李俊杰，黃 艷，亢凱杰，張幫磊， 李 浪，2

（1.昭通學院化學化工學院，云南昭通 657000；2.云南省高校高原特色功能食品研究重點實驗室，云南昭通 657000；3.昭通學院云南食品安全昭通研究院，云南昭通 657000）

天麻是一種具有藥用價值的蘭科非自養(yǎng)型生物，可入藥，也可作為食品食用，并且具有較高的食用價值[1]。天麻在2018 年被列入藥食同源的中藥材，主要藥用成分為天麻素、多糖、多酚、皂苷等活性成分。Wei L 等人[2]發(fā)現(xiàn)，天麻具有鎮(zhèn)定催眠、抗衰老、抗氧化等作用。陳小銀等人[3]發(fā)現(xiàn)天麻素可抑制海馬體興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)受體Glu 的表達的作用和活化海馬抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體GABA 的活性與表達，從而抑制癲癇的發(fā)生。Jie W等人[4]通過試驗證實了天麻具有降低高血壓及緩解高血壓引起的頭暈、頭痛、疲勞、腰膝乏力等癥狀。天麻如此廣泛的功能性，除了天麻素外離不開天麻多糖的貢獻，張雙奇等人[5]對天麻多糖的抗氧化作用進行了研究，結果表明天麻多糖具有較強的抗氧化的作用。另外，多糖還具有抗衰老的作用[6]，繆化春等人[7]發(fā)現(xiàn)天麻多糖具有降血壓、降血糖等功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，天麻多糖也是天麻中最主要的生物活性成分之一，且還具有增強免疫力[8]、抗腫瘤[9]、抗氧化[10]等功能。而抗氧化的關鍵在于清除自由基能力，自由基在人體生命的過程中是各類化學反應的主要中間產(chǎn)物，一旦人體內(nèi)形成過量的自由基而未能有效清除，這些自由基就會威脅機體內(nèi)的生命大分子物質(zhì)及各類細胞器，最常見的原因便是由于過量的自由基產(chǎn)生加快機體的老化[10-11]。因此，想要降低過量的自由基產(chǎn)生所造成的損害，尋找有效低毒的抗氧化劑是至關重要的第一步，該研究重點對昭通烏天麻多糖的羥基自由基、DPPH 自由基等的清除能力進行探究，為今后天麻多糖的抗氧化能力的研究提供了基礎，對昭通的經(jīng)濟發(fā)展有著巨大的貢獻，也為帶動昭通地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展有一定的貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干烏天麻，產(chǎn)自昭通彝良小草壩；苯酚、濃硫酸、乙酸鉛、Tris-HCl 緩沖溶液、DPPH-乙醇溶液、鄰苯三酚、水楊酸納-乙醇溶液、硫酸亞鐵、過氧化氫、冰乙酸、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、維C 標準品（純度≥99%），天津風船化學試劑有限公司提供；葡萄糖標準品（純度≥99%），上海源葉生物科技有限公司提供。

UV-2700 型分光光度計，SHIMADZU 島津公司產(chǎn)品；YRE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責任公司產(chǎn)品；pHS-3E 型精密pH 計，上海虹益儀器儀表有限公司產(chǎn)品；PT-3502C 型全波長酶標分析儀，北京普天新橋技術有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 天麻多糖的提取

參考文獻[12]中方法稍作修改。采用熱水浸提法提取天麻多糖，通過配制不同pH 值的緩沖溶液，在95 ℃熱水中提取天麻多糖。操作中采用水提法，按照料液比為1∶20，pH 值分別為2，4，6，8，10進行提取，提取時間為30 min，重復提取1 次，合并濾液后濃縮，并用乙酸鉛除去蛋白成分，用85%乙醇進行醇沉、過濾，經(jīng)冷凍、干燥得到天麻粗多糖。

1.2.2 多糖含量測定

參考文獻[13-14]中方法稍作修改。

1.2.3 乙醇分級沉淀

參考文獻[15-16]中方法進行乙醇分級沉淀。向裝有已知體積的多糖濃縮液中加入乙醇使整個溶液中乙醇體積分數(shù)達55%，沉淀12 h，過濾，得到55%乙醇醇沉的天麻多糖；繼續(xù)向濾液中加入乙醇，直至乙醇體積分數(shù)為65%，沉淀12 h，過濾，得到65%乙醇醇沉的天麻多糖。類推上述操作，得到75%，85%的乙醇醇沉的天麻多糖。

1.2.4 天麻多糖的分離

參考文獻[17-18]中方法稍作修改，采用DEAE-52 纖維素作為層析柱的填料，將上述天麻粗多糖離心后取上清液，用0.45 μm 的水系過濾器過濾。濾液沿著玻璃層析柱的內(nèi)壁緩慢加入DEAE-52 纖維素層析柱中，分別用濃度為0.1，0.2，0.4 mol/L 的NaCl溶液梯度洗脫，控制流速為1 mL/min，每支試管接5 mL 的洗脫液，采用苯酚-硫酸法進行顯色跟蹤，當加入長時間收集液的顏色和加入蒸餾水的樣色一致時，即可判斷為無糖，換下一梯度的洗脫劑繼續(xù)進行再次洗脫，當最終的顏色變化不明顯時，可以停止洗脫。

1.2.5 天麻多糖抗氧化能力測定

羥自由基清除能力的測定參考文獻[19]中方法進行，DPPH 自由基抑制率的測定參考文獻[20]中方法稍作修改進行。

2 結果與分析

2.1 不同pH 值溶劑對天麻粗多糖提取率的影響

不同pH 值對天麻多糖提取率變化見圖1。

圖1 不同pH 值對天麻多糖提取率變化

由圖1 可知，在pH 值為4 時天麻多糖的提取率達到最高，為23.36%；當pH 值為2 時多糖提取率則最低，說明在適當?shù)娜跛嵝詶l件下能夠增加天麻多糖的提取率；在pH 值為2 時提取率卻比pH 值為4 時大大降低，可能是強酸性條件下有可能會引起多糖中的糖苷鍵斷裂，從而引起多糖水解，使其提取率降低。同理，pH 值為10 時提取率比pH 值為6時的提取率降低，也可能是因為強堿性條件下引起多糖中的糖苷鍵斷裂，多糖發(fā)生水解而導致提取率降低。

2.2 不同體積分數(shù)乙醇醇沉對天麻粗多糖提取率的影響

pH 值為4 的不同體積分數(shù)乙醇醇沉天麻多糖提取率見圖2。

圖2 pH 值為4 的不同體積分數(shù)乙醇醇沉天麻多糖提取率

由圖2 可知，通過配制不同體積分數(shù)的乙醇醇沉得出的多糖提取率不同。其中，85%的乙醇醇沉得到的天麻多糖提取率最高，55 %乙醇醇沉得到的多糖提取率最低，可知乙醇醇沉多糖得率隨著乙醇體積分數(shù)的增加而增加。

2.3 不同體積分數(shù)乙醇醇沉的天麻粗多糖的抗氧化能力研究

不同乙醇體積分數(shù)醇沉多糖對羥基自由基的抑制率見圖3，不同體積分數(shù)乙醇醇沉多糖對DPPH 自由基的抑制率見圖4。

圖3 不同乙醇體積分數(shù)醇沉多糖對羥基自由基的抑制率

圖4 不同體積分數(shù)乙醇醇沉多糖對DPPH 自由基的抑制率

由圖3 和圖4 可知，不同體積分數(shù)乙醇醇沉多糖對羥基自由基均有抑制率，多糖質(zhì)量濃度越高抑制效果越好，同一組多糖在不同體積分數(shù)下羥基自由基抑制率差異性明顯。通過85%乙醇醇沉所得多糖對羥基自由基的抑制效果最好，當多糖質(zhì)量濃度達到0.20 mg/mL 時抑制率為69.56%，55%乙醇醇沉所得多糖對羥基自由基的抑制率最低，為61.73%。由圖4 可知，不同體積分數(shù)乙醇醇沉多糖對DPPH 自由基的抑制率隨著多糖質(zhì)量濃度升高而升高。醇沉液體積分數(shù)為75%時多糖對DPPH 自由基的抑制率最高，當多糖質(zhì)量濃度達到0.20 mg/mL 時抑制率為42.16%。

2.4 天麻多糖的分離純化

天麻粗多糖的分離見圖5。

圖5 天麻粗多糖的分離

由圖5 可知，0.1 mol/L 的氯化鈉溶液在第92 管時顯色無糖，進行下一濃度梯度的洗脫，0.2 mol/L 的氯化鈉溶液在第150 管時顯色無糖，可進行下一濃度梯度的洗脫，0.4 mol/L 的氯化鈉在193 管時顯色無糖。從圖5 中的洗脫曲線中可看出，所測得的吸光度有2 個峰值，分別在第7 管和第76 管出現(xiàn)峰值，由于前面洗脫出的含有淀粉等雜質(zhì)，不能確定為純的多糖，所以棄去前一個峰值。收集第55～79 管的洗脫液，合并洗脫液，濃縮后測定多糖的抗氧化值，為多糖的功能特性研究奠定基礎。

2.5 不同pH 值條件提取的天麻多糖組分的抗氧化能力研究

不同pH 值條件提取的天麻多糖抗氧化能力見圖6。

圖6 不同pH 值條件提取的天麻多糖抗氧化能力

圖6（a）～圖6（d）分別代表pH 值為4，6，8，10 時提取的天麻粗多糖按照上述分離方法得出的多糖組分對羥基自由基和DPPH 自由基均有抑制率。由此可知，天麻多糖對羥基自由基和DPPH 自由基的抑制率隨著質(zhì)量濃度的升高而升高，且天麻多糖對羥基自由基的抑制率高于對DPPH 自由基。提取液pH 值為4 時提取的0.02 mg/mL 天麻多糖羥基自由基清除率最高，達75.61%；隨著提取液pH 值的升高，所提取的多糖羥基自由基抑制率越低，當提取液值pH 值為10 時，羥基自由基清除率為9.95%。提取液pH 值為4 和6 時，0.02 mg/mL 天麻多糖對DPPH 自由基抑制率相當；而提取液pH 值為8 和10時，0.02 mg/mL天麻多糖對DPPH 自由基抑制率分別為20.56%和7.22%，遠低于酸性提取液所提取的多糖組。

3 結論

通過配制不同pH 值緩沖溶劑提取天麻多糖，對粗多糖進行除蛋白處理，然后通過DEAE-52 纖維素為填料進行初步分離，并以羥自由基的清除能力和DPPH 自由基抑制率為考查指標探究各處理組天麻多糖的抗氧化能力。結果表明，pH 值為4 的緩沖液提取的天麻粗多糖的提取率最高，為23.6%；提取率隨著pH 值的升高呈現(xiàn)出一個先升高后降低的趨勢，此pH 值條件下通過85%乙醇醇沉所得多糖對羥基自由基的抑制效果最好，當多糖質(zhì)量濃度達到0.20 mg/mL時抑制率為69.56%，醇沉液體積分數(shù)為75%時多糖對DPPH 自由基的抑制率最高，當多糖質(zhì)量濃度達到0.20 mg/mL 時抑制率為42.16%。將不同pH 值條件下提取的天麻粗多糖進行分離純化，發(fā)現(xiàn)提取液pH 值為4時0.02 mg/mL 天麻多糖羥基自由基清除率最高達75.61%，酸性條件下無論是粗多糖還是分離出的多糖組分，其對羥基自由基抑制率和DPPH 自由基抑制率均高于堿性提取液所提取的多糖組。王慶等人[21]發(fā)現(xiàn)，超聲輔助和酶法提取的天麻多糖的抗氧化活性遠高于其他提取方法。陳琛等人[22]對天麻多糖的分離純化后測定其活性，得出對DPPH 自由基的清除率為44.50%，對羥自由基清除率為39.50%，與研究結果相似。綜上所述，不同pH 值和不同醇沉液體積分數(shù)不僅對天麻多糖提取率影響較大，且還影響其抗氧化能力，選擇合適pH 值的提取液更有利于高活性天麻多糖的制備，研究對高活性天麻多糖的提取及應用具有一定的指導意義。