夏雪娟,陳莉敏,李冠楠

1(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海,200093)2(西南大學(xué) 蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)3(家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室,重慶,400715)

胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)是一種腸促胰島素激素,可通過調(diào)控胰島素和胰高血糖素分泌延緩胃排空、降低食欲,發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖的作用[1]。GLP-1及其受體已被開發(fā)為新型降糖藥物(例如利拉魯肽、艾塞那肽等),在治療2型糖尿病方面取得良好效果[2-3]。GLP-1主要由遠端回腸和結(jié)腸中的腸內(nèi)分泌細胞分泌。腸內(nèi)分泌細胞屬于分化型腸上皮細胞的一種,是腸道中的營養(yǎng)感受器,其細胞表面存在糖、蛋白質(zhì)和脂肪等各種營養(yǎng)成分的感應(yīng)受體,當(dāng)接收到了腸腔中營養(yǎng)物質(zhì)刺激后,能夠釋放相應(yīng)的腸內(nèi)分泌激素[1, 3-4]。而腸道中,特別是回腸遠端和結(jié)腸中還存在著大量的腸道微生物。近年來,越來越多的研究指出,腸道菌群在包括糖尿病在內(nèi)的多種慢性疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[5-6],且有研究指出腸道菌群是調(diào)節(jié)GLP-1等腸促激素產(chǎn)生的重要因素[7-9]。因此,靶向腸道菌群調(diào)節(jié)腸促激素代謝已成為糖尿病等慢性代謝性疾病防治的研究熱點之一。

乳酸菌是腸道微生物的關(guān)鍵組成部分[4, 10]。目前,已有部分學(xué)者開展了乳酸菌對GLP-1分泌的影響研究。如SIMON等[11]采用隨機臨床對照試驗研究羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)對葡萄糖耐受人群GLP-1分泌的影響,發(fā)現(xiàn)與安慰劑相比,每天服用L.reuteri會顯著增加GLP-1的釋放。類似地,WANG等[12]研究表明干酪乳酸菌(L.caseiCCFM419)干預(yù)會增加糖尿病小鼠GLP-1水平。上述研究均顯示LAB干預(yù)會增加GLP-1水平,但由于人體和動物試驗存在“黑箱效應(yīng)”,無法準(zhǔn)確定位作用途徑。因此,部分學(xué)者開展了細菌-細胞體外共培養(yǎng)試驗以期揭示調(diào)控機理。如PANWAR等[4]通過將多種乳桿菌(Lactobacillus)與腸內(nèi)分泌細胞共培養(yǎng),證實了乳酸菌可增加腸道內(nèi)分泌細胞GLP-1分泌。WEI等[9]采用LAB與小鼠腸內(nèi)分泌細胞STC-1共培養(yǎng)模型篩選出可增強GLP-1分泌的兩株乳桿菌L.kefiranofaciensM和L.kefiriK。但細菌直接接觸細胞的培養(yǎng)體系無法有效模擬體內(nèi)環(huán)境,因為體內(nèi)環(huán)境中腸內(nèi)分泌細胞與細菌間存在著腸道黏液等隔離層;此外,高濃度的細菌對細胞存在毒性作用,因此研究結(jié)果可能無法直接類推到體內(nèi)[13]。對此,一些研究人員構(gòu)建了復(fù)雜的體外模型來研究細胞-微生物互作機理,但此類模型對實驗室基礎(chǔ)設(shè)施和人員操作技術(shù)要求較高[14]。因此,為規(guī)避上述局限性,本研究將采用一種簡單易操作、接近體內(nèi)環(huán)境的體外共培養(yǎng)模型分析乳桿菌對腸道內(nèi)分泌細胞GLP-1分泌的影響,以期更真實的揭示乳桿菌調(diào)控糖尿病代謝的作用途徑。

考慮到腸內(nèi)分泌細胞的需氧性、乳桿菌的兼性厭氧性、腸道環(huán)境的低氧性,本研究將采用體細胞(有氧)-黏液層-細菌(微需氧)共培養(yǎng)體系分析乳桿菌對細胞GLP-1分泌的影響。選取的pGIP/Neo STC-1細胞系可產(chǎn)生高濃度的肽激素,是研究GLP-1分泌的良好腸內(nèi)分泌細胞模型[4]。同時考慮到前期直接的共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、植物乳桿菌(L.plantarum)和約翰氏乳桿菌(L.johnsonii)可促進腸內(nèi)分泌細胞GLP-1分泌,此外研究表明上述3種乳桿菌具有調(diào)節(jié)糖尿病等慢性代謝性疾病和改善腸道穩(wěn)態(tài)的功能[4, 15-18]。因此,研究將選用上述3種菌株,設(shè)立不同濃度的乳桿菌菌株共培養(yǎng)體系以分析菌株的劑量效應(yīng);設(shè)立黏液層缺失組以觀察黏液層的缺失對體系的影響;設(shè)立共培養(yǎng)管螺旋蓋輕旋組和緊閉組以考察不同O2暴露情況對體系的影響。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析體系中GLP-1水平的變化,共培養(yǎng)前后體系pH值、細胞活力以及細菌在細胞周圍的分布情況。同時,驗證了共培養(yǎng)后體系pH值改變對ELISA結(jié)果的影響,并結(jié)合胞內(nèi)GLP-1熒光染色確保pH值校正后ELISA結(jié)果的可靠性。本研究將為靶向腸道菌群調(diào)節(jié)宿主GLP-1代謝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosusNCIMB6375)、約翰氏乳桿菌(L.johnsoniiNCIMB8795),英國阿伯丁國家工業(yè)、食品和海洋細菌收藏中心。植物乳桿菌(L.plantarumKC491380)從健康嬰兒糞便中分離得到。腸內(nèi)分泌細胞系pGIP/Neo STC-1由英國貝爾法斯特女王大學(xué)B.Green教授提供,該細胞系是異質(zhì)多能鼠STC-1細胞的亞克隆,可對多種刺激做出反應(yīng)分泌GLP-1。

乳桿菌MRS培養(yǎng)基(7406A)、瓊脂(7178A),英國Neogen Euope公司;含有4.5 g/LL-谷氨酰胺而不含丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)基,美國生命技術(shù)公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素、鏈霉素、遺傳霉素-G418、Ⅱ型豬黏蛋白、HEPES緩沖鹽(NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2)、葡萄糖、HEPES、福爾馬林、甘氨酸、山羊血清、牛血清白蛋白(bull serum albumin,BSA),德國Sigma公司;GLP-1 ELISA試劑盒(EGLP-35K),德國Merck Millipore公司;2 g/L Trypan blue溶液、Hoechst 33342(20 mmol/L)、透化溶液、吐溫20,賽默飛世爾科技公司;GLP-1-FITC抗體,百歐泰生物科技有限公司。其余均為實驗室常用試劑,市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Hera cells 150 CO2培養(yǎng)箱、Invitrogen細胞計數(shù)儀、Savant SPD2010 SpeedVac濃縮儀、Cell Insight NXT High Content篩選平臺,賽默飛世爾科技;ROTINA 380 臺式離心機,德國Andreas Hettich有限責(zé)任公司;FE20/EL20型pH計,瑞士梅特勒-托利多有限公司;AxioCam顯微鏡,德國ZEISS公司;其余為實驗室常用設(shè)備。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌菌株預(yù)培養(yǎng)

將3株乳桿菌菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃過夜(16～18 h)培養(yǎng)進行復(fù)蘇活化。而后涂布于MRS瓊脂平板上,過夜培養(yǎng)后用Parafilm封口膜封口,4 ℃保存?zhèn)溆?限1周內(nèi)使用)。共培養(yǎng)前一天,挑取單個菌落接種到10 mL MRS培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。然后使用MRS液體培養(yǎng)基將細菌培養(yǎng)物稀釋至OD600=1.5(相當(dāng)于細菌濃度為1×109CFU/mL[4])。將稀釋的細菌培養(yǎng)物4 ℃保存,將在同一天用于與pGIP/Neo STC-1細胞共培養(yǎng)。

1.3.2 腸內(nèi)分泌細胞預(yù)培養(yǎng)

將pGIP/Neo STC-1細胞從液氮中復(fù)蘇至補充有4.5 g/LL-谷氨酰胺(不含丙酮酸鈉)、100 g/L FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和400 g/mL遺傳霉素-G418的DMEM培養(yǎng)基中,而后置于37 ℃、5% CO2(體積分數(shù),下同)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每周傳代兩次。將采用第20～50代細胞用于共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)前一天,將細胞以2×106個/孔的濃度接種于含有蓋玻片(圓形,直徑19 mm)的12孔組織培養(yǎng)板中,并在37 ℃孵育過夜(18～24 h),以使細胞黏附于蓋玻片上。共培養(yǎng)前1 h,吸棄原含抗生素DMEM培養(yǎng)基,然后向每孔加入不含抗生素的新鮮1 mL預(yù)熱DMEM培養(yǎng)基。

1.3.3 共培養(yǎng)體系建立

將含有10 g/L瓊脂的1 000 mL MRS培養(yǎng)基高壓滅菌并冷卻至約40 ℃,而后加入1 mL 1.3.1節(jié)中已稀釋的乳桿菌培養(yǎng)物,搖晃均勻。將該接種物以40 mL/管轉(zhuǎn)移到50 mL無菌管中,靜置30 min使其凝固。而后向頂部加入1 mL無菌黏液(50 g/L黏蛋白和8 g/L瓊脂,pH 6.8),靜置10 min使其凝固。再將1.3.2節(jié)中制備的帶有pGIP/Neo STC-1細胞的蓋玻片倒置放在黏液層頂部(含有細胞面朝向黏液層),然后加入不含抗生素的預(yù)熱DMEM培養(yǎng)基至總體積為50 mL,蓋上試管螺旋蓋。最后,將共培養(yǎng)體系置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)18 h。共培養(yǎng)體系的制備流程見電子版增強出版附圖1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035891)。

圖1 氧氣暴露和黏液層缺失對GLP-1分泌的影響Fig.1 Effect of oxygen exposure and missing mucus layer on the GLP-1 secretion of cells注:“+”為含有,“-”為不含有。柱狀圖中不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)(下同)。

為研究不同乳桿菌數(shù)量對細胞的影響,根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,將L.rhamnosus和L.johnsonii的濃度梯度設(shè)置為1×109、1×108、1×107CFU/1 000 mL,將L.plantarum濃度梯度設(shè)置為1×109、1×108、1×107、1×106、1×105CFU/1 000 mL。同時,為分析不同氧濃度對共培養(yǎng)體系的影響,分別設(shè)置試管螺旋蓋輕旋和緊閉體系以測試O2暴露情況對體系的影響。另外還設(shè)有無黏液層的體系,以研究黏液存在與否對體系的影響。設(shè)置不含乳桿菌以及同時不含乳桿菌和細胞的體系作為對照。每種條件設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.4 頂部液體培養(yǎng)基收集和pH檢測

共培養(yǎng)結(jié)束后,小心收集體系頂部的液體培養(yǎng)基(約10 mL)至15 mL離心管中(置于冰上),而后4 ℃、5 000×g離心5 min以去除細胞和細菌。收集上清液并測量其pH值,然后將上清液于-80 ℃下儲存以備GLP-1含量測定。

1.3.5 GLP-1分泌量檢測

采用ELISA試劑盒測定頂部液體培養(yǎng)基中的GLP-1含量?？紤]到試劑盒的檢測限,將上清液用濃縮器真空濃縮24 h,然后溶解在HEPES緩沖液(pH 7.4)中。本課題組之前的研究經(jīng)驗提示ELISA測試結(jié)果可能會受溶液pH值的影響,為了驗證這一猜想,測定了濃縮溶液調(diào)節(jié)pH前后(使用1 mol/L HCl溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)到7.4)GLP-1濃度的不同?；诖蓑炞C試驗結(jié)果,后續(xù)在GLP-1測定前統(tǒng)一將溶解溶液pH值調(diào)節(jié)至7.4。

1.3.6 細胞活力測試

去除體系頂部液體培養(yǎng)基后,使用細胞刮刀小心地將黏附在蓋玻片上的細胞刮下并移至1 mL預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基中。用2 g/L Trypan blue溶液染色后,使用細胞計數(shù)器檢查細胞活力。

1.3.7 革蘭氏染色和細胞內(nèi)GLP-1成像

為檢查蓋玻片上細菌的分布情況,在去除頂部液體培養(yǎng)基后,對蓋玻片(帶細胞)上的乳桿菌進行革蘭氏染色,100倍油鏡下觀察拍照。

使用Cell Insight NXT High Content篩選平臺對細胞內(nèi)GLP-1進行可視化成像。共培養(yǎng)后,將黏附在蓋玻片上的細胞小心地移至12孔組織培養(yǎng)板中。向每孔中加入1 mL 100 g/L福爾馬林以固定細胞,之后用1×PBS洗滌細胞4次。加入含有1 g/L Trition X-100的PBS溶液,室溫下透化30 min,用1×PBS洗滌細胞4次。在室溫下加入封閉溶液(PBS含0.1 g/L吐溫20、0.3 mol/L甘氨酸、100 g/L山羊血清和10 g/L BSA)1 h。然后除去封閉溶液,用含有0.1 g/L吐溫和10 g/L BSA的PBS稀釋GLP-1-FITC抗體至1∶200(U∶mL),并在4 ℃暗處孵育過夜以染色GLP-1。除去上清液,用1×PBS洗滌細胞3次,每次5 min。加入Hoechst溶液,并在室溫下在暗處孵育10 min以染色細胞核。用1×PBS洗滌兩次,而后重新加入1×PBS,采集細胞在350～461 nm(Hoechst)和485～520 nm(GLP-1-FITC抗體)處的顯微圖像和熒光強度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件組間one-way ANOVA檢測,檢驗的顯著性水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對GLP-1測試結(jié)果的影響

由于乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸會改變體系pH,因此首先研究了pH對GLP-1濃度ELISA測定結(jié)果的影響,結(jié)果如電子版增強出版附圖2所示。共測試6組樣本(Groups 1～6),每組3份平行樣品,其中一份樣品的pH值未調(diào)節(jié),另外兩份調(diào)節(jié)至pH為7.4(同ELISA試劑盒緩沖液pH值)。共培養(yǎng)后,未調(diào)節(jié)樣品的pH值高于7.4(第1、2、5組)或低于7.4(第3、4、6組)。來自同一組的3個樣品具有相同的培養(yǎng)條件。然而,當(dāng)pH值不同時,與其他兩個樣品(調(diào)節(jié)pH)相比,pH值未調(diào)節(jié)的樣品的GLP-1濃度結(jié)果呈現(xiàn)不規(guī)則的明顯變化。而同一組中pH值相同的兩個樣品則擁有相似的GLP-1結(jié)果。這些結(jié)果表明溶液pH值會影響GLP-1的ELISA檢測結(jié)果。

圖2 L.rhamnosus對細胞分泌GLP-1的影響Fig.2 Effect of L.rhamnosus on the GLP-1 secretion of pGIP/Neo STC-1 cells注:L.rhamnosus行數(shù)值為體系中初始細菌濃度,單位為CFU/1 000 mL(下同)。

2.2 O2暴露和黏液層對細胞GLP-1分泌的影響

通過設(shè)置試管螺旋蓋緊閉(Tube-closed)組和無黏液層(No-mucus)組,經(jīng)與不含細菌的對照(Control)組和不含乳桿菌和細胞的空白對照(Blank)組比較,分析O2暴露情況和黏液存在與否對體系的影響。共培養(yǎng)體系的實拍圖見電子版增強出版附圖3。各組GLP-1濃度見圖1,結(jié)果表明,No-mucus組的GLP-1濃度(15.13 pmol/L)顯著低于Control組(26.01 pmol/L)(P<0.05),說明黏液層缺失會降低GLP-1分泌。類似地,Tube-closed組的GLP-1濃度(14.58 pmol/L)明顯低于Control組(P<0.05),說明限制O2量會降低GLP-1分泌。

圖3 L.plantarum對細胞分泌GLP-1的影響Fig.3 Effect of L.plantarum on the GLP-1 secretion of pGIP/Neo STC-1 cells

2.3 乳桿菌對pGIP/Neo STC-1細胞GLP-1分泌的影響

2.3.1L.rhamnosus

圖2展示了與L.rhamnosus共同培養(yǎng)后pGIP/Neo STC-1細胞GLP-1的分泌情況。各組的條件設(shè)置見圖下方標(biāo)注。Lr-1組的GLP-1分泌明顯高于Lr-C組(P<0.05),而Lr-1、Lr-4和Lr-5組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果表明,L.rhamnosus會增加PGIP/Neo STC-1細胞的GLP-1分泌,且菌株初始濃度為1×109、1×108、1×107CFU/1 000 mL時促進效果是相似的。Lr-2組的GLP-1分泌量明顯低于Lr-C組(P<0.05),說明與L.rhamnosus共培養(yǎng)時缺少黏液層會降低細胞GLP-1分泌量。另外,Lr-3組的GLP-1濃度與Lr-1組相比沒有顯著差異,說明限制O2條件并不影響該體系內(nèi)GLP-1分泌。

2.3.2L.plantarum

與L.plantarum共同培養(yǎng)后pGIP/Neo STC-1細胞分泌GLP-1的情況見圖3,各組的條件設(shè)置見圖下方標(biāo)注。Lp-1和Lp-4組的GLP-1濃度明顯低于Lp-C組(P<0.05),Lp-5、Lp-6和Lp-7組間無顯著差異,表明L.plantarum初始濃度為1×105、1×106、1×107CFU/1 000 mL時,不影響細胞GLP-1的分泌。然而當(dāng)初始濃度為1×109CFU/1 000 mL或1×108CFU/1 000 mL,L.plantarum會減少細胞的GLP-1分泌量。Lp-2組的GLP-1濃度顯著低于Lp-1組(P<0.05),Lp-1與Lp-3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明在沒有黏液層的情況下,細胞的GLP-1分泌減少,而O2條件對于與L.plantarum共培養(yǎng)的細胞沒有顯著影響。

2.3.3L.johnsonii

圖4顯示了與L.johnsonii共同培養(yǎng)后pGIP/Neo STC-1細胞GLP-1的分泌情況,各組的條件設(shè)置見圖下方標(biāo)注。Lj-1組的GLP-1濃度顯著低于Lj-C組(P<0.05),Lj-C、Lj-4和Lj-5組間無顯著差異,說明當(dāng)L.johnsonii的初始濃度為1×107、1×108CFU/1 000 mL時,與其共培養(yǎng)不影響pGIP/Neo STC-1細胞的GLP-1分泌。而當(dāng)初始濃度為1×109CFU/1 000 mL時,會降低細胞的GLP-1分泌。Lj-2和Lj-3組的GLP-1濃度顯著低于Lj-1組(P<0.05),說明與L.johnsonii共培養(yǎng)時黏液層缺失或O2受限會減少細胞GLP-1分泌。

圖4 L.johnsonii對細胞分泌GLP-1的影響Fig.4 Effect of L.johnsonii on the GLP-1 secretion of pGIP/Neo STC-1 cells

2.4 體系pH值和細胞活力

共培養(yǎng)前后各組pH值變化見表1。Blank、Control和No-mucus組的pH值無顯著差異,而Tube-closed組的pH顯著低于上述3組(P<0.05),但仍高于7.4。Lr-C、Lp-C和Lj-C組的pH值分別顯著高于Lr-1～Lr-5、Lp-1～Lp-7和Lj-1～Lj-5組(P<0.05),說明L.rhamnosus、L.plantarum和L.johnsonii的存在降低了共培養(yǎng)體系的pH值。

表1 共培養(yǎng)后頂部液體培養(yǎng)基的pH值和細胞活力Table 1 pH of the top liquid medium and viability of cells after co-culture

Control、No-mucus和Tube-closed組的細胞活力無顯著差異(表1),表明在沒有乳桿菌存在時,黏液層缺失或限氧條件并不會影響pGIP/Neo STC-1細胞的活力。Lr-1、Lr-3、Lr-4和Lr-5組的細胞活力顯著低于Lr-C組(P<0.05),表明鼠李糖乳桿菌降低了共培養(yǎng)體系中的細胞活力。Lp-1、Lp-3和Lp-4組的細胞活力顯著低于Lp-C組(P<0.05),而Lp-C與Lp-5、Lp-6和Lp-7組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明植物乳桿菌在其起始濃度高于1×108CFU/1 000 mL時會降低細胞活力,當(dāng)濃度低于1×107CFU/1 000 mL時不影響細胞活力。約翰氏乳桿菌組也觀察到了相同的趨勢,因為Lj-1、Lj-3和Lj-4組的細胞活力顯著低于Lj-C和Lj-5組(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明不同乳桿菌菌株對pGIP/Neo STC-1細胞活力影響不同,且不同起始濃度的同一種乳酸菌濃度對細胞活力的影響也有差異。

2.5 革蘭氏染色和胞內(nèi)GLP-1熒光成像

革蘭氏染色的結(jié)果直觀顯示了蓋玻片上乳桿菌和細胞的分布情況(圖5)。在不含黏液層時,乳桿菌與細胞直接接觸(圖5-c),且部分細菌深入細胞內(nèi)部。在有黏液層的體系中,黏液層隔絕了部分細菌。然而,仍有部分細菌穿過黏液層,遷移至細胞表面(圖5-b、圖5-d)。說明在該體系中黏液層具有一定的屏障作用,但并不能隔絕所有細菌。為了驗證上清液中GLP-1水平是否真實反映GLP-1細胞內(nèi)生成情況,進行了細胞內(nèi)GLP-1成像分析(電子版增強出版附圖4)。結(jié)果顯示GLP-1強度與ELISA結(jié)果高度一致。說明ELISA結(jié)果具有較好的可靠性。

a-無細菌;b-常規(guī)共培養(yǎng)體系;c-無黏液層;d-管口緊閉圖5 共培養(yǎng)體系的革蘭氏染色結(jié)果Fig.5 Gram staining images of bacteria after co-culture with pGIP/Neo STC-1 cells

3 結(jié)論與討論

目前腸道微生物與宿主間的相互作用分析多依賴于動物模型[19-20],但該方法存在物種差異;此外,部分學(xué)者開展了細菌和體細胞直接共培養(yǎng)試驗[4, 9],但在體內(nèi)微生物與細胞之間存在黏液層,因此該方法無法準(zhǔn)確反映細菌細胞的互作情況。因此,構(gòu)建模擬體內(nèi)環(huán)境的體外共培養(yǎng)體系對細菌細胞互作研究具有重要意義。學(xué)者們已構(gòu)建出類器官培養(yǎng)技術(shù)[21]、生物反應(yīng)器模型[22]、微流控器官芯片裝置[23]等技術(shù)方法體系,但上述方法體系操作復(fù)雜,技術(shù)和設(shè)備要求高。本文采用的共培養(yǎng)體系改良自“Human oxygen-bacteria anaerobic”體系,該體系由SADAGHIAN SADABAD等[24]構(gòu)建,他們使用該系統(tǒng)研究了糞桿菌(Faecalibacteriumprausnitzii,專性厭氧菌)對人體細胞的影響。該方法構(gòu)建了簡單而獨特的體細胞-腸道微生物共生體系。在腸道微生物與宿主相互作用關(guān)系研究中具有良好的應(yīng)用潛力。然而,腸腔是低氧環(huán)境,細菌在不同的O2條件下的表現(xiàn)可能不同[25-26]。因此,考慮到乳桿菌的生長條件,本研究使用普通MRS培養(yǎng)基代替厭氧培養(yǎng)基,將細菌的厭氧條件改為低氧狀態(tài)。該體系的建立為研究體細胞與乳桿菌的互作提供了良好的方法模型。

研究分析了不同濃度L.rhamnosus、L.plantarum和L.johnsonii對pGIP/Neo STC-1細胞GLP-1分泌的影響。結(jié)果表明,L.rhamnosus會增加細胞的GLP-1分泌,而無濃度效應(yīng)。然而,當(dāng)L.plantarum和L.johnsonii的起始濃度分別低于1×107、1×108CFU/1 000 mL時,GLP-1的分泌不受影響。值得注意的是,當(dāng)L.plantarum和L.johnsonii的起始濃度分別高于1×108CFU/1 000 mL和1×109CFU/1 000 mL時,GLP-1的分泌量降低。與WEI等[9]的結(jié)果類似,本研究結(jié)果證實了不同的乳酸菌菌株對STC-1細胞具有不同的影響。然而,PANWAR等[4]通過直接將菌株與細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)所選的3種菌株都可刺激GLP-1分泌。這說明不同共培養(yǎng)條件會獲得不同的研究結(jié)果,而本研究的共培養(yǎng)體系更接近于真實的體內(nèi)條件。

進一步研究了O2暴露對細胞GLP-1分泌的影響。當(dāng)沒有細菌存在時,細胞在低氧條件下表現(xiàn)出顯著降低的GLP-1分泌水平(P<0.05)。當(dāng)與L.rhamnosus和L.plantarum共培養(yǎng)時,有限的O2條件并不影響細胞的GLP-1分泌,而與L.johnsonii共培養(yǎng)時,GLP-1分泌顯著降低(P<0.05)。本研究試圖通過測量細胞活力來解釋這種現(xiàn)象,然而,結(jié)果與GLP-1分泌的變化不符,因為有限的O2條件不會影響細胞的活力,無論是否有細菌存在。此外,由于無黏液層存在時細菌直接與細胞接觸,但細胞GLP-1分泌量降低,說明細菌是通過產(chǎn)生代謝產(chǎn)物,而非直接接觸影響細胞GLP-1代謝。因此,假設(shè)GLP-1分泌的不同變化趨勢可能是由于菌株的不同代謝物引起的,但該假設(shè)有待進一步驗證。

綜上所述,不同的乳桿菌菌株對pGIP/Neo STC-1細胞GLP-1分泌的影響不同。而且,當(dāng)濃度不同時,同一菌株表現(xiàn)出不同的效果。在進行體外研究以探討腸道微生物與宿主之間的相互作用時,應(yīng)考慮腸腔環(huán)境,例如O2濃度和黏液層的存在。在進一步的研究中應(yīng)收集頂部液體培養(yǎng)基開展代謝組學(xué)分析,以篩選L.rhamnosus產(chǎn)生的刺激GLP-1分泌的功能成分。