安恒通,張學(xué)琴,吳 媛,馬 赟,王帥杰,王開爽,陳志強(qiáng),,3

(1. 河北中醫(yī)藥大學(xué),河北 石家莊 050200;2. 河北中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河北 石家莊 050011;3. 河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點實驗室,河北 石家莊 050200)

膜性腎病是以彌漫性腎小球基底膜增厚伴上皮下免疫復(fù)合物沉積為主要病理特征的腎小球疾病,臨床以大量蛋白尿、水腫等為主要表現(xiàn)。膜性腎病可分為繼發(fā)性和特發(fā)性,繼發(fā)性膜性腎病多由自身免疫性疾病、感染、腫瘤、藥物等引起;病因未明的稱為特發(fā)性膜性腎病,多由遺傳、免疫等因素引起,是全世界非糖尿病成人特發(fā)性腎病綜合征的最常見原因,約占30%[1],其是導(dǎo)致腎衰竭的重要原因。目前特發(fā)性膜性腎病主要用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、激素、免疫抑制劑以及單抗類藥物治療,但存在療效不穩(wěn)定、不良反應(yīng)大、復(fù)發(fā)率高等問題,且長期應(yīng)用存在腎小球濾過率下降、免疫系統(tǒng)受打擊等潛在風(fēng)險[2],故臨床上亟待新的治療思路。近年來研究表明中醫(yī)藥在減少特發(fā)性膜性腎病患者蛋白尿、延緩腎功能下降及改善臨床癥狀等方面具有獨特優(yōu)勢。陳志強(qiáng)教授認(rèn)為脾腎兩虛、濕瘀互結(jié)為特發(fā)性膜性腎病的基本病機(jī)[3],在臨床中常以升陽益胃湯、補(bǔ)陽還五湯合用并臨證加減治療該病,效果較好,但兩方合用的作用機(jī)制尚不明確。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,特發(fā)性膜性腎病是由自身特異性抗體與抗原在足細(xì)胞處結(jié)合沉積并激活補(bǔ)體,形成膜攻擊復(fù)合物插入足細(xì)胞當(dāng)中,造成足細(xì)胞骨架蛋白裂解及其之間的裂孔隔膜蛋白缺失等損傷,進(jìn)而產(chǎn)生大量蛋白尿,其中足細(xì)胞損傷是膜性腎病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[4]?；诖?本研究通過觀察特發(fā)性膜性腎病大鼠腎臟損傷相關(guān)生化指標(biāo)、腎臟病理形態(tài)及足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況,探討了升陽益胃湯與補(bǔ)陽還五湯合用的作用機(jī)制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只,體重150～200 g,鼠齡6～8周,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2021-0011。動物飼養(yǎng)于相對濕度(60±10)%、溫度20～25 ℃的環(huán)境下,自由飲水進(jìn)食,每天維持12 h光照。本次實驗動物以及實驗操作均由河北中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(編號:HBZY2023-YS-076-01)。

1.2實驗儀器 7170A型生化分析儀(日本Hitachi公司),BX51型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司),JT-12脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司),JB-L5包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司),JK-6烤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司),Memmer烘箱(美墨爾特貿(mào)易有限公司),制冰機(jī)(日本SANYO電機(jī)),雙垂直電泳儀(塞維爾生物科技公司),轉(zhuǎn)印電泳儀(塞維爾生物科技公司),冷凍離心機(jī)(Heal Force),BX43型免疫熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3實驗試劑 綿羊抗大鼠Fx1A血清(PTX-002s,Probetex,美國),腎病蛋白(Nephrin)抗體(ab216341,abcam,英國),CD2相關(guān)蛋白(CD2AP)抗體(Bs-0512r,bioss,中國),β-actin抗體(20536-1-AP,三鷹,中國),Marker(26616,賽默飛,中國),7.5%預(yù)混膠(PG111,雅酶,中國),脫脂奶粉(BS102-100 g,biosharp,中國),一抗稀釋液(C1240-500,普利萊,中國),1M Tris-HCL溶液(T1140,索萊寶,中國),BCA蛋白測定試劑盒(PC0020,索萊寶,中國),大鼠蛋白尿試劑盒(C035-2-1,南京建成生物工程研究所,中國),RIPA裂解液(BL504A,biosharo,中國),SDS-PADE loading buffer(C05-03001,bioss,中國),PMSF蛋白酶抑制劑(C05-01002,bioss,中國)。

1.4實驗藥物 鹽酸貝那普利(北京諾華制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H20030514);升陽益胃湯合補(bǔ)陽還五湯組方:黃芪60 g、白術(shù)12 g、羌活9 g、橘皮12 g、黨參12 g、炙甘草6 g、獨活9 g、防風(fēng)9 g、茯苓30 g、柴胡9 g、半夏9 g、白芍30 g、澤瀉9 g、黃連6 g、當(dāng)歸15 g、赤芍12 g、地龍12 g、川芎12 g、桃仁3 g、紅花10 g(均為顆粒劑,廣東一方制藥有限公司提供)。

1.5實驗方法 將40只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)選取10只大鼠作為正常組,予以尾靜脈注射0.9%NaCl溶液0.4 mL/100 g;余30只大鼠予以尾靜脈一次性注射羊抗大鼠Fx1A血清0.4 mL/100 g制備特發(fā)性膜性腎病模型,造模后大鼠存活并且1周后24 h尿蛋白水平>10 mg/24 h為造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、升陽合補(bǔ)陽組、鹽酸貝那普利組,每組10只。 根據(jù)臨床成人(70 kg)等效計量折算,升陽合補(bǔ)陽組給予升陽益胃湯合補(bǔ)陽還五湯全方顆粒劑溶液9.2 g/(kg·d)灌胃(藥液濃度按1 g/mL計算),貝那普利組給予鹽酸貝那普利溶液0.000 88 g/(kg·d)灌胃(藥液濃度按0.000 5 g/mL計算),正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃,均1次/d,連續(xù)灌胃6周。

1.6檢測指標(biāo)及方法

1.6.124 h尿蛋白及血清生化指標(biāo)水平 于灌胃6周末采用大鼠代謝籠收集各組大鼠24 h尿液,采用雙縮脲比色法測定24 h尿蛋白水平。采用1.2 g/kg烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠,腹主動脈取血,采用全自動生化分析儀檢測白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平。

1.6.2腎臟組織病理形態(tài) 取血后,摘取雙側(cè)腎臟,一側(cè)腎臟置于4%多聚甲醛溶液固定48 h后取出,乙醇脫水,石蠟包埋,切片,依次使用二甲苯、梯度酒精脫蠟至水化后進(jìn)行HE及Masson染色,光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟病理形態(tài)。

1.6.3腎臟組織中足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況 分別采用免疫組化法和Western blot法檢測。

1.6.3.1免疫組化法 取石蠟包埋切片后的腎臟組織,65 ℃烤制2 h,后依次于二甲苯溶液、梯度乙醇溶液中脫蠟至水化;使用檸檬酸鹽緩沖液95 ℃下進(jìn)行抗原修復(fù);自然晾干至室溫后,用PBS洗滌,并在室溫下加入過氧化物酶阻斷劑。PBS洗滌后,分別滴加Nephrin(1∶100)、CD2AP(1∶100)抗體,在4 ℃的環(huán)境下孵育過夜。次日,待平衡至室溫后,依次滴加反應(yīng)增強(qiáng)液及二抗,分別于37 ℃的水浴中孵育30 min;使用DAB溶液進(jìn)行顯色,1～2 min后中止染色;蘇木素染色5 min后去除非特異性染色,PBS浸泡反藍(lán);梯度酒精脫水,二甲苯透明;中性樹膠封片,自然晾干后于光學(xué)顯微鏡下拍照。采用Image J軟件對光密度進(jìn)行分析,計算平均光密度值。

1.6.3.2Western blot法 取適量-80 ℃冰箱保存的大鼠腎臟組織,放入1 mL RIPA裂解液和10 μL蛋白酶抑制劑中,在冰上進(jìn)行30 min的裂解處理,提取出總蛋白。采用雙縮脲比色法測定總蛋白濃度,調(diào)整樣品濃度至5 μg/μL。取30 μg蛋白上樣,于7.5%PAGE凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離,最終通過濕轉(zhuǎn)法將分離出的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜中,脫脂牛奶室溫封閉1 h。TBST洗滌后分別加入Nephrin抗體(稀釋比例為1∶2 000)和CD2AP(稀釋比例為1∶500),4 ℃反應(yīng)過夜。次日洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(體積稀釋比例為1∶10 000)或HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(體積稀釋比例為1∶4 000),室溫孵育1 h,清洗后按ECL試劑盒說明進(jìn)行曝光顯影。采用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠24 h尿蛋白及血清ALB、TC、Cr、BUN水平比較 與正常組比較,模型組大鼠24 h尿蛋白及血清TC水平均明顯升高(P均<0.05),血清ALB水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,升陽合補(bǔ)陽組、貝那普利組大鼠24 h尿蛋白及血清TC水平均明顯降低(P均<0.05),血清ALB水平均明顯升高(P均<0.05);升陽合補(bǔ)陽組和貝那普利組24 h尿蛋白及血清ALB、TC、Cr、BUN水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);各組間血清Cr、BUN水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和特發(fā)性膜性腎病各組大鼠24 h尿蛋白及血清ALB、TC、Cr、BUN水平比較

2.2各組大鼠腎臟病理組織形態(tài) HE染色顯示:正常組大鼠腎小球大小正常,球囊輪廓清晰,基底膜、系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)未見增生;模型組大鼠腎小球體積增大,球囊粘連,毛細(xì)血管充血擴(kuò)張,基底膜、系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)出現(xiàn)不同程度的增生;與模型組相比,升陽合補(bǔ)陽組和貝那普利組大鼠腎小球體積明顯減小,基底膜、系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)也出現(xiàn)不同程度好轉(zhuǎn)。Masson染色顯示:正常組大鼠腎小球形態(tài)未見明顯改變;模型組大鼠腎小球基底膜明顯增厚,大量嗜復(fù)紅蛋白沉積;升陽合補(bǔ)陽組和貝那普利組大鼠腎小球內(nèi)嗜復(fù)紅蛋白沉積較模型組明顯減少。見圖1。

圖1 正常組和特發(fā)性膜性腎病各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)(×400)

2.3各組大鼠腎臟組織中Nephrin、CD2AP陽性表達(dá)情況 正常組大鼠腎臟組織中呈棕黃染色的Nephrin、CD2AP連續(xù)性分布于腎小球足細(xì)胞周圍且走行均勻;與正常組比較,模型組大鼠腎小球足細(xì)胞周圍的Nephrin、CD2AP連續(xù)性較差,走行不規(guī)則,染色減弱,陽性表達(dá)平均光密度值均明顯降低(P均<0.05);與模型組比較,升陽合補(bǔ)陽組和貝那普利組大鼠腎小球足細(xì)胞周圍的Nephrin、CD2AP分布的連續(xù)性明顯改善,染色增強(qiáng),陽性表達(dá)平均光密度值均明顯升高(P均<0.05);升陽合補(bǔ)陽組和貝那普利組Nephrin、CD2AP陽性表達(dá)平均光密度值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖2及表2。

圖2 正常組和特發(fā)性膜性腎病各組大鼠腎臟組織中Nephrin、CD2AP陽性表達(dá)情況(免疫組化染色,×400)

表2 正常組和特發(fā)性膜性腎病各組大鼠腎臟組織中Nephrin、CD2AP陽性表達(dá)平均光密度值比較

2.4各組大鼠腎臟組織中Nephrin、CD2AP蛋白表達(dá)情況 模型組大鼠腎臟組織中Nephrin、CD2AP蛋白相對表達(dá)量均明顯低于正常組(P均<0.05);升陽合補(bǔ)陽組和貝那普利組大鼠腎臟組織中Nephrin、CD2AP蛋白相對表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05),升陽合補(bǔ)陽組和貝那普利組Nephrin、CD2AP蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

圖3 正常組和特發(fā)性膜性腎病各組大鼠腎臟組織中Nephrin、CD2AP蛋白表達(dá)情況

3 討 論

特發(fā)性膜性腎病是一種自身免疫性疾病,未經(jīng)治療患者的自發(fā)完全緩解率為20%～30%。一項自2004年起針對中國多中心的臨床數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示,該病在腎穿刺確診的腎小球疾病中所占比例每年上升約13%[5],且患者發(fā)生危及生命的血栓栓塞和心血管事件的風(fēng)險顯著增加[6]。

中醫(yī)根據(jù)特發(fā)性膜性腎病的臨床表現(xiàn)常將其歸為“水腫”“尿濁”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為腎主水,脾主運化,脾腎兩虛則水濕停滯,久之易濕濁內(nèi)阻,從而阻礙氣機(jī)運行,氣為血之帥,氣機(jī)阻滯日久則易生瘀血。因此,特發(fā)性膜性腎病以脾腎兩虛、濕濁內(nèi)阻、瘀血互結(jié)為主要病機(jī),治宜健脾補(bǔ)腎、祛濕泄?jié)帷⒒鐾ńj(luò)等。升陽益胃湯為益氣除濕代表方,由第一屆國醫(yī)大師、全國著名腎臟病專家張琦教授引入慢性腎臟疾病的治療,方中重用黃芪,并配伍人參、白術(shù)、甘草補(bǔ)氣養(yǎng)胃;柴胡、防風(fēng)、羌活、獨活升舉清陽,祛風(fēng)除濕;半夏、陳皮、茯苓、澤瀉、黃連除濕清熱;白芍養(yǎng)血和營。補(bǔ)陽還五湯則是補(bǔ)氣活血、祛瘀通絡(luò)之要方,方中以黃芪為君甘溫大補(bǔ)元氣,以當(dāng)歸為臣活血通絡(luò),佐以赤芍、川芎、桃仁、紅花活血祛瘀,以地龍為使直達(dá)絡(luò)中。兩方合用,共奏健脾化濕、化瘀通絡(luò)之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)方中多種藥物的有效成分具有腎臟保護(hù)作用,如廖曉杰等[7]研究顯示黃芪的有效成分黃芪苷Ⅳ能夠改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷;程閏夏等[8]發(fā)現(xiàn)川芎的主要活性成分川芎嗪能夠減少特發(fā)性膜性腎病大鼠腎固有細(xì)胞凋亡,進(jìn)而減輕足細(xì)胞損傷。

本實驗采用一次性尾靜脈注射羊抗大鼠Fx1A血清建立特發(fā)性膜性腎病模型,結(jié)果模型組大鼠24 h尿蛋白和血清TC水平均明顯升高,血清ALB水平明顯降低;腎小球體積增大,球囊粘連,毛細(xì)血管充血擴(kuò)張,基底膜、系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)出現(xiàn)不同程度的增生,并伴有免疫復(fù)合物沉積;但血清Cr、BUN水平無明顯變化,推測可能是成模時間較短,未達(dá)到腎功能失代償階段。升陽合補(bǔ)陽組和貝那普利組大鼠24 h尿蛋白和血清TC水平均明顯降低,血清ALB水平明顯升高;腎小球體積明顯減小,基底膜、系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)也出現(xiàn)不同程度好轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實升陽益胃湯合補(bǔ)陽還五湯具有明顯的腎臟保護(hù)作用。

蛋白尿是特發(fā)性膜性腎病最重要的癥狀之一,而蛋白尿的形成與腎小球濾過屏障的病理損傷有關(guān)。腎小球濾過屏障由腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜和腎小球內(nèi)臟上皮細(xì)胞(足細(xì)胞)組成[1],相鄰的足細(xì)胞突觸來源于不同的細(xì)胞體,由一個連續(xù)的膜狀結(jié)構(gòu)相連,稱為裂孔隔膜,在防止血漿蛋白泄漏到原尿中起著關(guān)鍵作用。在一些腎小球疾病中,由于高親和力抗體(主要為IgG4)和抗原在足細(xì)胞下方形成并沉積,激活補(bǔ)體,形成膜攻擊復(fù)合物并插入足細(xì)胞膜,使鈣內(nèi)流,引起足細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡化,裂孔隔膜蛋白重新分布,進(jìn)而導(dǎo)致尿腔內(nèi)蛋白質(zhì)流量的增加[9]。

Nephrin是一種135 kDa的蛋白質(zhì),是第一個被確認(rèn)為裂孔隔膜細(xì)胞外的分子,是裂孔隔膜細(xì)胞外部分的主體。Nephrin有一個長胞外結(jié)構(gòu)域,從兩個相鄰足突延伸而來的Nephrin分子能在裂孔中通過親同性相互作用[10]。在實驗性腎病模型[11]和腎小球微小病變、膜性腎病、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病中均觀察到Nephrin的下調(diào)[12-15],提示Nephrin可能是人類腎小球疾病蛋白尿的關(guān)鍵分子之一。CD2AP是一種80 kDa的蛋白質(zhì),其N末端具有肌動蛋白結(jié)合位點,可將Nephrin錨定在足細(xì)胞骨架上[16]。Kawachi等[17]研究發(fā)現(xiàn),缺乏CD2AP的小鼠表現(xiàn)出足突缺失、嚴(yán)重蛋白尿等癥狀。 Liu等[18]研究表明,缺乏CD2AP可導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,進(jìn)而造成足細(xì)胞損傷。因此Nephrin和CD2AP的缺失可能是人類腎小球疾病蛋白尿的重要致病機(jī)制之一。本實驗結(jié)果顯示,模型組大鼠腎臟組織中Nephrin、CD2AP蛋白表達(dá)明顯下調(diào),升陽合補(bǔ)陽組、貝那普利組大鼠腎臟組織中Nephrin、CD2AP蛋白表達(dá)較模型組明顯上調(diào),表明升陽益胃湯合補(bǔ)陽還五湯可能通過上調(diào)Nephrin、CD2AP的表達(dá)發(fā)揮對足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用。

綜上所述,升陽益胃湯合補(bǔ)陽還五湯可能是通過上調(diào)Nephrin、CD2AP蛋白表達(dá)來修復(fù)足細(xì)胞,進(jìn)而減少尿蛋白的漏出,減輕腎臟損傷。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。