周辰炎 劉慶 李金麗

(天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300392)

Quinone outside inhibitors(QoI)類殺菌劑作用于線粒體呼吸鏈復(fù)合物III，可以結(jié)合在內(nèi)膜外壁的氧化位點Qo上，阻止復(fù)合物III中電子從細(xì)胞色素b(Cytochromeb，Cyt b)到細(xì)胞色素c1(Cyt c1)的傳遞，從而抑制病原真菌ATP的產(chǎn)生，使菌體缺乏能量而造成生理生化紊亂致死。QoI類殺菌劑是從天然產(chǎn)物嗜球果傘素A(Strobilurin A)衍生合成而來，是一類廣譜、高效、安全、促生的新型仿生型殺菌劑[1]。根據(jù)化學(xué)基團(tuán)的不同，殺菌劑抗性行動委員會(FRAC)將QoI類殺菌劑分為9類，常用的有甲氧基丙烯酸酯類(如嘧菌酯Azoxystrobin，啶氧菌酯Picoxystrobin和唑菌酯Pyraoxystrobin)、甲氧基氨基甲酸酯類(如吡唑醚菌酯Pyraclostrobin)和氨基乙酸酯類(如醚菌酯Kresoxim-Methyl和肟菌酯Trifloxystrobin)等。根據(jù)是否存在交互抗性，QoI類殺菌劑被分為2個亞組，即代碼11組和11A組，目前除了甲萘威(Metyltetraprole)屬于11A組，其余均屬于11組。甲氧基丙烯酸酯類作為活性成分較高的第1大類，嘧菌酯則是第1代被開發(fā)的此類殺菌劑，該藥劑自1996年上市以來，截至目前在殺菌劑行業(yè)中依舊維持著不可撼動的銷量[2]。

盡管QoI類殺菌劑效果顯著，被廣泛應(yīng)用于病原真菌，但隨之出現(xiàn)的抗藥性問題以及后續(xù)治理仍是不可避免的。由于其作用靶標(biāo)位點單一，極易受病原物單基因或寡基因突變的影響，從而使病原物產(chǎn)生抗藥性，目前已被FRAC列入高等抗藥性風(fēng)險。自1998年，德國北部報道了首例抗醚菌酯的小麥白粉病菌株，至今在全球范圍內(nèi)已出現(xiàn)了大量QoI類殺菌劑抗藥性菌株[3]。早年間，我國殺菌劑不合理使用和抗性治理不完善等現(xiàn)象導(dǎo)致了此類殺菌劑的抗藥性風(fēng)險比國外高[4]。此外，由于QoI類具有特殊的廣譜殺菌活性，世界上絕大多數(shù)作物或瓜果上的病原菌受到了影響，且對于同類殺菌劑的施用還會產(chǎn)生交互抗性而生成更加耐藥群體，故目前對于該靶標(biāo)位點新藥的研發(fā)進(jìn)程是一個巨大挑戰(zhàn)。本文重點在于闡述QoI類殺菌劑抗藥性機制和提出相應(yīng)的抗性治理措施，從而為延緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生，保障和提高農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量，新型藥劑的開發(fā)提供新思路。

1 QoI類殺菌劑的抗藥性機制

根據(jù)全球監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，至今已存在多達(dá)36種的植物病原菌對QoI類殺菌劑呈現(xiàn)不同水平的抗藥性，由于施用嘧菌酯和吡唑醚菌酯而產(chǎn)生抗藥性的病原菌占多數(shù)[3]。

大量研究表明，病原菌對QoI類殺菌劑產(chǎn)生抗性的機制主要有3種：靶標(biāo)位點突變，旁路氧化途徑和多重抗藥性相關(guān)蛋白的過表達(dá)，如圖1所示。相較于其他2種作用機制，靶標(biāo)位點的突變具有遺傳性，在病原菌長期演化過程中占據(jù)主導(dǎo)地位，這也是抗藥性監(jiān)測中最重要的1項依據(jù)指標(biāo)。

注：(A)為運輸體蛋白對QoI殺菌劑分子的外排作用；(B)為靶標(biāo)位點的突變導(dǎo)致結(jié)合位點與QoI類殺菌劑的親和力降低；(C)為AOX途徑。圖1 植物病原真菌對QoI類殺菌劑的抗性分子機制

1.1 靶標(biāo)位點突變

已有報道顯示，QoI類殺菌劑的抗藥性主要與靶標(biāo)線粒體復(fù)合體Ш細(xì)胞色素b基因高度保守區(qū)第1個區(qū)域(氨基酸位點125～155)的點突變有關(guān)，其中單點突變G143A和F129L導(dǎo)致的對應(yīng)氨基酸的蛋白空間構(gòu)象變化，從而降低了與藥劑的結(jié)合性是抗性產(chǎn)生的常見原因。研究表明，G143A突變會使復(fù)合體III Qo結(jié)合口袋變窄，從而降低與嘧菌酯的結(jié)合性，而F129L突變則干擾殺菌劑藥效基團(tuán)與結(jié)合位點之間的作用力[6]。G143A是抗性菌株中普遍存在的1個突變位點，研究表明，G143A突變能夠賦予多種植物病原真菌高等水平抗性，并且多數(shù)情況下的G143A突變株具有遺傳穩(wěn)定性，能夠發(fā)展為優(yōu)勢種群。如，在田間突變體與敏感參考菌株有性雜交的灰霉(Botrytis cinerea)子囊孢子后代中，G143A類型的抗性基因可以母系穩(wěn)定遺傳[7]；Wang等[8]通過連續(xù)傳代培養(yǎng)黃瓜黑星病菌(Corynespora cassiicola)發(fā)現(xiàn)，菌落直徑和孢子數(shù)量在G143A突變體中并沒有發(fā)生顯著變化。

根據(jù)近年來的QoI類殺菌劑的抗藥性監(jiān)測結(jié)果顯示，多數(shù)的抗性突變體在Cyt b上存在多位點突變[9-17]，如表1所示。如，對嘧菌酯耐藥的稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)突變體中，G143S與G143A的突變比達(dá)8∶1；G143S、G137R和M296V 3個點突變賦予了M.oryzae對肟菌酯的抗性；小麥褐斑病(Pyrenophora tritici-repentis)種群中存在G143A、F129L和G137R的不同抗性水平的突變位點，在歐洲等地也監(jiān)測到了這3種類型的突變位點[10]；在曲霉菌(Aspergillus uvarum)分離株監(jiān)測到含有S108A、F129L和A194V 3個突變位點[13]。由此可見，隨著藥劑選擇壓的增加，病原菌產(chǎn)生的適應(yīng)性變異使靶標(biāo)位點突變的多樣性和可變性的趨勢更加明顯。

表1 QoI類殺菌劑抗藥性菌株在Cyt b上的突變類型

1.2 旁路氧化途徑

旁路氧化途徑(Alternative oxidase，AOX)也稱交替氧化途徑，普遍存在于多種高等植物、真菌、藻類和原生動物中。AOX途徑是除細(xì)胞色素途徑外，真菌和高等植物線粒體的另一呼吸電子傳遞鏈，以旁路氧化酶AOX為末端氧化酶。AOX途徑可直接接受輔酶Q傳來的電子傳遞到氧生成水，而不經(jīng)過復(fù)合物Ⅲ和復(fù)合物Ⅳ 2個ATP能量合成位點，因而形成較少的ATP，從而導(dǎo)致真菌對殺菌劑的敏感性降低[5]。已有研究證實，AOX途徑編碼基因aox的表達(dá)水平參與調(diào)控真菌對一些殺菌劑的抗藥性，在常見病原真菌核盤菌屬(Sclerotinia spp.)和核果類褐腐病菌(Monilinia fructicola)中，田間或室內(nèi)誘導(dǎo)抗性突變體均未發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)基因cytb的點突變[18，19]，故推測其抗藥性機制可能與AOX途經(jīng)有關(guān)。

aox基因在不同植物病原真菌中的表達(dá)方式不同，aox過表達(dá)突變體一般僅出現(xiàn)在高等抗性水平分離株中[20]。當(dāng)以cytb介導(dǎo)的呼吸途徑受阻或線粒體蛋白合成受抑制時，aox表達(dá)方式為誘導(dǎo)表達(dá)型，這是病原真菌對QoI類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的主要原因。有實驗研究表明，aox的誘導(dǎo)表達(dá)增強了小麥葉枯病菌(Septoria tritici)對嘧菌酯的抗藥性，嘧菌酯抗性突變體與敏感菌株相比具有較高的aox表達(dá)水平[21]；aox參與調(diào)控核盤菌(S.sclerotiorum)對啶氧菌酯的敏感性[18]；在稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和灰葡萄孢(B.cinerea)中aox基因敲除突變體降低了對嘧菌酯的抗藥性[22，23]。此外，AOX途徑對Cyt途徑抑制劑氰化物不敏感，但對氧肟酸化合物敏感[5]，水楊羥肟酸(Salicylhydroxamic acid，SHAM)就是常用的一種AOX抑制劑，所以，SHAM在阻斷病原菌的AOX途徑，協(xié)同增強以復(fù)合物III為靶標(biāo)殺菌劑的防治效果中起重要作用。

1.3 多重抗藥性

多重抗藥性(Multipledrug resistance，MDR)是指病原物在藥劑選擇作用下，產(chǎn)生了對多種類型作用機制藥劑具有抗性的群體，導(dǎo)致對許多藥劑產(chǎn)生敏感性下降的系列問題。細(xì)胞內(nèi)藥物外排活性的增強導(dǎo)致了多重抗藥性的產(chǎn)生，該活動的載體蛋白主要為ABC運輸體蛋白(ATP-binding cassette)和MFS運輸體蛋白(Major facilitator superfamily)。ABC蛋白和MFS蛋白普遍存在于所有生物體中，ABC運輸體蛋白是真菌細(xì)胞膜上的膜轉(zhuǎn)運蛋白，通過結(jié)合并水解ATP產(chǎn)生的能量將藥物分子外排出胞內(nèi)，與ABC蛋白不同的是MFS蛋白通過質(zhì)子驅(qū)動力將藥物外排出真菌體內(nèi)[24]。

關(guān)于多重抗藥性的報道常見于灰霉菌株(B. cinerea)中，灰霉病是我國作物常見真菌病害，因常年受到多種藥劑施加處理從而產(chǎn)生多重抗藥性?；颐咕哂?個ABC運輸體蛋白(BcatrB、BcatrD、BcatrK)和2個MFS運輸體蛋白(Bcmfs1、BcmfsM2)，這些運輸體蛋白已被證明，是室內(nèi)或野外突變體中產(chǎn)生MDR的決定因素。Pierre等[25]從法國和德國葡萄園中采集到的MDR灰霉菌菌株中檢測到了BcatrB和BcmfsM2的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)MDR灰霉菌株對大多數(shù)殺菌劑均具有一定抗藥性，如BcatrB過表達(dá)菌株對醚菌胺、吡唑醚菌酯和肟菌酯具有抗性，而BcmfsM2過表達(dá)菌株對吡唑醚菌酯和肟菌酯具有抗性，并推測種群內(nèi)頻繁的基因重組可能是產(chǎn)生多重抗藥性的主要原因之一。

2 QoI殺菌劑抗藥性治理

殺菌劑抗藥性治理的實質(zhì)是以科學(xué)的手段最大限度地阻止或延緩抗性群體的形成與發(fā)展。基本原則以預(yù)防為主，在綜合防治中輪換或交替用藥。目的是使具有抗藥性風(fēng)險的殺菌劑使用壽命延長，降低抗性種群出現(xiàn)的風(fēng)險，使敏感種群在病原菌群體中一直處于優(yōu)勢地位，當(dāng)下一個種植循環(huán)中再次使用具有抗藥性風(fēng)險的殺菌劑時，這些殺菌劑仍然具有較好的防治效果。本文結(jié)合QoI類殺菌劑的特點，主要介紹3種抗性治理方法降低該類殺菌劑的抗藥性風(fēng)險。

2.1 抗藥性快速監(jiān)測方法

關(guān)注病原菌對QoI類殺菌劑的敏感性動態(tài)，加強殺菌劑抗藥性菌株的田間監(jiān)測力度，以便于進(jìn)一步掌握抗性菌株適合度變化程度，解析其抗藥性機制，從而對植物病害的合理防控，延緩該類殺菌劑使用壽命及新型藥劑創(chuàng)制具有重要基礎(chǔ)意義。

基于QoI類殺菌劑的抗藥性機制，目前針對靶標(biāo)位點的突變類型已建立了快速、高效、靈敏的檢測方法，可有效驗證cytb基因的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNPs)，如數(shù)字液滴法PCR(Digital Droplet PCR)可用于快速檢驗的常規(guī)定量突變，該方法具靈敏性和準(zhǔn)確性，對于早期田間抗性菌株的監(jiān)測十分重要。根據(jù)cytb基因突變轉(zhuǎn)換或顛換類型的不同而建立精準(zhǔn)高效的監(jiān)測體系，快速環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)能夠快速檢測從而識別突變類型。分子對接(Molecular docking)也是一種快速檢測QoI類殺菌劑抗性的方法，該方法可用于判定cytb亞基中蛋白構(gòu)象改變程度和結(jié)合模式[10]，如在稻瘟病菌(M.grisea)抗性突變體中，預(yù)測到G143S突變減弱了氫鍵的相互作用，而G137R和M296V改變了肟菌酯分子在Cyt b結(jié)合口袋中的構(gòu)象[12]。在未來，高通量測序或分子檢測技術(shù)是抗藥性快速檢測的主要發(fā)展方向之一。

2.2 QoI類殺菌劑的合理使用

要關(guān)注作物在病害發(fā)生前后的概況，做好預(yù)測預(yù)報，制定綜合防治策略，一般推薦在病害發(fā)生前使用保護(hù)性殺菌劑，在病害發(fā)生后使用治療性殺菌劑，從而減少化學(xué)用藥過程中病害抗性突變體的產(chǎn)生。針對農(nóng)作物的種類和殺菌劑的不同類型，做出相應(yīng)治理措施。有關(guān)殺菌劑的合理使用，提出2點建議。

2.2.1 使用多位點殺菌劑的共制劑或交替施用不同類型殺菌劑

雖然藥劑混用無法從根本上阻止殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生，但是可以降低殺菌劑抗藥性選擇的壓力，從而延長殺菌劑的使用壽命。同時，由于QoI類殺菌劑易產(chǎn)生抗藥性，因而復(fù)配制劑中另一成分應(yīng)選用不易產(chǎn)生抗性的藥物來延長QoI類農(nóng)藥的生命期，或者選取不存在交互抗性的藥劑交替使用，從而延緩抗藥性的產(chǎn)生。

2.2.2 殺菌劑與助劑或生物制劑的復(fù)配，可優(yōu)化殺菌劑劑型、構(gòu)型和效果

目前許多研究用于開發(fā)農(nóng)藥助劑，這類助劑大多基于緩釋劑或控釋劑構(gòu)造，能夠有效協(xié)助殺菌劑進(jìn)入病原真菌細(xì)胞內(nèi)，從而從原藥總量上減少藥物分子的施用，同時能夠提供植物所需的微量元素營養(yǎng)。Shan的研究中，鐵基多孔金屬有機框架(Metal-organic frameworks，MOFs)作為控制殺菌劑釋放的載體，搭載了嘧菌酯的MOFs對小麥赤霉病(Fusarium graminearum)和番茄晚疫病(Phytophthora infestans)表現(xiàn)出良好的殺菌活性[26]；CuZn和ZnO無機納米顆粒(Inorganic nanoparticles，INPs)可加工為納米殺菌劑用來防治灰霉菌(B.cinerea)和核盤菌(S.sclerotiorum)，對施藥后的植物保護(hù)作用和藥劑易位有顯著影響[27]。使用天然化合物對植物病原真菌進(jìn)行化學(xué)增敏是降低殺菌劑抗性風(fēng)險和殺菌劑其他負(fù)面影響的最具前景的手段之一，近年來研究較多的生防菌有青霉屬(Penicillium spp.)、擬青霉屬(Purpureocillium spp.)、木霉屬(Trichoderma spp.)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等。畢秋艷等研究顯示，枯草芽孢桿菌HMB20428與嘧菌酯有協(xié)同增效作用，增強了葡萄霜霉病(Plasmopara viticola)的防治效果[28]；橘青霉(Penicillium citrinum)的次生代謝產(chǎn)物能夠增強白粉病菌(Parastagonospora nodorum)對嘧菌酯的敏感性[29]。此外，為提高殺菌劑利用率和防效，應(yīng)當(dāng)優(yōu)化藥劑劑型和構(gòu)型，針對不同作物在不同環(huán)境條件下選用對應(yīng)的農(nóng)藥劑型，如粉劑(DP)、可濕性粉劑(WP)、懸浮劑(SC)等，且對施藥器材應(yīng)進(jìn)行科學(xué)校正，防止大面積噴施時產(chǎn)生的藥劑漂移等情況。

2.3 發(fā)展抗性治理新策略

由于不同作用機制的殺菌劑資源十分有限，近年來新靶標(biāo)殺菌劑的開發(fā)和上市率逐漸下降等問題[5]，進(jìn)一步加劇了現(xiàn)有殺菌劑的使用壽命和抗性治理方面的挑戰(zhàn)。因此，新藥的開發(fā)與選擇，及延緩現(xiàn)有殺菌劑的使用壽命仍是抗性治理的關(guān)鍵。

丁香菌酯(Coumoxystrobin)和氯啶菌酯(Triclopyricarb)由我國沈陽化工研究院研發(fā)，于2016年在我國登記使用，是近年來取得顯著效果的新型QoI類殺菌劑，都位于代碼11組。根據(jù)FRAC評定的相同組別中的殺菌劑具有直接的交互抗性的特點，丁香菌酯和氯啶菌酯在擁有良好殺菌活性的同時，仍具有中、高抗藥性風(fēng)險，需合理使用。由于QoI類殺菌劑的另一亞組11A與11組之間無交互抗性，這是一個重要的抗藥性治理依據(jù)，為新構(gòu)型化合物的篩選提供了有力思路。四唑啉酮類的甲萘威正是目前獨屬于11A的新型殺菌劑，其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)對于QoI類抗性突變體仍然具有高的抑制活性，并且尚未增加G143A抗性分離株的比例[30]，未來可根據(jù)甲萘威的活性結(jié)構(gòu)和制備路線，研發(fā)篩選出其他具有良好殺菌活性且無交互抗性的QoI類殺菌劑。

研發(fā)與利用具有負(fù)交互抗性的殺菌劑也是抗性治理的新策略。當(dāng)前對QoI類產(chǎn)生負(fù)交互抗性的特殊殺菌劑有醌外Qi位點抑制劑(QiIs)。吡啶酰胺類化合物Fenpicoxamid和Florylpicoxamid是近年來研發(fā)的新型QiI類殺菌劑，這類殺菌劑以線粒體呼吸鏈復(fù)合物III的醌還原位點Qi位點為靶標(biāo)，同樣可阻止復(fù)合物III中電子從Cyt b傳遞到Cyt c1，使用該類殺菌劑可以延緩病原體對QoI類抗藥性的出現(xiàn)。因此，探索其他殺菌劑與QoI類之間的負(fù)交互抗性，以彌補QoI類殺菌劑在抗性菌株中的良好防治作用，也是一個有力的抗性治理思路。

此外，針對不同病原菌和植株的相互作用，加快培育抗病、耐病植株進(jìn)程仍是可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與發(fā)展的必要策略。

3 結(jié)論與展望

QoI類殺菌劑是防治植物真菌性病害中常用的殺菌劑，目前多種作物或瓜果蔬菜上的病原菌已對其產(chǎn)生抗藥性，因此，了解病原真菌對殺菌劑的抗性機制是做好抗藥性監(jiān)測和抗藥性治理的前提。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，植物病原真菌對QoI類殺菌劑產(chǎn)生抗性的機制主要是靶標(biāo)位點突變、旁路氧化酶作用和多重抗藥性蛋白過表達(dá)。抗性突變菌株在靶標(biāo)位點即細(xì)胞色素b基因的Qo位點上常具有G143A、F129L以及其他基因突變類型，現(xiàn)已向多位點突變和突變多樣性的趨勢發(fā)展；旁路氧化酶是抗性菌株繞開細(xì)胞色素b途徑而進(jìn)行呼吸鏈中能量傳遞的重要酶，表達(dá)方式常為誘導(dǎo)表達(dá)；多重抗藥性的產(chǎn)生一般是指在多種類型殺菌劑的選擇壓下，病原真菌將過表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)的運輸體蛋白，從而將藥劑排出細(xì)胞內(nèi)使其免受大部分殺菌劑的干擾?；诮陙砜剐苑N群發(fā)展速率的不斷提升，提前做好病蟲害的預(yù)測預(yù)報分析，施用高效安全綠色的藥劑仍是農(nóng)作物病害大規(guī)模發(fā)生的阻斷環(huán)節(jié)。采取綜合防治措施，科學(xué)合理精準(zhǔn)用藥，培育抗性植株和持續(xù)開發(fā)新型靶標(biāo)藥物是當(dāng)前抗藥性治理的根本策略。結(jié)合綠色智慧農(nóng)業(yè)，拓寬田間抗性監(jiān)測技術(shù)，建立健全種植體系，帶動高素質(zhì)農(nóng)戶進(jìn)行科普實踐也是發(fā)展農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的關(guān)鍵一環(huán)。