟失,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,該過程由一系列下游底物的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化介導(dǎo)。LI等[23]發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA對(duì)大鼠急性睡眠剝奪所致認(rèn)知障礙具有神經(jīng)保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能是激活海馬區(qū)CNR1/PI3K/AKT通路,增加p-PI3K和p-Akt的表達(dá),改善海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷,抑制海馬細(xì)胞細(xì)胞凋亡。CAO等[24]發(fā)現(xiàn)莫達(dá)非尼增強(qiáng)了PI3K和Akt的磷酸化,通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路減輕海馬神經(jīng)元的過度自噬。另外,Akt的激活與其磷酸化位點(diǎn)Thr308和Ser473密切相關(guān),Akt的激活主要依賴于Ser473的磷酸化[25]。本研究結(jié)果表明,磷酸化位點(diǎn)為Ser473的p-Akt在睡眠剝奪小鼠海馬中的表達(dá)量顯著降低,而COS3和COS5干預(yù)逆轉(zhuǎn)了這種降低;然而,Akt的蛋白水平無顯著變化,說明Akt是通過其磷酸化途徑發(fā)揮作用的。越來越多的研究表明,COS能夠通過刺激PI3K/Akt信號(hào)通路保護(hù)不同來源的神經(jīng)元,例如皮層神經(jīng)細(xì)胞、海馬神經(jīng)細(xì)胞和小腦顆粒神經(jīng)細(xì)胞。XU等[26]發(fā)現(xiàn)COS可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,并且COS的抗細(xì)胞凋亡作用可以被PI3K的化學(xué)抑制所阻斷。賈鵬[27]發(fā)現(xiàn)COS可減緩H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞,這種保護(hù)作用依賴于胞內(nèi)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的增強(qiáng)。因此,本研究結(jié)果表明,COS3和COS5可能通過上調(diào)p-PI3K和p-Akt的表達(dá),激活PI3K/Akt信號(hào)通路來抑制睡眠剝奪誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。YANG等[28]研究發(fā)現(xiàn)COS能夠通過PI3K/Akt信號(hào)通路激活RAW 264.7細(xì)胞,其中α-COS比β-COS更具活性。在帕金森模型中,COS3表現(xiàn)出更好的多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)作用[10]。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致,COS3和COS5可能通過上調(diào)p-PI3K和p-Akt水平,激活PI3K/Akt信號(hào)通路,效果為COS3>COS5。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,COS3和COS5干預(yù)對(duì)睡眠剝奪小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力均有一定程度的改善作用,在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中能顯著改善睡眠剝奪小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,其發(fā)揮作用的機(jī)制可能是通過降低小鼠海馬氧化應(yīng)激損傷,激活PI3K/Akt信號(hào)通路,從而抑制海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮對(duì)睡眠剝奪小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的效果。從本文所檢測(cè)的指標(biāo)來分析,與COS5組相比,相同劑量的COS3干預(yù)對(duì)睡眠剝奪小鼠體重減輕、DI降低、氧化應(yīng)激和PI3K、Akt的磷酸化水平下降具有更好的抑制作用,這可能是由于COS3的聚合度低于COS5的緣故,具體的原因需要深入探究。COS3和COS5對(duì)睡眠剝奪造成的學(xué)習(xí)記憶下降的改善作用及其潛在機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究,后續(xù)研究可以圍繞神經(jīng)炎癥、突觸可塑性等其他方面開展。