邱 萍，凌顯容，郭 巧，胡 霞*

(1.樂山市實驗中學(xué)，四川樂山 610040；2.樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川樂山 614000)

酸雨是指pH 值小于5.6 的降水，是因人類活動或自然災(zāi)害（森林火災(zāi)、火山爆發(fā)等）導(dǎo)致降水酸化的一種污染現(xiàn)象[1]。中國酸雨主要分布在四川盆地及長江以南、青藏高原以東的大部分地區(qū)。酸雨不僅對植被產(chǎn)生直接影響，還造成水源及土壤酸化，帶來嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境問題[2]。近年來，由于工業(yè)活動、城市化進(jìn)程的快速發(fā)展，以及污水灌溉、施用劣質(zhì)肥料等農(nóng)業(yè)活動，重金屬污染問題愈發(fā)嚴(yán)重。在所有非植物必需的重金屬元素中，鎘容易在人體內(nèi)聚集，最難以修復(fù)也最引人關(guān)注。據(jù)普查，目前全國約有1.3萬hm2耕地遭受鎘污染，有些地區(qū)的農(nóng)田污染嚴(yán)重超標(biāo)[3]。重金屬進(jìn)入土壤后被植物吸收，不僅影響植物的生長發(fā)育，還會通過食物鏈積累，最終危害人類健康。酸雨與土壤中重金屬有效態(tài)含量的多少有一定程度的關(guān)系，在酸雨作用下，土壤中重金屬在一定程度上被活化，加重了對植物的損害。此外，重金屬也會加重酸雨對植物的傷害。在我國，酸雨和鎘污染對土壤造成的環(huán)境問題非常嚴(yán)重，并且我國酸雨區(qū)與重金屬污染區(qū)有很大程度重疊。目前，國內(nèi)對酸雨和鎘單一脅迫的研究均較多，但對兩者的復(fù)合脅迫研究相對較少。

多年生黑麥草是禾本科黑麥草屬草本植物，在我國長江流域、四川、貴州、湖南、云南等地生長良好，具有生長快、生物量大、根系發(fā)達(dá)、適應(yīng)性強(qiáng)、耐酸等優(yōu)點，并且對銅、鎘、鉛和鋅等多種重金屬均有一定的耐性，可在重金屬復(fù)合污染的土壤上正常生長[4]。因此，本試驗以多年生黑麥草為材料，研究其種子萌發(fā)及幼苗生長生理對酸雨和鎘復(fù)合脅迫的響應(yīng)，為修復(fù)酸雨和鎘污染的土壤及環(huán)境治理提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 模擬酸雨和氯化鎘溶液的配制

模擬酸雨的配制：根據(jù)四川地區(qū)歷年的降雨酸度，參照文獻(xiàn)配制模擬酸雨[5-7]。按SO42-∶NO3-為8∶1(V/V)，配成pH值1.0的酸雨母液，使用時以蒸餾水稀釋，借助pHS-3C 型精密酸度計（上海佑科儀器儀表有限公司）用稀鹽酸和稀氫氧化鈉溶液調(diào)配模擬酸雨的pH值分別為2.5、6.0、7.0。

氯化鎘溶液的配制：先配制1 g·L-1的氯化鎘母液，然后用蒸餾水分別稀釋標(biāo)定后的母液，配制氯化鎘溶液濃度分別為0、0.5、20.0 mg·L-1。

1.2 試驗設(shè)計

挑選大小一致、種胚完好、籽粒飽滿的多年生黑麥草種子（Lolium perenne L.），用1 g·L-1氯化汞溶液浸泡10 min 消毒，然后用大量蒸餾水反復(fù)沖洗，瀝干水分后將100 粒多年生黑麥草種子均勻擺放在直徑為12 mm、墊有3層濾紙的培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)皿和濾紙事先經(jīng)滅菌處理后冷卻至室溫）。每個培養(yǎng)皿分別倒入不同濃度的模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫溶液10 mL。復(fù)合脅迫處理為：pH 值6.0+Cd 0.5 mg·L-1（處理Ⅰ），pH 值6.0+Cd 40.0 mg·L-1（處理Ⅱ），pH 值3.0+Cd 0.5 mg·L-1（處理Ⅲ），pH 值3.0+Cd 40 mg·L-1（處理Ⅳ），pH 值7.0+Cd 0 mg·L-1（CK）。每個處理重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿放于20 ℃的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每2 d添加1次相應(yīng)濃度的脅迫溶液。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 種子發(fā)芽統(tǒng)計

種子發(fā)芽統(tǒng)計以突破種皮的胚軸長度達(dá)到種子自身的長度為標(biāo)準(zhǔn)，從試驗第3 d 開始統(tǒng)計每皿發(fā)芽的種子數(shù)。試驗開始第7 d 計算不同處理下種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)[8]。發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)的計算公式如下：

發(fā)芽率（GR）=（n/N）×100%（1），式中n 為最終達(dá)到的正常發(fā)芽粒數(shù)，N為供試種子數(shù)；

發(fā)芽勢（GP）=（n3/N）×100%（2），式中n3為種子發(fā)芽第3 d的正常發(fā)芽粒數(shù)，N為供試種子數(shù)；

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（G7/D7），式中G7為在第7 d的發(fā)芽數(shù)，D7為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.3.2 幼苗生長量的測定

試驗開始第7 d 每皿隨機(jī)選擇10 粒發(fā)芽的多年生黑麥草，測定地上生物量（芽質(zhì)量）、地下生物量（根質(zhì)量）和總生物量（芽質(zhì)量+根質(zhì)量）。

1.3.3 幼苗生理指標(biāo)的測定

試驗開始第15 d 隨機(jī)采集不同濃度脅迫的多年生黑麥草幼苗葉片，采用丙酮浸提法用T6新悅可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）進(jìn)行葉綠素含量的測定；采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量；采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性；采用DDS-307 電導(dǎo)率儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）測定相對電導(dǎo)率[9-10]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2017 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖；用SPSS 13.0 進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），最小顯著差異法（LSD）比較組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫對多年生黑麥草種子萌發(fā)的影響

從表1 可以看出，隨著鎘脅迫的加劇，多年生黑麥草種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均逐漸降低。而隨著模擬酸雨脅迫的加劇，種子發(fā)芽卻沒有表現(xiàn)出規(guī)律的變化趨勢。低濃度的鎘和弱酸復(fù)合脅迫下（處理Ⅰ）種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)均高于對照組，表明此處理不但未對植物造成傷害，反而對多年生黑麥草種子萌發(fā)具有一定的促進(jìn)作用。高濃度的鎘和強(qiáng)酸的復(fù)合脅迫（處理Ⅳ）下，多年生黑麥草種子的發(fā)芽勢比對照降低了75.9%，發(fā)芽率下降了19.5%，發(fā)芽指數(shù)下降了45.3%，差異達(dá)到顯著水平（p＜0.05），種子萌發(fā)受到明顯抑制。

表1 多年生黑麥草種子萌發(fā)對模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫的響應(yīng)

2.2 模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫對多年生黑麥草生物量的影響

從表2 可知，不同濃度的模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫處理均降低了多年生黑麥草地上生物量、地下生物量和總生物量。同一濃度酸雨脅迫下，隨著鎘脅迫的加劇，多年生黑麥草生物量逐漸降低。強(qiáng)酸脅迫時（pH=3.0），重度鎘脅迫（處理Ⅳ）使多年生黑麥草總生物量比輕度鎘脅迫（處理Ⅲ）降低了60.6%。同時，同一濃度鎘脅迫下，隨著酸脅迫的加劇多年生黑麥草生物量也呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，然而差異不顯著。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，模擬酸雨和鎘污染的復(fù)合脅迫均抑制了多年生黑麥草幼苗的生長，相比于對照，處理Ⅳ復(fù)合脅迫使多年生黑麥草地上生物量降低了65.2%，地下生物量降低了73.3%，總生物量降低了67.5%，差異達(dá)顯著水平（p＜0.05）。

表2 多年生黑麥草生物量對模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫的響應(yīng)

2.3 模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫對多年生黑麥草幼苗葉片葉綠素含量的影響

從表3 可知，低濃度的酸和鎘復(fù)合脅迫處理（處理Ⅰ）增加了多年生黑麥草幼苗葉片葉綠素含量，促進(jìn)了葉片葉綠素的合成。在相同H+濃度的酸脅迫下，隨Cd濃度升高葉綠素含量降低。然而在相同濃度鎘脅迫下，隨著酸脅迫的加劇多年生黑麥草幼苗葉片葉綠素含量卻并沒發(fā)生改變。高濃度的酸和鎘脅迫下（處理Ⅳ）葉綠素含量最低，為1.1 mg·g-1，顯著低于對照（p＜0.05）。

表3 多年生黑麥草葉綠素含量、細(xì)胞膜透性和過氧化物酶活性對模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫的響應(yīng)

2.4 模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫對多年生黑麥草細(xì)胞膜的影響

從表3 可以看出，不同濃度模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片丙二醛（MDA）含量均高于對照組。低濃度鎘脅迫時（處理Ⅰ和處理Ⅲ）丙二醛含量僅分別比對照增加了23.5%和6.7%，高濃度鎘脅迫（處理Ⅱ和處理Ⅳ）下丙二醛含量則分別比對照增加了29.9%和49.5%。高濃度酸和鎘復(fù)合脅迫（處理Ⅳ）使黑麥草幼苗丙二醛含量達(dá)到最高值，為14.5 mmol·g-1，顯著高于對照（p＜0.05）。

和對照相比，兩種不同H+濃度的酸脅迫下低濃度鎘脅迫（處理Ⅰ和處理Ⅲ）沒有改變多年生黑麥草幼苗葉片的相對電導(dǎo)率值（表3）；而高濃度的鎘脅迫（處理Ⅱ和處理Ⅳ）均增加了多年生黑麥草葉片相對電導(dǎo)率值，差異達(dá)顯著水平（p＜0.05）。處理Ⅱ脅迫下幼苗葉片相對電導(dǎo)率達(dá)12.9%，處理Ⅳ達(dá)13.9%，分別比對照增加了12.6%和21.2%。

2.5 模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫對多年生黑麥草過氧化物酶活性的影響

與對照相比，低濃度的酸脅迫和鎘脅迫（處理Ⅰ）并未顯著改變多年生黑麥草幼苗葉片過氧化物酶（POD）活性。同一H+濃度的模擬酸脅迫下，隨著鎘脅迫的加劇多年生黑麥草POD 活性逐漸降低。弱酸脅迫時（pH=6.0），重度鎘脅迫（處理Ⅱ）使多年生黑麥草POD活性比輕度鎘脅迫（處理Ⅰ）下降了13.8%；強(qiáng)酸脅迫時（pH=3.0），重度鎘脅迫（處理Ⅳ）的POD 活性比輕度鎘脅迫（處理Ⅲ）降低了2.7%（表3）。同時，在同一低濃度鎘脅迫下，隨著酸脅迫的加劇多年生黑麥草POD 活性也呈現(xiàn)降低的趨勢。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，高濃度的鎘和不同H+濃度的模擬酸雨復(fù)合脅迫（處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）均顯著抑制了POD 活性（p＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

全球普遍存在著兩種非生物脅迫：酸雨和重金屬脅迫。酸雨和有毒重金屬污染土壤時具有隱藏深、作用期長、傷害不可逆等特點，這些特性會導(dǎo)致土壤缺乏營養(yǎng)物質(zhì)，植株無法從土壤中獲取生長發(fā)育所需的成分[11]。對于植物而言，早在植株幼苗的生長發(fā)育時期，植株就表現(xiàn)出了對外界環(huán)境的適應(yīng)能力，這個階段是植株適應(yīng)外界環(huán)境的關(guān)鍵期，對植株自身的生長發(fā)育具有重要作用[12]。植物種子的萌發(fā)和早期生物量的變化情況就可以反映出酸雨和重金屬污染對其生長的影響，以往的研究顯示，超出植株適應(yīng)范圍的重金屬會使植株幼苗的生長發(fā)育受到一定程度抑制。本研究中，低濃度的酸雨和鎘復(fù)合脅迫促進(jìn)了黑麥草種子的萌發(fā)，而高濃度的復(fù)合脅迫明顯抑制了種子萌發(fā)，這與之前的一些研究結(jié)果“低促高抑”現(xiàn)象相同。然而，不同濃度酸雨和鎘復(fù)合脅迫均抑制了多年生黑麥草植株生長，高濃度酸雨和鎘脅迫（pH 值3.0+Cd 40 mg·L-1）下黑麥草生物量顯著降低，這與代杰等對水芹耐Pb性的研究得出的結(jié)論一致，高濃度的重金屬脅迫會對水芹的生長發(fā)育產(chǎn)生明顯的抑制作用[13]。

葉綠素含量的變化對植物的光合作用有很大的影響，既可反映植物葉片光合作用功能的強(qiáng)弱，也可用以表征逆境脅迫下植物組織、器官的衰老狀況。葉綠素降低會導(dǎo)致植物光合作用逐漸減弱，從而導(dǎo)致植物在此階段的生長受阻。本研究中，葉綠素含量與生物量的變化規(guī)律相似，即低濃度的復(fù)合脅迫促進(jìn)了葉綠素的合成，而高濃度的復(fù)合脅迫顯著降低了葉綠素的含量，這與劉英杰等的研究結(jié)論類似[14]。有研究認(rèn)為，不同品種作物葉片中的葉綠素含量隨重金屬濃度的升高呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。這一研究也表明了酸和重金屬對植物葉綠素具有“低促進(jìn)高抑制”影響[15]。推測造成本研究中這種變化趨勢的可能原因是：低濃度的酸和鎘處理提高了葉綠素酸酯還原酶的活性和氨基-γ-酮戊酸的含量[16]，使多年生黑麥草幼苗葉片葉綠素含量逐漸增多；而高濃度的酸和鎘處理使鐵離子無法進(jìn)入葉綠素，阻礙了合成葉綠素的有效途徑[17]。

植物細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境的邊界，也是細(xì)胞與外界間進(jìn)行物質(zhì)運輸、能量交換和信息傳遞的重要場所。當(dāng)植物遇到逆境時，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到損傷，膜脂過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的高活性最終產(chǎn)物MDA持續(xù)破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，致使電解質(zhì)滲出引起組織浸泡液的電導(dǎo)率值發(fā)生變化。脅迫程度愈大，脂質(zhì)過氧化程度越大，MDA 含量越高，相對電導(dǎo)率也就越高。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度酸和鎘復(fù)合脅迫顯著增加了多年生黑麥草幼苗葉片MDA含量和相對電導(dǎo)率。這與大多數(shù)已有的研究結(jié)果相似，各種非生物脅迫如干旱、酸雨、重金屬等都使植株的MDA含量和相對電導(dǎo)率顯著提高[15,18-19]。

通常膜脂過氧化還伴隨有活性氧產(chǎn)生，而植物體內(nèi)的各種氧化酶就組成了一個有效的活性氧消除酶系統(tǒng)。POD 是一類活性較高的氧化還原酶，廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)，與植物的呼吸作用、光合作用等都有關(guān)系，尤其作為植物體內(nèi)消除自由基傷害防護(hù)酶系成員之一，與植物的抗逆境能力密切相關(guān)。本試驗研究結(jié)果顯示，隨著模擬酸雨和鎘脅迫的加劇，多年生黑麥草植株體內(nèi)POD 活性逐漸下降，在高鎘脅迫下，下降尤為明顯，這與孫天國等在毛尖紫萼蘚和楊盛昌等在桐花樹上的研究結(jié)果相同[20-21]。可能是因為隨著脅迫的加劇，多年生黑麥草體內(nèi)產(chǎn)生了大量的過氧化物，而POD 的消除能力有限，使細(xì)胞受到傷害，致使POD活性下降。

3.2 結(jié)論

綜上所述，低濃度的酸雨和鎘復(fù)合脅迫促進(jìn)了多年生黑麥草種子的萌發(fā)和幼苗葉綠素的合成，而高濃度的酸雨和鎘復(fù)合脅迫顯著抑制了多年生黑麥草種子的萌發(fā)和植株的生長，明顯降低了幼苗生物量和葉綠素含量，表現(xiàn)出一定的“低促高抑”現(xiàn)象。為了適應(yīng)逆境，黑麥草幼苗植株P(guān)OD 酶活性隨著模擬酸雨和鎘脅迫的加劇而明顯降低，而MDA含量和相對電導(dǎo)率則顯著增加。