趙立波 陳家鈴 陶春霖
再生障礙性貧血(Aplastic amemia,AA),又稱血虛證,為中醫(yī)臨床常見癥候,是一種以造血功能衰竭為特征的疾病,其發(fā)病機制主要與骨髓造血干細胞損傷、造血微環(huán)境損傷以及免疫性造血抑制等機制相關。目前,治療AA的主要藥物如環(huán)孢素(cyclosporine A,CsA),存在使用后反應率較低且復發(fā)率較高的缺點。本研究以西澳菲斯特農(nóng)場赤桉樹蜂蜜為研究對象,通過建立小鼠血虛模型,探究服用不同劑量的TA10+FFJH以及TA30+FFJH對小鼠血虛癥狀的影響。
一、實驗材料
1.實驗藥品與試劑。西澳菲斯特農(nóng)場赤桉樹蜂蜜(Fewsters Farm jarrah honey,F(xiàn)FJH),洋妝源(上海)網(wǎng)絡科技有限公司;乙酰苯肼、淋巴細胞分離液,美國SIGMA公司;環(huán)磷酰胺,上海華聯(lián)制藥有限公司;促紅細胞生成素(EPO)ELASA試劑盒,美國R&D Systems公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。
2.實驗動物。選擇BALB/c小鼠80只,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。雌雄各半,年齡為8-12周,體重控制在18-22g。飼養(yǎng)溫度為(23±1)℃,濕度控制在40%-60%,24h光暗循環(huán),通風良好。飼養(yǎng)期間保證小鼠自由飲水、飲食。
二、實驗方法
1.模型建立。(1)實驗分組。選取BALB/c小鼠80只,在適應性喂養(yǎng)1周后,將其分為以下8組:①正常對照組;②血虛模型組;③25%-TA10+FFJH組;④50%-TA10+FFJH組;⑤75%-TA10+FFJH組;⑥25%-TA30+FFJH組;⑦50%-TA30+FFJH組;⑧75%-TA30+FFJH組。每組小鼠各10只。(2)實驗流程。按照乙酰苯肼、X射線、環(huán)磷酰胺聯(lián)合應用的方法,建立再生障礙性貧血小鼠模型。將不同劑量的蜂蜜溶解至等量生理鹽水中,從第7d開始,以每天1次的頻率按各組劑量對小鼠進行灌胃,同時對空白對照組以及血虛模型組的小鼠灌胃等體積的生理鹽水。實驗周期為45d,45d后頸椎脫臼處死小鼠,采樣進行檢測。
2.各組小鼠一般行為學觀察。經(jīng)上述步驟處理45d后,對小鼠的運動靈活度、反應敏捷度、毛發(fā)光澤度、脫毛情況及體重變化情況進行觀察統(tǒng)計。
3.外周血檢測。(1)細胞計數(shù)。各實驗組在第45d對各組小鼠進行稱重,經(jīng)眼眶取血,測定外周血的血紅蛋白含量、紅細胞、白細胞及血小板數(shù);在顯微鏡下觀察外周血涂片,并進行細胞計數(shù)。(2)EPO濃度測定。EPO是一種重要的造血調控因子,血液中的EPO水平能夠反映機體生成紅細胞的能力。參考文獻中的方法,對血液進行樣品處理,使用試劑盒對血液中的EPO含量進行測定,根據(jù)標準曲線計算得出樣本的EPO濃度(pg/mL)。
4.骨髓有核細胞(BMCs)計數(shù)。實驗參考陳姍姍等的方法,頸椎脫臼處死小鼠,取右側股骨,用PBS緩沖液反復沖洗,取骨髓細胞懸液,配平至相同體積,取0.2mL細胞懸液裂解紅細胞后,以自動細胞計數(shù)儀計數(shù)BMCs數(shù)量。
5.統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)至少重復3次,結果以Means±SEM表示。采用Origin8.5和SPSS分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理分析,統(tǒng)計結果P<0.05認為有顯著性差異。
三、結果分析
1.血虛模型小鼠一般行為學觀察。與正常對照組相比,血虛模型組小鼠陸續(xù)出現(xiàn)皮毛蓬亂、光澤度降低以及部分脫毛現(xiàn)象,且隨著實驗進程的發(fā)展,癥狀逐漸加重。同時,小鼠還出現(xiàn)精神不佳、活動減少、體重下降的癥狀。
對比服用各FFJH劑量組與血虛模型組發(fā)現(xiàn),服用FFJH組小鼠的皮毛光澤度下降及脫毛的程度均有所減輕,精神狀態(tài)也有明顯提升。各組小鼠的體重平均值如圖1所示,通過對比可以看出,灌胃FFJH各組小鼠的平均體重均高于血虛模型組,且呈劑量對應關系,說明FFJH對血虛引起的小鼠體重下降有抑制作用。同時,通過在同劑量添加下體重值的對比可以觀察到,TA30+FFJH較TA10+FFJH的效果更佳。
圖1:FFJH對小鼠體重的影響()
注:與空白組相比,#代表與空白對照組相比差異顯著,P<0.05;*表示與模型組相比差異顯著。
2.FFJH對血虛模型小鼠外周血三系水平的影響。表1為不同F(xiàn)FJH劑量組、空白對照組以及血虛模型組小鼠的外周血中血紅蛋白(Hb)、紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)以及血小板(PLT)水平情況。由表1可以看出,在血虛模型條件下,小鼠血常規(guī)中的各項指標均顯著降低(P<0.01),即血虛模型組小鼠的血象三系水平明顯下降。服用各FFJH劑量組與血虛模型組相比,小鼠的外周血三系水平均有所提升,且呈劑量對應關系,說明FFJH對小鼠的再生障礙性貧血有顯著改善效果(P<0.01)。
3.FFJH對血虛模型小鼠EPO濃度的影響測定。研究表明,EPO具有抗凋亡以及促進血管生成的作用,其濃度水平能直觀反映骨髓紅系造血功能障礙的程度,圖2為不同F(xiàn)FJH劑量組、空白對照組以及血虛模型組小鼠的EPO濃度測定結果。在血虛模型條件下,小鼠血清中的EPO濃度顯著提高(P<0.01),而各FFJH劑量組與血虛模型組相比,EPO含量均顯著降低,并呈劑量對應關系(P<0.01)。實驗結果說明,F(xiàn)FJH對再生障礙性貧血小鼠外周血中各種血細胞的形成有促進作用,而且通過組間數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn),在同劑量添加條件下,TA30+FFJH組較TA10+FFJH組的EPO濃度下降更明顯,說明TA30+FFJH降低EPO濃度的作用比TA10+FFJH更好。
圖2:FFJH對小鼠血液中EPO水平的影響()
注:與空白組比較,##代表與空白對照組相比差異極顯著,P<0.01;**表示與模型組相比差異極顯著,P<0.01。
4.FFJH對小鼠BMCs水平的影響。圖3為不同F(xiàn)FJH劑量組、空白對照組以及血虛模型組的BMCs水平。與空白組相比,血虛模型組小鼠的造血干細胞數(shù)量顯著下降(P<0.01),而各FFJH劑量組的BMCs水平明顯高于血虛模型組,并呈劑量對應關系(P<0.05),推測FFJH有促進造血干細胞增殖的效果,可以抑制再生障礙性貧血小鼠有核細胞減少,進而對骨髓的造血機能產(chǎn)生明顯的促進作用。通過組間數(shù)據(jù)對比可以發(fā)現(xiàn),在同劑量添加條件下,TA30+FFJH組較TA10+FFJH組促進造血干細胞增殖的效果更明顯,說明TA30+FFJH促進造血干細胞增殖的作用比TA10+FFJH更好。
圖3:FFJH對小鼠BMCs水平的影響()
注:與空白組相比,##代表與空白對照組相比差異極顯著,P<0.01;**表示與模型組相比差異極顯著,P<0.01。
綜上所述,本實驗通過建立小鼠血虛模型,觀察各組小鼠體重變化、外周血常規(guī)、EPO濃度以及骨髓單個核細胞數(shù)的差異,發(fā)現(xiàn)FFJH可以改善血虛模型小鼠再生障礙性貧血導致的精神不佳、毛發(fā)光澤受損、體重下降癥狀。服用FFJH后,模型小鼠血象三系水平以及骨髓細胞水平的下降速度均明顯減緩(P<0.01),EPO水平波動明顯減小,并呈劑量對應關系(P<0.01),說明FFJH能有效緩解并修復血虛模型處理小鼠的骨髓造血微環(huán)境受損。不過,本研究也存在一定的不足之處,雖然證明了FFJH可以為機體補充相關營養(yǎng)素以減輕小鼠的血虛癥狀,但未對調節(jié)血虛癥狀的具體機制進行進一步研究。
作者簡介:趙立波(1987-),男,漢族,河南信陽人,工程師,碩士研究生,研究方向為功能性食品。
陳家鈴(1993-),女,漢族,貴州安順人,大學本科,研究方向為原料包裹及改性。
*通信作者:陶春霖(1986-),男,漢族,天津人,大學本科,研究方向為原料包裹及改性。