馮建杰,周長明,郜昭慧（北京市藥品檢驗研究院,國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室,中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室,北京 102206）

離子色譜法是采用高壓輸液泵將洗脫液泵入色譜柱中，對可解離物質進行分離測定的色譜方法，廣泛用于測定無機陰離子、無機陽離子、有機酸、糖等成分的含量，在藥品質量分析領域發(fā)揮著重要作用[1-6]。

凝血因子Ⅷ的生理作用是在血管出血時被激活，和血小板粘連在一起并且補塞血管上的漏口，這個過程被稱為凝血[7]。在血友病中，80%的病人患有血友病A，該類病人主要缺少正常人所擁有的凝血因子Ⅷ[8-9]。我國市場上除了德國拜耳公司的重組凝血因子Ⅷ，其他均為國內企業(yè)生產(chǎn)，均從血液中提取。鈣離子在凝血中扮演著非常重要的角色，鈣離子能夠促進凝血因子的激活，在凝血過程中，凝血因子需要被激活才能發(fā)揮作用[10-14]。而鈣離子能夠與凝血因子相互作用，促進其激活，從而加速凝血過程。此外，鈣離子還能夠促進血小板的聚集，增強血小板與血管壁的黏附力，從而形成血栓，防止血液過度流失。本論文中建立了測定人凝血因子Ⅷ中鈣離子含量的離子色譜方法，該方法專屬性強，靈敏度高，比傳統(tǒng)鈣離子測定所用的試劑盒及原子吸收法提高了準確率和工作效率，可準確測定樣品中鈣離子含量，為更好地把控該品種質量提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Thermo ICS-3000型離子色譜儀，AERS 500型抑制器（規(guī)格為4mm），均購自賽默飛世爾科技公司；Arium Pro型超純水機購自德國賽多利斯公司；XA205型電子分析天平購自梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為十萬分之一。

1.2試藥 鈣離子標準溶液購自中國計量科學研究院，批號為17083，質量濃度為1000μg/mL；人凝血因子Ⅷ來自于兩個廠家（A廠家：批號分別為202211080，202211082，202 301005；B廠家：批號為B20221004）。

2 方法與結果

2.1溶液的制備 精密量取0.5、1.0、1.5、2.0，2.5mL質量濃度為25mmol/L的鈣離子標準溶液，分別置于25mL容量瓶中，用純化水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液；取供試品一支，用10ml注射用水復溶，搖勻作為供試品溶液；取注射用水作為空白溶劑。

2.2色譜條件 色譜柱：CS12A陽離子交換柱（250mm×4mm）或效能相當?shù)纳V柱；流動相：0.025mol/L甲烷磺酸溶液；使用電導檢測器，使用CSRS ULTRAⅡ4mm抑制器，抑制電流為90mA；流速1.0mL/min；檢測器溫度為35℃；進樣量25μL。

2.3方法學考察 參照2020版《中國藥典》第四部9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則進行方法學考察。

2.3.1專屬性 取2.1項下對照品溶液、供試品溶液和空白溶劑各25μL，照2.2項下色譜條件進樣分析，色譜圖見圖1。結果表明，空白溶劑色譜圖中在主成分峰位置處無峰檢測到，對測定結果不產(chǎn)生干擾。供試品溶液色譜圖中色譜峰與對照品溶液色譜圖中色譜峰保留時間一致。

2.3.2線性關系與定量限檢測限 取質量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L的系列對照品溶液，照2.2項下色譜條件分別注入離子色譜進行分析，以鈣離子質量濃度（X，mmol/L）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y=12.618X-0.467，r=0.9998（n=5）。取質量濃度為1.5mmol/L鈣離子對照品溶液，用純化水逐級稀釋，并進行離子色譜檢測，記錄峰面積及S/N值，以S/N=3時測得量為檢測限，S/N=10時測得量為定量限。測得檢測限為0.0003mmol/L，定量限為0.0006mmol/L。線性關系表明，鈣離子在0.5-2.5mmol/L質量濃度范圍內與峰面積線性關系良好。

2.3.3精密度試驗 取質量濃度為1.5mmol/L對照品溶液，按2.2項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次。結果鈣離子峰面積的RSD為1.00%（n=6），證明此儀器精密度良好。

2.3.4重復性試驗 取樣品（批號為202211080）適量，照2.1項下方法平行制備6份供試品溶液，并照2.2項下方法進行樣品定量測定。鈣離子含量的RSD為1.14%（n=6），證明此方法重復性良好。

2.3.5穩(wěn)定性試驗 取樣品（批號為202211080）適量，照2.1項下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、12、24小時，照2.2項下色譜條件分別于規(guī)定時間進樣測定。鈣離子峰面積的RSD為0.91%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24小時內穩(wěn)定性良好。

2.3.6加樣回收試驗 取已知含量的樣品1支，用10mL注射用水復溶，搖勻為供試品溶液。精密量取質量濃度為25mmol/L對照品溶液0.12、0.15、0.18mL，分別置于2.5mL容量瓶中，各質量濃度平行制備3份，用供試品溶液稀釋至刻度。取上述溶液，按2.2項下色譜條件進樣測定，采用外標法計算加樣回收率。鈣離子回收率平均值為99.70%，RSD為0.76%（n=9），證明此方法準確度良好。

2.4樣品中鈣離子含量測定 隨機取樣品4批（批號分別為202211080，202211082，202301005，B20221004）樣品，照2.1項下制備供試品溶液。分別采用離子色譜法以及現(xiàn)行標準中試劑盒法、原子吸收法測定鈣離子的含量，結果見表1。

表1 離子色譜法與其他方法測定鈣離子含量結果比較(mmol/L)

3 討論

現(xiàn)行版中國藥典中并未對人凝血因子Ⅷ中鈣離子進行控制，國內廠家執(zhí)行的國家藥品標準YBS0126201中以試劑盒法測定鈣離子的含量，國家藥品標準YBS00172020中以原子吸收法測定鈣離子的含量。在實驗操作過程中發(fā)現(xiàn)，原子吸收法測定鈣離子含量前處理復雜，耗費檢驗時間，測定過程中乙炔氣體的燃燒有潛在危險性，且有可能造成結果誤差大。而試劑盒法所采用的試劑盒價格較貴且效期短，對于不能集中時間進行測定的樣品實驗材料損耗較大。有研究[15-16]表明，離子色譜法不僅操作簡便、快捷高效，還能同時測定鎂、鈣、鈉、鉀等多種金屬離子。本文建立的離子色譜法測定人凝血因子Ⅷ中鈣離子含量，操作簡便、準確度高、樣品消耗量少，可在線自動連續(xù)檢測，極大地縮短了檢驗時限。此方法可進一步提高對本產(chǎn)品的質量控制，為該品種全面質量控制提供科學依據(jù)。