鄭志忠,鄭溢,明艷林1,△（1.福建省亞熱帶植物研究所,福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室,福建 廈門 361006;.廈門華僑亞熱帶植物引種園,廈門市引種檢疫與植物源產(chǎn)物重點實驗室,福建 廈門 36100;3.福州理工學(xué)院,生命科學(xué)與健康學(xué)院,福建 福州 350506）

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum）也被譽為“南方人參”[1]，是一種可用于保健食品的中藥（見圖1）。絞股藍(lán)屬于葫蘆科、絞股藍(lán)屬的草本攀援植物，因其在醫(yī)藥和健康領(lǐng)域具有多種功效而被廣泛研究應(yīng)用。其主要分布于東南亞等地以及我國秦嶺及長江以南地區(qū)，大多生長在海拔300-3200米的山谷密林等地方。研究[2]表明，絞股藍(lán)具有多種藥理作用，包括抗癌防癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、減少外界有害物質(zhì)對機體器官造成的損害、活化人體正常細(xì)胞、解疲勞、健脾胃、延緩衰老等。此外，絞股藍(lán)的品種歷史悠久，市場開發(fā)潛力巨大，產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景廣闊。根據(jù)絞股藍(lán)的諸多功效、品種歷史，市場開發(fā)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展等情況，絞股藍(lán)于2016年成功入選“福九味”行業(yè)品牌閩產(chǎn)藥材品種名單，進(jìn)一步確立了其在中藥材市場中的地位[3]。

圖1 絞股藍(lán)

絞股藍(lán)皂苷（Gypenoside，Gyp）是絞股藍(lán)的主要活性成分，因其骨架結(jié)構(gòu)是達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜結(jié)構(gòu)，與人參皂苷的骨架結(jié)構(gòu)一致而成為多年來的研究熱點。研究[2]表明，絞股藍(lán)皂苷在抗衰老、抗腫瘤、降低血糖、降血脂、保護(hù)肝臟及神經(jīng)保護(hù)等多方面具有生物活性。絞股藍(lán)皂苷的C-3、C-6和C-20位置可以與不同的糖基進(jìn)行鍵合形成苷類化合物。通過酸、堿、酶、微生物等方法，在加熱、微波條件下會使側(cè)鏈的糖基與苷元發(fā)生水解反應(yīng)，失去部分或全部糖基，降解成相應(yīng)的次級苷、苷元[4]。本課題組前期以福建絞股藍(lán)為材料，利用灰綠曲霉微生物轉(zhuǎn)化絞股藍(lán)皂苷[5]，以及利用柚皮苷酶進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化絞股藍(lán)皂苷XLVI，生成新的絞股藍(lán)皂苷TN-1[6]。前期結(jié)果表明，在微生物體內(nèi)或柚皮苷酶作用下，絞股藍(lán)皂苷發(fā)生一系列代謝反應(yīng)，導(dǎo)致絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈糖基分子減少，進(jìn)而生物活性升高[7]。

為了解決灰綠曲霉等微生物發(fā)酵生產(chǎn)成本較高、工藝復(fù)雜以及柚皮苷酶易失活等問題，本研究采用酸水解技術(shù)來水解絞股藍(lán)皂苷XLVI，以期獲得絞股藍(lán)皂苷TN-1，提高其抗肝癌活性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，酸水解技術(shù)具有更高效和更徹底的水解效果，同時避免了使用微生物或酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而降低了生產(chǎn)成本和工藝復(fù)雜性。

1 材料

1.1實驗材料 絞股藍(lán)皂苷XLVI由本實驗室前期自提；絞股藍(lán)購自福建南靖地區(qū)；人參皂苷對照品IH901由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心提供（純度大于98%）；人肝癌細(xì)胞（Bel7402、SMMC7721）、人正常肝細(xì)胞（Chang liver）均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1.2儀器與試劑 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA Corporation）；液相色譜儀（Agilent 1200）；核磁共振儀（AV2400 Bruker BioSpin）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自生工生物工程（上海）有限公司；乙腈購自Merck公司，其他甲醇、鹽酸、甲酸、硫酸、乙酸、酒石酸、丙二酸、正丁醇、乙酸乙酯等均為國產(chǎn)試劑。

2 方法

2.1絞股藍(lán)皂苷XLVI的酸水解 取1mg絞股藍(lán)皂苷XLVI溶于0.05 mL甲醇中，分別加入到0.25mL濃度為5%（m/v或v/v）的酸溶液（鹽酸、甲酸、硫酸、乙酸、酒石酸、丙二酸），于60℃水浴鍋中水解0.5h。反應(yīng)結(jié)束時用0.2mL的2mol/L NaOH溶液中和終止酸水解，最后用0.5mL正丁醇進(jìn)行萃取，正丁醇層用來薄層層析，展開劑為正丁醇∶乙酸乙酯∶水=4∶1∶5，并用5%硫酸乙醇加熱顯色，并計算Rf值。Rf值=溶質(zhì)遷移距離/展開劑遷移距離。

2.2Sephadex LH-20柱層析 取100mg絞股藍(lán)皂苷XLVI通過10%鹽酸，70℃，1h水解制備絞股藍(lán)XLVI的酸水解產(chǎn)物，NaOH溶液中和后的溶液用正丁醇分三次萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。取水解樣品進(jìn)行葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析，依次加入100mL甲醇-水溶液（40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%）進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液約15mL/管，從1開始編號。

2.3核磁共振鑒定結(jié)構(gòu) 把待鑒定樣品溶解于1mL的氘代甲醇，密封后于自然資源部第三海洋研究所的核磁共振儀中進(jìn)行測試。測試項目包括1H-NMR和13C-NMR。

2.4MTT法檢測細(xì)胞毒活性 將對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后計數(shù)，按照每孔2500個細(xì)胞接種入96孔板中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每孔中加入含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基200μL（絞股藍(lán)皂苷XLVI為0μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL；絞股藍(lán)皂苷TN-1為0μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，80μg/mL，100μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)?？瞻捉M、加藥組和對照組均設(shè)3組重復(fù)，見表1。

表1 MTT法檢測細(xì)胞毒活性分組情況

經(jīng)過藥物處理48h后，每孔加20μL的MTT（5mg/mL）后置于37℃溫育4h，終止培養(yǎng)，吸棄上清并加入150μL的DMSO使結(jié)晶物充分溶解，用微孔板快速振蕩器振蕩10min，最后用酶標(biāo)儀測定570nm波長下的光吸收值A(chǔ)。細(xì)胞生長抑制率=（A對照組-A加藥組）÷（A對照組-A空白組）×100%。

3 結(jié)果與討論

3.1酸水解充分水解絞股藍(lán)皂苷XLVI 將不同酸水解產(chǎn)物進(jìn)行TLC薄層層析后，再用5%硫酸乙醇加熱顯色，最后通過Gel-PRO ANALYZER凝膠定量分析軟件對薄層層析板進(jìn)行灰度掃描；結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同酸（鹽酸、甲酸、硫酸、乙酸、酒石酸、丙二酸）的處理后，鹽酸處理后的絞股藍(lán)皂苷XLVI殘留量比例最少，僅為7.58%，如表2和圖2所示，鹽酸和硫酸的水解效果較佳?？紤]到濃硫酸的危險性，后續(xù)實驗將采用鹽酸進(jìn)行。

圖2 絞股藍(lán)皂苷XLVI不同酸水解產(chǎn)物薄層層析。1：鹽酸；2：甲酸；3：硫酸；4：乙酸；5：酒石酸；6：丙二酸

表2 不同酸對絞股藍(lán)皂苷酸水解的影響

3.2酸水解產(chǎn)物的分離純化 通過TLC薄層層析分析Sephadex LH-20柱層析的洗脫液，再根據(jù)TLC圖譜的顯色特征和Rf值合并洗脫液。結(jié)果如圖3所示，絞股藍(lán)皂苷XLVI經(jīng)過鹽酸的充分水解后，有3個產(chǎn)物：化合物A（編號8-13，Rf≈0.45）、化合物B（編號16-21，Rf≈0.70）、化合物C（編號24-29，Rf≈0.85）。其中化合物B的Rf值與絞股藍(lán)皂苷TN-1基本相同，因此可以推測化合物B可能就是絞股藍(lán)皂苷TN-1，并進(jìn)一步通過核磁共振鑒定化合物結(jié)構(gòu)。

圖3 絞股藍(lán)皂苷XLVI水解產(chǎn)物薄層層析。1：鹽酸水解產(chǎn)物；2：絞股藍(lán)皂苷XLVI；3：標(biāo)準(zhǔn)品

3.3化合物B的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物B：白色無定形粉末，易溶于甲醇；經(jīng)查閱文獻(xiàn)，該化合物碳譜數(shù)據(jù)和氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[6]，1H NMR（MeOH-d4）：δH 4.62（1H，d，J=7.6，Glu H-1'），3.11（1H，t，J=8.2，Glu H-2'），3.34-3.36（2H，m，overlapped Glu H-3'，4'），3.21（1H，m，Glu H-5'），3.79（1H，dd，J=2.2/12.3，Glu H-6'a），3.62（1H，dd，J=5.1/12.3，Glu H-6'b）；13C NMR （MeOH-d4）：96.9d（Glu C-1'），74.0（Glu C-2'），76.8（Glu C-3'），69.8（Glu C-4'），76.5（Glu C-5'），61.1（Glu C-6'）。故確定該化合物為：絞股藍(lán)皂苷TN-1，如圖4所示。

圖4 絞股藍(lán)皂苷XLVI和絞股藍(lán)皂苷TN-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)

3.4絞股藍(lán)皂苷的細(xì)胞毒作用 通過MTT法測定絞股藍(lán)皂苷XLVI和絞股藍(lán)皂苷TN-1對人正常肝細(xì)胞Chang liver、人肝癌細(xì)胞SMMC7721、人肝癌細(xì)胞Bel7402的細(xì)胞毒作用，如表3所示。兩種絞股藍(lán)皂苷對體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞均有一定的抑制作用，但抑制程度并不相同。絞股藍(lán)皂苷XLVI對細(xì)胞抑制作用相對較弱；而絞股藍(lán)皂苷TN-1對肝癌細(xì)胞的抑制作用最大，半抑制濃度IC50分別為（36.65±12.31）μg/mL、（53.42±5.83）μg/mL，且對正常肝細(xì)胞Chang liver的細(xì)胞毒作用也相應(yīng)增強，達(dá)到（47.7±11.59）μg/mL。

3.5肝癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 根據(jù)細(xì)胞毒結(jié)果進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。如圖5所示，對照組細(xì)胞飽滿舒展，貼壁成片生長。絞股藍(lán)皂苷XLVI和絞股藍(lán)皂苷TN-1對Bel7402都具有明顯的細(xì)胞毒作用，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，能夠使細(xì)胞逐漸變圓，體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，尤其是絞股藍(lán)皂苷TN-1的細(xì)胞毒作用更為顯著。

圖5 兩種絞股藍(lán)皂苷對Bel7402細(xì)胞作用的形態(tài)觀察

4 結(jié)論

自20世紀(jì)90年代以來，陸續(xù)有學(xué)者對絞股藍(lán)皂苷進(jìn)行酸水解研究，但主要是對絞股藍(lán)總皂苷的酸水解進(jìn)行報道[8-9]，較少對單一絞股藍(lán)皂苷的酸水解產(chǎn)物進(jìn)行報道。鹽酸水解模擬胃部酸性環(huán)境，可以脫去絞股藍(lán)皂苷C-3、C-20位連接的糖基。脫去側(cè)鏈糖基后的絞股藍(lán)皂苷，分子量更小，也更容易被人體吸收[10]。本研究通過鹽酸水解絞股藍(lán)皂苷XLVI生成化合物A、化合物B和化合物C3個產(chǎn)物，可能分別對應(yīng)著脫去3、2、1個側(cè)鏈糖基后的絞股藍(lán)皂苷。其中，化合物B經(jīng)過鑒定，正好是脫去C-3上的2個糖基后的絞股藍(lán)皂苷TN-1。

MTT法測定細(xì)胞毒活性和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果均表明，絞股藍(lán)皂苷XLVI經(jīng)過鹽酸水解后的產(chǎn)物，絞股藍(lán)皂苷TN-1對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用有著顯著的增強。因此，酸水解能夠提高絞股藍(lán)皂苷抗肝癌活性的研究，為絞股藍(lán)皂苷作為抗肝癌新藥的開發(fā)利用提供了新的思路。但是本文中的酸水解條件比人體胃部酸性環(huán)境要嚴(yán)苛很多，單純倚靠胃部消化無法達(dá)到本文中的酸水解效果；同時化合物A和化合物C的結(jié)構(gòu)和生物活性也有待進(jìn)一步研究。