戴榮 李建設(shè)

(寧夏大學(xué)葡萄酒與園藝學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

引言

番茄是寧夏設(shè)施冷涼露地主要栽培蔬菜之一[1]，其罹患的病毒病呈現(xiàn)出爆發(fā)性強，傳播快且危害范圍廣的現(xiàn)象，是造成番茄減產(chǎn)的重要原因[2]。目前，番茄可感染病毒病的種類較多，同時番茄出現(xiàn)復(fù)合侵染的情況較為普遍[3-5]。而田間雜草對番茄生長會造成嚴(yán)重威脅[6]，與番茄競爭生長空間，同時也為番茄病毒病的傳播提供了媒介[6]。目前，已對寧夏番茄植株上攜帶的病毒病種類做出鑒定[7-10]，但番茄田間雜草攜帶病毒種類還未有報道。本研究主要針對寧夏3個縣(市)7個鄉(xiāng)鎮(zhèn)56塊疑似攜帶病毒的番茄地田間雜草進行采樣，采取PCR、RT-PCR技術(shù)，明確田間雜草攜帶病毒種類，以期為今后番茄病毒病的防控提供更加科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2023年8月，對寧夏3個縣(市)7個鄉(xiāng)鎮(zhèn)共計56塊番茄田進行采樣調(diào)查。對疑似發(fā)病番茄周邊(地膜下雜草不取)的雜草進行拍照、采樣。株型小的雜草采集全株，株型大的雜草使用75%乙醇消毒后的剪刀剪取帶葉片的莖稈(藤蔓)1～2條，裝入裝樣袋，做好標(biāo)記。將采集樣品立即置于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ考羧?個樣品后立即用75%乙醇擦拭剪刀消毒處理。

1.2 植物總DNA/RNA的提取及cDNA的合成

參照試劑盒提供的方法，分別使用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(貨號：DP441)與天根多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒(貨號：DP360)提取田間雜草總RNA/DNA。以提取的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄。采用Vazyme生物公司的HiscriptⅢ1st Strand cDNA Synthesis Kit(貨號：R312-01)進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)的體系及步驟參照產(chǎn)品說明書。

1.3 番茄病毒引物信息

寧夏地區(qū)番茄病毒病主要受到番茄花葉病毒(tomato mosaic virus，ToMV)、番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)、番茄斑駁花葉病毒(tomato mottle mosaic virus)、南方番茄病毒(STV)、番茄褪綠病毒(Tomato chlorosis virus，ToCV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)7種病毒的侵染，并新發(fā)現(xiàn)番茄褐色皺紋病毒病(Tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV)。同時檢測另外常見的2種侵染番茄的病毒——煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)、番茄環(huán)紋斑點病毒(Tomato zonate spot virus，TZSV)。引物相關(guān)信息見表1。

表1 用于RT-PCR擴增番茄病毒的特異性引物

1.4 RT-RCR/RCR及電泳檢測

PCR/RT-RCR檢測：利用病毒特異性引物，見表1，按下述體系與條件擴增。體系：2×TaqMaster Mix(Dye Plus)(貨號：P112-01)10μL，上下引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O 7μL。條件：94℃→4min；94℃→30s，53℃→30s，72℃→45s，34個循環(huán)，72℃延伸10min。擴增完成，分別取4μL擴增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，并用全自動凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜草感染病毒的表現(xiàn)特征

通過走訪拍照采樣發(fā)現(xiàn)，與正常生長的雜草相比，感染病毒的苦苣菜上部新葉出現(xiàn)淺黑褐色斑點，見圖1a；下部老葉斑點顏色加深，斑點擴大，輕微萎縮，葉片蜷曲，可從葉片擴展至整棵植株，見圖1b；葉片背部葉脈由綠轉(zhuǎn)紫，莖稈支撐力變?nèi)酰仓甑狗?，部分葉片發(fā)生脫落，見圖1c。馬齒莧葉片出現(xiàn)黃色斑點，見圖1d；反枝莧新葉呈現(xiàn)黃色斑點，老葉邊緣黃化、褪綠，從邊緣輻射至葉脈，出現(xiàn)枯斑，見圖1e；打碗花葉片出現(xiàn)黃綠相間的花葉，見圖1f，莖稈發(fā)黃變脆，葉片向下卷曲，蔓延至整棵植株；凹頭莧葉片背部與長鬃蓼葉片正面，見圖1g、圖1h，均出現(xiàn)淺褐色斑點，集中密集；乳苣葉片出現(xiàn)古銅色斑塊，見圖1i，部分斑塊枯萎，葉片背部也清晰可見。

注：a～c為苦苣菜(菊科)；d為馬齒莧(馬齒莧科)；e為反枝莧(莧科)；f為打碗花(旋花科)；g為凹頭莧(莧科)；h為長鬃蓼(蓼科)；i為乳苣(菊科)。圖1 幾種雜草侵染病毒田間癥狀

2.2 寧夏番茄田間不同種類雜草所攜帶病毒檢測結(jié)果

通過對采集的18科53種576份雜草樣品提取總RNA/DNA，利用特異性引物進行RT-PCR/PCR擴增，如表2所示，結(jié)果表明，共檢測出6種病毒，分別為ToMV、TYLCV、TSWV、ToMMV、STV、ToCV。其中，295份樣品檢出病毒，有281個樣品未檢測到病毒，病毒檢出率高達51.22%。

表2 寧夏番茄田間雜草及其攜帶病毒種類

不同病毒感染的雜草種類與感染率有一定差異。STV可侵染的雜草種類和數(shù)量最多，除黃花蒿外18科52種193株雜草被感染，雜草種類間感染率略有差異，節(jié)節(jié)草感染率最高為64.71%，馬唐的感染率最低為9.09%；其次是ToCV，可侵染17科45種雜草，采集的菊科雜草2/3可被侵染；ToMV可感染12科23種雜草，菊科可侵染雜草種類最多，包括歐洲千里光、花葉滇苦菜等5種雜草；受到TYLCV侵染的雜草高達31種，采集的禾本科雜草均可感染此病毒，以冰草最甚，侵染率高達100%；TSWV可侵染的雜草種類最少，涉及6科11種雜草，十字花科的3種雜草皆可感染此病毒，1/2獨行菜樣品檢測出此病毒；ToMMV可侵染的雜草種類最少，涉及5科8種雜草，包括馬唐、早熟禾、苦苣菜、黃花蒿、藜、地膚、打碗花與野西瓜苗。

從被感染雜草種類的角度來分析，STV感染雜草的情況依次為其他科、莧科、藜科、菊科、蓼科、禾本科；ToCV感染率排序為莧科>其他科>藜科>菊科、蓼科>禾本科；ToMV感染雜草的種類最低為藜科，禾本科、菊科、莧科感染率相差不大，蓼科未檢測到被侵染雜草；TYLCV感染率排序為莧科>禾本科>菊科>藜科>蓼科>其他科；TSWV感染率的高低順序為其他科>莧科>菊科，其中禾本科、蓼科與藜科未檢測到雜草感染；ToMMV感染率排序為其他科>禾本科>藜科>菊科，蓼科與莧科未檢測到感染樣本。

對雜草感染番茄病毒種類整理并進行數(shù)據(jù)分析，STV的檢出比例最高為33.51%，是危害寧夏范圍最廣的病毒；其次是ToCV，檢出率為27.95%；ToMV、TYLCV的檢出率分別為13.37%、14.41%；TSWV、ToMMV總檢出率較低，分別為5.73%、4.17%。

2.3 寧夏地區(qū)雜草攜帶番茄病毒的復(fù)合侵染分析

使用ToMV、TYLCV、TSWV、ToMMV、STV與ToCV的特異性引物，見表1，對所采集的576份樣品進行PCR/RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，分別擴增出480bp、648bp、425bp、1193bp、681bp、450bp。而TMV、CMV、TZSV、ToBRFV與陰性對照均未擴增出目的條帶。對采自立崗鎮(zhèn)的打碗花進行實驗，擴增出480bp、425bp、681bp、450bp 4條特異性DNA條帶，見圖2，分別為ToMV、TSWV、STV、ToCV 4種病毒。說明所采集的番茄地田間雜草發(fā)生了復(fù)合侵染現(xiàn)象。

1.番茄花葉病毒；2.番茄黃化曲葉病毒??；3.番茄斑萎病毒；4.煙草花葉病毒；5.番茄斑駁花葉病毒；6.南方番茄病毒；7.黃瓜花葉病毒；8.番茄褪綠病毒；9.番茄環(huán)紋斑點病毒；10.褐色皺紋果病毒；11.陰性對照；M.分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 DNA Marker圖2 打碗花PCR/RT-PCR擴增電泳凝膠圖像

通過對雜草感染番茄病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象進行分析發(fā)現(xiàn)，見表3，在292份陽性樣品中，有37份樣品為單一病毒感染，復(fù)合侵染率高達87.33%。2種病毒復(fù)合侵染情況最嚴(yán)重，占復(fù)合侵染總比的41.57%，其中STV加ToCV為優(yōu)勢毒株，在寧夏地區(qū)侵染面積最廣，感染植株種類最多；3種病毒復(fù)合侵染類型較多，侵染率為38.04%；4種病毒復(fù)合侵染率略低，占復(fù)合侵染總比的19.61%；5種病毒侵染率最低，為0.78%，病毒感染種類復(fù)雜，分別為ToMV加TSWV加ToMMV加STV加ToCV，ToMV加TYLCV加ToMMV加STV加ToCV。暫未檢測出6種病毒的復(fù)合侵染。

表3 寧夏地區(qū)雜草主要病毒病侵染率

3 討論

本研究采用分子技術(shù)檢測的方法，對采自寧夏3個縣(市)7個鄉(xiāng)鎮(zhèn)56塊番茄田18科53種576份雜草樣本進行病毒檢測，結(jié)果共檢測出ToMV、TYLCV、TSWV、ToMMV、STV與ToCV 6種病毒。劉晨等研究認(rèn)為，TYLCV可以感染多種雜草[15]，本試驗暫未得到全部驗證，可能與樣本數(shù)量、采樣地環(huán)境、藥物控制及此地頻發(fā)病毒類型等原因相關(guān)。TSWV可侵染的雜草以菊科侵染的數(shù)量占比最大，與李婷婷等研究結(jié)果吻合[16]，同時雜草也是TSWV越冬毒源[17]。STV可侵染的雜草種類和數(shù)量最多，遍布所采樣本的18科52種193株雜草；ToCV為寧夏番茄病毒病的主流病毒[18]，發(fā)現(xiàn)可侵染17科46種雜草；表明STV、ToCV這2種病毒在雜草上的寄主廣泛，以禾本科和菊科可侵染雜草種類最多；且盧丁伊慧等通過對ToCV的模型研究得出，上一茬番茄收獲后，雜草作為中間寄主，利用煙粉虱的活動侵染下一茬番茄，形成周期性循環(huán)[19]。ToMMV自寧夏地區(qū)番茄上檢出后，首次在禾本科、菊科、藜科等5科8種雜草上被鑒定，檢出率為4.17%，可能通過混有病殘體的土壤、種子與攜帶病毒的植物摩擦[20]傳播此病毒。ToMV可侵染禾本科等11科22種雜草，與張海峰研究相符合[21]，或通過與感病番茄葉片摩擦、攜帶病毒的土壤和殘存的根莖與種子帶毒傳播[22]。ToMMV與ToMV的寄主范圍有一定差異[23]。高溫干旱、粉虱的爆發(fā)與病毒病的傳播密切相關(guān)[24]。從雜草類型的角度分析，禾本科與菊科感染頻率最高，可能與這2種雜草種類多且為田間優(yōu)勢雜草有關(guān)。所采集的樣品來自番茄采收末期，正值番茄病毒爆發(fā)期。高溫干旱，粉虱、薊馬等蟲害，田間管理與病株間相互摩擦等綜合因素使得病毒侵染率居高不下。

蔬菜作物上檢出病毒復(fù)合侵染情況不足為奇，不同類型病毒發(fā)生復(fù)合侵染，導(dǎo)致植物內(nèi)病毒間協(xié)同或拮抗，更多表現(xiàn)為協(xié)同[25]。雜草最多可被5種病毒同時侵染，STV與多種病毒復(fù)合侵染，在山東[28]、新疆[29]、北京[30]等地均有報道。本研究通過對番茄病毒在雜草上復(fù)合侵染的現(xiàn)象進行分析發(fā)現(xiàn)，2種及2種以上病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象頻發(fā)。復(fù)合侵染的雜草樣本占總樣本數(shù)量的44.27%，主要以ToMV與TSWV、ToMMV、STV、ToCV、TYLCV病毒發(fā)生復(fù)合侵染，其中2種病毒復(fù)合侵染情況最嚴(yán)重，占復(fù)合侵染總比的41.57%，以STV加ToCV復(fù)合侵染為寧夏地區(qū)優(yōu)勢病毒。檢測出ToCV與TSWV侵染，這2種病毒間發(fā)生相互協(xié)作[26]。劉微研究表明，ToCV與煙粉虱、植物三者存在互作關(guān)系，與健康番茄相比，帶ToCV的番茄釋放出的物質(zhì)吸引煙粉虱取食，加速病毒的傳播[27]。猜測攜帶ToCV的雜草也可釋放出吸引煙粉虱來取食的物質(zhì)，從而加速病毒傳播。而TSWV加ToCV兩者的協(xié)同作用或?qū)е聦?種病毒敏感的番茄加速死亡，攜帶Sw-5抗病基因的番茄對TSWV表現(xiàn)出抗性[26]；在雜草上是否表現(xiàn)抗性或加速死亡，還需進一步探究。TYLCV加TSWV加STV加ToCV 4種病毒的復(fù)合侵染，或因昆蟲獲毒、病毒協(xié)作、土壤帶毒所致[31]。雜草出現(xiàn)病毒復(fù)合侵染與病毒的傳播方式、周圍環(huán)境、土傳病害、栽培作物等息息相關(guān)[10]。

試驗樣品采自番茄收獲末期，未體現(xiàn)不同生長階段番茄與雜草攜帶病毒的差異性及相關(guān)性；番茄生長后期攜帶病毒種類繁多，可能導(dǎo)致雜草帶病毒率更高。雜草是否感染寧夏地區(qū)番茄病毒病的其他毒源，還需進一步擴大樣本容量去證實。

4 結(jié)論

寧夏地區(qū)番茄地田間雜草感染番茄病毒情況較為嚴(yán)重，2種病毒復(fù)合侵染情況最為普遍，暫未發(fā)現(xiàn)雜草不感染番茄病毒。雜草作為昆蟲棲身地與飲食場所，也是病毒傳播的重要寄主[16，32-35]，為番茄病毒病的傳播提供了可能，控制雜草在控制番茄病毒傳播的同時有效減輕對作物傷害。結(jié)合前人眾多研究成果和本研究結(jié)果分析認(rèn)為，在農(nóng)業(yè)操作中，種植前徹底鏟除田間雜草成為必要的工作[36]，還要控制田間昆蟲數(shù)量，減少傳播來源，切斷傳播途徑[37]，實行輪作，以避免因雜草、種子或土壤帶毒傳染下一茬作物，引發(fā)番茄病毒病，從而造成減產(chǎn)和品質(zhì)下降。