顧 穎，伏光輝，王亞東，葉仁智，盧 璐，孫苗苗*

（1.連云港市海洋與漁業(yè)發(fā)展促進(jìn)中心，江蘇連云港 222000；2.江蘇海洋大學(xué)，江蘇連云港 222000）

海州灣是位于江蘇省連云港市沿岸的開放型淺海海灣，其底質(zhì)類型豐富、入海河流眾多、生物餌料豐富，是我國(guó)重要的漁場(chǎng)之一[1-2]。然而，近年來(lái)由于資源保護(hù)不當(dāng)、過度捕撈、環(huán)境污染等因素的影響，海州灣資源急劇衰退，影響了海州灣海洋生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)健康發(fā)展[3]。海洋微生物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，參與海洋生物地球化學(xué)循環(huán)過程，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的功能中具有重要作用[4-5]。相關(guān)研究表明，微生物群落特征的變化會(huì)影響海洋碳、氮和磷等營(yíng)養(yǎng)物的化學(xué)循環(huán)及微生物的降解功能[6-8]。沉積物在海洋生態(tài)系統(tǒng)中通常具有較高的微生物豐度和多樣性，其中的微生物是調(diào)節(jié)各種生物元素轉(zhuǎn)化和生物修復(fù)的生物地球化學(xué)過程的主要執(zhí)行者[9-10]。因此，對(duì)沉積物中微生物多樣性的研究有助于了解海洋微生物群落的分布特征，維持海洋生態(tài)資源的可持續(xù)發(fā)展。目前，對(duì)海州灣的研究主要集中在魚類多樣性、浮游動(dòng)植物多樣性和海洋環(huán)境研究等方面[1-3,11-16]，對(duì)海州灣沉積物中微生物多樣性的研究較少。鑒于此，本研究以海州灣不同點(diǎn)位的沉積物樣品為研究對(duì)象，利用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)海州灣水域沉積物的微生物多樣性進(jìn)行了分析，以期為海州灣海域生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

參照黃備等[17]的方法進(jìn)行沉積物樣品采集。沉積物樣品采集于江蘇省連云港市海州灣，采樣點(diǎn)布設(shè)如表1所示。每個(gè)點(diǎn)位各采集3 g沉積物，3次重復(fù)。

表1 海州灣采樣點(diǎn)布設(shè)

1.2 DNA提取及高通量測(cè)序

參照張帥等[18]的方法，稱取0.5 g 新鮮沉積物樣品，采用磁珠式土壤基因組DNA 提取試劑盒（Omega公司，美國(guó)）提取樣品總?cè)郝浠蚪MDNA，利用Qubit 4.0（Thermo 公司，美國(guó)）檢測(cè)DNA 濃度后，對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司，利用Illumina MiSeq系統(tǒng)（Illumina MiSeq，USA）進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)高通量測(cè)序得到的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾以得到有效數(shù)據(jù)[19-21]。利用Usearch 11.0.667 軟件將相似性＞97%的序列聚類為一個(gè)OUT[22-23]。通過Mothur 1.43.0軟件計(jì)算序列的α-多樣性指數(shù)[24]，其中，Chao1和Ace指數(shù)用于評(píng)估群落分布豐度，Shannon和Simpson指數(shù)用于評(píng)估群落分布多樣性，Shannoneven指數(shù)用于評(píng)估群落分布均勻度，Coverage 指數(shù)能夠反映測(cè)序結(jié)果是否代表樣本的真實(shí)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物α-多樣性分析

對(duì)海州灣水域各樣點(diǎn)采集樣品進(jìn)行α-多樣性分析，多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。Shannon 指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說(shuō)明微生物群落多樣性越高。RA8點(diǎn)位沉積物樣品的Shannon 指數(shù)最大（6.192），且Simpson指數(shù)最?。?.007），表明RA8點(diǎn)位沉積物樣品的微生物群落多樣性最高。各采樣點(diǎn)沉積物樣品的Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)不同，表明不同沉積物樣品的微生物群落豐度不同。此外，各樣品的Coverage 指數(shù)均接近1（p＜0.01），表明樣本測(cè)序結(jié)果能夠代表樣本微生物的真實(shí)情況。

表2 海州灣水域各樣點(diǎn)細(xì)菌群落α-多樣性指數(shù)分析

2.2 微生物PCoA分析

基于UniFrac 距離算法，在OUT 水平上，對(duì)海州灣沉積物樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）。結(jié)果如圖1（見封三）所示，坐標(biāo)軸PCo1 能解釋45.67%的微生物群落組成差異，第二坐標(biāo)軸PCo2 能解釋25.67%的微生物群落變化。在PCo1維度上，RA8點(diǎn)位的沉積物樣品與其他點(diǎn)位的沉積物樣品距離均較遠(yuǎn)，表明RA8 點(diǎn)位與其他點(diǎn)位的沉積物樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大。此外，CA3、RA6 點(diǎn)位沉積物樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)差異較小，CA1、RA9、RA16 點(diǎn)位沉積物樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)差異較小。

2.3 微生物群落組成分析

通過blastn 將序列與RDP、GTDB、NCBI、Silva和UNITE 等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行物種注釋，海州灣沉積物樣品中共發(fā)現(xiàn)2 851 個(gè)OUTs，分屬于31 門74綱116 目199 科331 屬。門水平上（圖2，見封三），海州灣水域主要優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和硬壁菌門（Firmicutes）等8 類。其中，各采樣點(diǎn)的第一優(yōu)勢(shì)門類均為變形菌門，分別占各樣品細(xì)菌群落豐度的62.39%、53.15%、54.30%、57.97%、56.09%、58.93%。除RA8、CA3 點(diǎn)位外，擬桿菌門在其他點(diǎn)位沉積物中的含量?jī)H次于變形菌門，平均相對(duì)豐度為7.76%。

選取在屬水平上相對(duì)豐度排名前22位的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬做熱圖分析，如圖3（見封三）所示，顏色越紅表示物種相對(duì)豐度越高，越綠表示相對(duì)豐度越低。不同點(diǎn)位的沉積物樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬存在一定差異。RA8點(diǎn)位沉積物樣品中相對(duì)豐度最高的菌屬為Gp10，相對(duì)豐度為3.38%，Sulfurovum（2.23%）、Thioprofundum（3.17%）和Gp23（2.28%）也是RA8 點(diǎn)位沉積物樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬，平均相對(duì)豐度均超過2%；Sulfurovum是RA6、RA16 點(diǎn)位沉積物樣品中的最優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度分別為10.43%、6.02%；Thioprofundum是RA9、CA1 點(diǎn)位沉積物樣品中的最優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度分別為3.40%、3.94%；此外，CA3點(diǎn)位沉積物樣品中相對(duì)豐度最高的菌屬為Gp10，相對(duì)豐度為3.36%。

應(yīng)用屬水平的Venn 圖分析6 個(gè)點(diǎn)位沉積物樣品的微生物群落差異（圖4，見封三）。6 個(gè)點(diǎn)位樣品共有的物種有191 個(gè)屬，特有的物種分別為CA3 點(diǎn)位4 個(gè)，RA6 點(diǎn)位3 個(gè)，RA8 點(diǎn)位9 個(gè)，RA9 點(diǎn)位3 個(gè)，RA16點(diǎn)位6個(gè)，CA1點(diǎn)位4個(gè)。表明6個(gè)點(diǎn)位微生物的種類組成具有較高的相似性，各點(diǎn)位特有的微生物種類較少。

2.4 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

通過計(jì)算物種之間的相關(guān)性，建立物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)特征值如表3所示，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)如圖5（見封三）所示。16 個(gè)節(jié)點(diǎn)間有27 條表示種間強(qiáng)相互作用的連接（p＜0.05，r＞0.8），平均路徑長(zhǎng)度是1.65，網(wǎng)絡(luò)直徑為4，緊密系數(shù)為0.64。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)主要屬于變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和放線菌門4個(gè)菌門，也是細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門。

表3 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)特征值

2.5 FAPROTAX分析

通過FAPROTAX 軟件分析預(yù)測(cè)微生物的功能，樣本細(xì)菌的FAPROTAX 功能豐度熱圖如圖6（見封三）所示。結(jié)果表明，各采樣點(diǎn)沉積物樣品的功能豐度基本相似，微生物的主要功能與硫化合物呼吸（respiration of sulfur compounds）、亞硫酸鹽呼吸（sulfate respiration）、化能異養(yǎng)（chemoheterotrophy）、有氧化能異養(yǎng)（aerobic chemoheterotrophy）、發(fā)酵（fermentation）、硫酸鹽呼吸（sulfite respiration）、光合作用（chloroplasts）、光合營(yíng)養(yǎng)（phototrophy）、光能自養(yǎng)（photoautotrophy）、無(wú)氧光能自養(yǎng)（anoxygenic photoautotrophy）、硝化（nitrification）、亞硝酸鹽氧化（aerobic nitrite oxidation）、尿素分解（ureolysis）、含硫化合物暗氧化（dark oxidation of sulfur compounds）、動(dòng)物寄生蟲共生體（animal parasites or symbionts）、硫暗氧化（dark sulfur oxidation）、亞硫酸鹽暗氧化（dark sulfite oxidation）、硝酸鹽還原（nitrate reduction）及光能異養(yǎng)（photoheterotrophy）等有關(guān)。其中，硫化合物呼吸占5.9%～10.68%，亞硫酸鹽呼吸占5.74%～10.61%，化能異養(yǎng)占6.1%～7.38%。

3 討論

海洋沉積物是海洋生態(tài)系統(tǒng)中主要的微生物聚集地，蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化在此進(jìn)行，是參與生物地球化學(xué)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)[25]。海洋沉積物中微生物多樣性在維持海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡的過程中非常重要，其相關(guān)研究已成為熱點(diǎn)。在門水平上，變形菌門廣泛參與海洋的生物地球化學(xué)循環(huán)過程，在有機(jī)物分解和循環(huán)中有重要作用[26]。白潔等研究發(fā)現(xiàn)黃海西北部沉積物樣品中的變形細(xì)菌門在所有樣品中均為優(yōu)勢(shì)菌門[27]；劉欣等研究發(fā)現(xiàn)膠州灣海域表層沉積物樣品中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門[28]；黃備等研究發(fā)現(xiàn)椒江口海域沉積物樣品中的最主要優(yōu)勢(shì)門為變形菌門[29]；有小娟等研究發(fā)現(xiàn)變形菌門為象山港內(nèi)西滬港海域沉積物樣品中的最主要優(yōu)勢(shì)門[30]。本研究中，變形菌門在海州灣各個(gè)點(diǎn)位的相對(duì)豐度均最高，在細(xì)菌群落中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，與國(guó)內(nèi)已報(bào)道的黃海、威海、膠州灣、椒江口及西滬港等海域沉積物樣品的最大優(yōu)勢(shì)類群相同[27-31]。除變形菌門外，海州灣沉積物樣品中還發(fā)現(xiàn)擬桿菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、放線菌門、浮霉菌門、疣微菌門和硬壁菌門等優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，這些菌門在我國(guó)近海沉積物微生物群落中均有報(bào)道[32-34]。此外，海州灣不同點(diǎn)位沉積物樣品間的優(yōu)勢(shì)菌屬及海州灣與其他海域沉積物間的優(yōu)勢(shì)菌屬均存在較大差異，可能與環(huán)境溫度、季節(jié)、深度等環(huán)境條件及受陸地、人類活動(dòng)影響不同有關(guān)[28,35]。

微生物群落間的相互作用對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能穩(wěn)定具有重要意義，對(duì)微生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的研究能夠進(jìn)一步認(rèn)識(shí)微生物之間的相互作用[36-37]。楊艷等研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江三峽上游水域樣品微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)主要屬于變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門和擬桿菌門，占所有節(jié)點(diǎn)的87.5%[37]；王洵等研究發(fā)現(xiàn)橫山水庫(kù)表層水樣和底層水樣微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的主要優(yōu)勢(shì)物種為變形菌門、放線菌門和擬桿菌門[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，海州灣沉積物樣品共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中，大多數(shù)節(jié)點(diǎn)屬于變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和放線菌門，與其他微生物相比，這些微生物在維持網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用[37]。如變形菌門、綠彎菌門和放線菌門廣泛參與碳、氮、硫等一系列重要元素生物地球化學(xué)循環(huán)過程，酸桿菌門在各生態(tài)系統(tǒng)中均具有特定的驅(qū)動(dòng)作用及菌群穩(wěn)定性功能[39-44]。此外，相關(guān)研究表明，豐度較高的中心微生物能夠通過數(shù)量變化，豐度較低的中心微生物能夠通過介體、傳遞及聯(lián)絡(luò)等功能影響微生物群落的結(jié)構(gòu)組成和多樣性[37,45]。

海洋沉積物中的微生物驅(qū)動(dòng)碳、氮和硫等許多的生物地球化學(xué)循環(huán)[46]。FAPROTAX 預(yù)測(cè)的功能集中在海洋和湖泊中微生物的生物地球化學(xué)循環(huán)，適用于有關(guān)S 循環(huán)、N 循環(huán)、H 循環(huán)及C 循環(huán)等的功能預(yù)測(cè)[47]。例如，王璐采用FAPROTAX 軟件對(duì)黃海北部海洋牧場(chǎng)海水和沉積物細(xì)菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)黃海海水和沉積物微生物優(yōu)勢(shì)功能類群主要與碳、氮元素循環(huán)有關(guān)，包括化能異養(yǎng)、有氧化能異養(yǎng)、光合作用、光合營(yíng)養(yǎng)、光能自養(yǎng)、有氧光能自養(yǎng)、硝化、氨氧化、發(fā)酵、硝酸鹽還原等[48]；李明月等通過FAPROTAX 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)渤海和南黃海表層沉積物中細(xì)菌功能，研究發(fā)現(xiàn)目標(biāo)站位沉積物中蘊(yùn)含著活躍的硫化合物呼吸、硫酸鹽呼吸、化能異養(yǎng)、有氧化能異養(yǎng)、光合作用、硝化及好氧亞硝酸鹽氧化等硫循環(huán)、碳循環(huán)和氮循環(huán)功能[49]。在本研究中，通過FAPROTAX 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)海州灣沉積物樣品中的微生物與硫化合物呼吸、亞硫酸鹽呼吸、化能異養(yǎng)、有氧化能異養(yǎng)、發(fā)酵、硫酸鹽呼吸、硝化、亞硝酸鹽氧化等硫循環(huán)、碳循環(huán)和氮循環(huán)等功能有關(guān)，主要參與生物地球化學(xué)循環(huán)中的硫循環(huán)。