吳星星 洪海波 甘志承 李瑞寧 黃先忠

（安徽科技學院農(nóng)學院 作物生物技術研究中心，滁州 233100）

在真核生物中，MCM1?AGAMOUS?DEFICIENS?SRF（MADS?box）是植物生理和發(fā)育過程中的一類轉錄因子［1］，具有保守性很強的DNA 結合結構域［2］。MADS?box 不僅在植物生殖發(fā)育各個方面起著關鍵性調控，而且在控制開花時間、花序結構、花器官身份確定和種子發(fā)育中具有重要作用［3］。開花是建立作物產(chǎn)量的一個脆弱但關鍵的階段，適時適機開花不僅影響株型結構，對獲得最佳產(chǎn)量至關重要，開花生物學機制研究一直是重要的研究課題。

MADS?box 包 括I 型 和II 型 兩 種 類 型，II 型MADS?box 主 要 參 與 花 器 官 發(fā) 育［4］。PISTILLATA（PI）既屬于典型Type II 型MADS?box 基因亞家族中的一類，也是ABC（D）E 模型中的B 類基因［5］。Coen 等［6］最早提出花發(fā)育ABC 模型，后來又發(fā)展出ABCDE 模型［2］，其中，A 類基因是形成萼片所必需的，A+B+E 類基因決定花瓣的發(fā)育，B+C+E類基因決定雄蕊的發(fā)育，C+E 類基因決定心皮的形成，D 類基因與胚珠發(fā)育有密切聯(lián)系，而E 類基因在所有過程中都起作用［7-9］。在模式植物擬南芥中，APETALA1（AP1）是典型的A 類基因；而屬于B類基因的是AP3 和PI；AGAMOUS（AG）是一種具有C 類功能的代表性基因；SEPALATA（SEP）則屬于E 類基因；D 類基因包括SEEDSTICK（STK）和SHATTERPROOF1（SHP1）［10］。PI 是調控植物花器官發(fā)育的B 類基因，是花瓣和雄蕊形成的關鍵因子。高表達的擬南芥PI，通過控制AP1 的表達來控制花的發(fā)育［11-12］。不同植物中，PI 功能并不完全保守，而是具有一定差異［13］。在漫長的演化過程中，植物PI 同源基因在經(jīng)歷了多次基因復增事件后，產(chǎn)生了許多亞功能化或者新功能化的基因，對于調控植物花器官多樣性具有重大意義［14］。

辣椒（Capsicum annuum L.）為茄科（Solanaceae）辣椒屬（Capsicum）一年或有限多年生草本植物，為重要的經(jīng)濟和香料作物，在我國南北均有大量傳播和種植［15］。由于辣椒獨特的風味和辣椒素，使辣椒在全世界食品和醫(yī)藥上不可缺少［16］。辣椒是雌雄同株自花授粉植物，其產(chǎn)量性狀與辣椒開花時間和開花數(shù)量息息相關［17］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［18］、人參（Panax ginsengy）［19］、萼脊蘭（Sedirea japonica）［20］、 大 蒜（Allium sativum）［21］、墨 蘭（Cymbidium sinense）［22］、 牡 丹（Paeonia suffruticosa）［23］等植物中的PI 克隆和功能分析都有報道，但關于辣椒PI 同源基因的序列、表達特征和功能未見報道。Gan 等［24］對辣椒MADS?box 基因家族的全基因組鑒定、進化及表達特征進行了分析，鑒定了一個辣椒PI 同源基因，但未見功能報道。

本研究利用RT?PCR 技術從一年生辣椒中克隆CaPI；利用生物信息學的方法分析序列特征，分析辣椒CaPI 蛋白理化性質和預測蛋白二級三級結構；利用實時熒光定量PCR（RT?qPCR）分析CaPI 基因在不同組織和不同花器官組織的表達特征；通過構建35S:CaPI 過表達載體對擬南芥進行遺傳轉化，對轉基因擬南芥進行表型分析，從而初步探索CaPI 基因功能。本研究為將來深入探索辣椒PI?like 同源基因的功能及其分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為一年生辣椒（Capsicum annuum）自交系（編號G7），由安徽科技學院辣椒遺傳育種團隊提供，無限生長型、花單生、花期適中。將辣椒播種在育苗盤中育苗，然后移栽至溫室（白天25℃ 16 h/黑夜18℃ 8 h，濕度60%）。采集生長6 周齡植株的根、莖、葉組織和生長3 個月盛開的花器官組織，包括雌雄蕊、花瓣、花萼及長度3 cm 的果實，液氮速凍后，?80℃保存，3 次生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 系統(tǒng)進化樹構建 從TAIR（https://www.arabidopsis.org/）下載擬南芥AtPI（AT5G20240）蛋白序列，與已鑒定的辣椒MADS?box 基因家族進行BLAST 比對［24］，鑒定出CaPI?like 基因（CaMADS61,Caz06g18830.1）。從辣椒數(shù)據(jù)庫（http://ted.bti.cornell.edu/cgi?bin/pepper/index）下 載CaPI 蛋 白 序 列。從Ensembl Plants（http://plants.ensembl.org/index.html）下 載 茄 子（Solanum melongena）、 番 茄（Solanum lycopersicum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、矮牽牛（Calibrachoa）、水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）等植物的PI?like 蛋白序列。利用MEAG 11 軟件中的Clustal W［25］功能進行同源蛋白多重序列比對，利用MEGA 11 的Neighbor?joining 功能構建系統(tǒng)進化樹，參數(shù)均為默認［26］。

1.2.2 CaPI 蛋白理化性質分析 使用ProtParam 在線網(wǎng)站（https://web.expasy.org/protparam/）分析CaPI蛋白質的理化性質，用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）在線網(wǎng)站進行蛋白質的疏水性行分析；利用NetPhos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）對PI 蛋白進行磷酸化位點預測；利用SOPMA（https://npsa?prabi.ibcp.fr/cgi?bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html）對蛋白二級結構進行預測；使用Phyre2 在線網(wǎng)站（http://psort.hgc.jp/）分析蛋白質的三級結構。

1.2.3 辣椒總RNA 提取和cDNA 第一鏈的合成 使用TRIzol（Invitrogen, 美國）試劑，參照牛西強等［27］方法提取辣椒不同組織的總RNA。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質量，利用Nano Drop 2000 超微量分光光度計檢測RNA 濃度與質量。使用MonScriptTMRTIII AII?in?One Mix with dsDNase（Monad，武漢）試劑盒合成cDNA 第一鏈。

1.2.4 RT?qPCR 根據(jù)辣椒CaPI 編碼區(qū)（CDS）序列設計RT?qPCR 引物（表1），以CaUBI3 作為內(nèi)參基因［28］，反應體系為5 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京）、0.5 μL 上下游引物、1 μL cDNA，ddH2O 補至10 μL。反應程序為95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)，溶解曲線95℃ 15 s；60℃ 60 s，95℃ 15 s，設置3個生物學重復。采用2-ΔCT計算［29］基因的相對表達量。利用Excel 2019 軟件計算基因相對表達水平，使用Graph Pad Prism 8.0 軟件作圖和進行統(tǒng)計學分析。

表1 本研究使用到的引物Table 1 Primer information used in this study

1.2.5 CaPI 的克隆及過表達載體的構建 采用RT?PCR 的方法克隆CaPI 的開放閱讀框序列，反應體系為10 μL 2×Phanta Max Master Mix、0.5 μL 上下游引物、2 μL 花組織cDNA，ddH2O 補至20 μL。反應程序為95℃ 3 min；95℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 15 s，35 個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，與pEASY 載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，37℃過夜培養(yǎng)。提取陽性克隆的質粒，酶切鑒定，送南京通用生物有限公司滁州分公司測序。

測序正確的pEASY?CaPI 質粒，經(jīng)Kpn I 和Xba I限制性內(nèi)切酶酶切后，與pCAMBIA2300?35S 載體連接，構建35S:CaPI 植物過量表達載體，轉化至農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)，用于擬南芥遺傳轉化。

1.2.6 擬南芥的遺傳轉化及表型分析 將野生型擬南芥（Col?0）種子用75%乙醇表面消毒10 min，無水乙醇清洗3 min。均勻撒播在1/2 MS 培養(yǎng)基中，4℃黑暗處理3 d，轉至22℃光照培養(yǎng)箱（16 h 光照/8 h 黑暗）培養(yǎng)。生長7 d 后，將擬南芥幼苗移栽到含有蛭石∶營養(yǎng)土（體積比1∶1）的盆缽中，長日照（16 h 光照/8 h 黑暗）光照培養(yǎng)間培養(yǎng)，待生長至開花前期，采用floral?dipping［30］方法將含有35S:CaPI農(nóng)桿菌GV3101 菌液侵染到Col?0 花苞上，在整個花期重復3 次侵染，待植株成熟后收獲T0擬南芥種子。經(jīng)卡那霉素和PCR 篩選，獲得35S:CaPI 轉基因擬南芥植株，經(jīng)多代繁殖后，獲得純合轉基因植株。待植株開花時，統(tǒng)計不同時期的野生型擬南芥和轉基因擬南芥植株的蓮座葉數(shù)、分枝數(shù)和開花天數(shù)，使用Graph Pad Prism 8.0 軟件作圖并進行統(tǒng)計學分析。收集開花時野生型和轉基因擬南芥植株的蓮座葉，提取RNA 并反轉錄成cDNA，利用RT?qPCR 分析該基因在植株中的表達量。

2 結果

2.1 CaPI蛋白的理化性質

CaPI 蛋白的分子式為C1075H1755N329O333S16，由215 個氨基酸組成，分子質量為25.13 kD，等電點為8.74，脂肪系數(shù)為74.42，不穩(wěn)定蛋白系數(shù)為61.02。CaPI 蛋白親水性指數(shù)為?0.894，預測為親水蛋白。在線預測結果表明，CaPI 蛋白沒有跨膜結構，亞細胞定位在細胞核。一級結構表明谷氨酸（Glu 10.7%）、賴氨酸（Lys 8.4%）、亮氨酸（Leu, 7.9%）、精氨酸（Arg 7.9%）、絲氨酸（Ser 7.0%）的含量較多，而色氨酸（Trp 0.5%）、苯丙氨酸（Phe 0.9%）、半胱氨酸（Cys 0.9%）含量較少。帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）有35 個，帶負電荷的氨基酸（Asp+Glu）有32 個。磷酸化分析結果（圖1）顯示，該氨基酸序列中Ser 位點可能有15 個被磷酸化，Thr 位點5個被磷酸化，Tyr 位點7 個被磷酸化。

圖1 辣椒CaPI 蛋白磷酸化位點分析Fig.1 Analysis of phosphorylation sites of CaPI protein in C.annuum L.

2.2 CaPI蛋白的二級結構和三級結構分析

通過SOPMA 預測CaPI 二級結構，主要由α 螺旋組成（圖2?A），有128 個α-螺旋（59.53%）、26個延伸鏈（12.09%）、48 個無規(guī)則卷曲（22.33%）及13 個β-轉角（6.05%）。進一步使用Phyre2 預測CaPI 三級結構（圖2?B），表明具有豐富的α 螺旋，與二級結構預測結果一致。此外，辣椒CaPI 與擬南芥AtPI 蛋白三級結構比較，都具有相同的α 螺旋。

圖2 CaPI 蛋白結構分析Fig.2 Structural analysis of CaPI protein

2.3 不同物種PI基因系統(tǒng)進化樹分析

為了研究辣椒CaPI 基因與其他植物中PI 基因的進化關系，進一步利用辣椒、茄子、番茄、馬鈴薯、矮牽牛、擬南芥、水稻、小麥中的17 個PI?like 蛋白的氨基酸序列進行比對和系統(tǒng)進化樹分析。結果（圖3）發(fā)現(xiàn)，所有蛋白質都具有N 端“MGRGKIEIKRIEN”的氨基酸保守基序，說明PI 蛋白在其他物種中都具有較高的保守性［31］。系統(tǒng)進化樹分析表明（圖4），同為茄科作物的馬鈴薯（PGSC0003DMG401007392）、番茄（Solyc06g0557.4.1）和矮牽牛（Peaxi162Scf00 91g00074.1）的PI 蛋白與CaPI 蛋白相似性較高；與水稻和小麥的PI 蛋白進化關系較遠。

圖3 植物PI 類蛋白氨基酸序列多重序列比對Fig.3 Multiple amino-acid sequence alignments of the plant PI-like proteins

圖4 辣椒CaPI 蛋白和其他植物的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the CaPI proteins in C.annuum L.and other plant species

2.4 CaPI在辣椒不同組織中的表達分析

運用RT?qPCR 分析CaPI 在根、莖、葉、花、果實，以及花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊中的表達情況。CaPI在辣椒花中高表達，但在其他組織中均不表達（圖5?A）；CaPI 在花萼中表達量最高，其次是花瓣，在雄蕊中有較高的表達，但在雌蕊中幾乎不表達（圖5?B）。暗示CaPI 在辣椒花器官的發(fā)育中起著重要的功能。

圖5 RT-qPCR 分析CaPI 的組織表達特征Fig.5 Tissue expression pattern of the CaPI gene using RT-qPCR

2.5 擬南芥中過量表達CaPI的功能分析

為了探索CaPI 的功能，克隆CaPI 的648 bp 的ORF，測序證實基因ORF 長648 bp，編碼215 個氨基酸。進一步構建植物過量表達載體35S:CaPI，利用浸花法轉化到擬南芥Col?0 中，經(jīng)基因組擴增及RT?qPCR 鑒定證實獲得純合的轉基因植株。

當野生型和轉基因植株開花時進行蓮座葉數(shù)、開花天數(shù)、分枝數(shù)等表型統(tǒng)計（圖6?A）。結果發(fā)現(xiàn)，長日照條件下，35S:CaPI 轉基因植株同Col?0 的蓮座葉數(shù)目（圖6?B）和開花時間（圖6?C）沒有差異，表明過量表達CaPI 不影響開花時間。但35S:CaPI轉基因植株的分枝數(shù)量明顯均多于Col?0，并且#2中的分枝數(shù)量明顯多于#1（圖6?A, D）。RT?qPCR分析也證實CaPI 在轉基因株系#1 和#2 中高表達，并且在#2 中的表達量明顯高于#1（圖6?E），表明分枝數(shù)量與表達量正相關，說明該基因在分枝發(fā)育過程中起十分重要的作用。此外，花的形態(tài)比較（圖7）發(fā)現(xiàn)，與野生型（Col?0）對照相比，35S:CaPI轉基因擬南芥植株并未發(fā)生變化，說明CaPI 在擬南芥中過量表達不影響其花部組織的形態(tài)結構。

圖6 35S:CaPI 轉基因擬南芥的表型分析Fig.6 Phenotype survey of the 35S:CaPI transgenic plants in Arabidopsis thaliana

圖7 擬南芥野生型（Col-0）與35S:CaPI 轉基因植株花形態(tài)對比Fig.7 Comparison of flower morphologies between the wild-type（Col-0）and 35S:CaPI transgenic Arabidopsis plants

3 討論

MADS?box 作為植物最大轉錄因子家族之一，名稱來自釀酒酵母轉錄因子MCM1、擬南芥花同源異型基因AGAMOUS、金魚草花同源異型基因DEFICIENS 和人血清應答因子SRF 這4 種蛋白的首字母［2,30］。目前，43%-81%馴化基因由轉錄因子編碼［3］，MADS?box 是調控植物生長發(fā)育最重要的轉錄因子之一，從種子發(fā)芽、營養(yǎng)發(fā)育到花器官發(fā)育階段都起著重要作用［32］。PI 基因作為II 型MADS?box 家族中的一員，與A 類和C 類基因共同調控花瓣和雄蕊的形成，其中，包括GLOBOSA（GLO）、DEFICIENS（DEF）、AP3 等花發(fā)育調控基因，并在擬南芥中證明PI 與AP3 基因相互正調控［33］。最早在水稻中鑒定出兩類PI 基因OsMADS2 和OsMADS4，其中OsMADS2 表達隨著花的成熟而快速增加，而OsMADS4 的表達從花發(fā)育早期就處于較高的水平［34-35］。 玉 米 中 已 鑒 定 出Zmm16、Zmm18 和Zmm29，其中Zmm16 在營養(yǎng)器官中微弱表達［36］。

本研究從一年生辣椒花器官中克隆PI 全長cDNA 序列，命名為CaPI。CaPI 有完整的開放閱讀框，編碼215 個氨基酸。CaPI 蛋白與多種植物類PI 蛋白序列有較高的相似度，其中，與矮牽牛相似度最高達99.54%。PI 基因所編碼的蛋白質在不同物種中相對保守，都具有N 端“MGRGKIEIKRIEN”的氨基酸保守基序，因此，不同物種之間PI 同源基因具有相似的功能。系統(tǒng)進化樹表明CaPI 與馬鈴薯分為一支，該分支與同為茄科植物形成的分支較為接近，與單子葉植物水稻分支最遠，說明CaPI 與馬鈴薯PI 基因親緣關系最近。通過對CaPI 理化性質和蛋白結構進行分析發(fā)現(xiàn)，CaPI 屬于不穩(wěn)定蛋白，并預測為親水蛋白且沒有跨膜結構；一級結構和磷酸化分析表明，CaPI 蛋白可能被絲氨酸蛋白激酶、蘇氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶進行磷酸化修飾而被激活，從而調控二級響應基因的表達；二級結構分析發(fā)現(xiàn)，CaPI 主要以α-螺旋為主，這與其他MADS?box 基因相同［37］；三級結構顯示CaPI 屬于異質二聚體蛋白，暗示其與其他蛋白互作形成二聚體發(fā)揮功能，這一點在擬南芥中已有研究［38］。

CaPI 在辣椒不同組織表達特征存在差異，PI 同源基因在蕓薹屬油菜（Brassica napus）早期和晚期花蕾中表達差異明顯［39］；在甜瓜中，PI 基因通過調節(jié)下游靶基因的轉錄調控花性別發(fā)育，促進雄蕊的發(fā)育［40］。本研究中，CaPI 主要在花組織中特異表達，其中在花萼、花瓣、雄蕊中表達量最高，暗示CaPI在花器官的形成中起著十分重要的作用。為了研究CaPI 的功能，通過構建35S:CaPI 過表達載體，在野生型擬南芥（Col?0）中異源表達驗證其功能。結果顯示，長日照條件下轉基因植株同Col?0 相比表現(xiàn)出分枝數(shù)增多，但蓮座葉數(shù)目和開花時間與Col?0 相比并沒有明顯差異，說明CaPI 過量表達不影響開花時間；進一步分子水平檢測發(fā)現(xiàn)，轉基因植株CaPI的表達量相比Col?0 顯著上調，并且在#2 中的表達量明顯高于#1，暗示分枝數(shù)量與表達量正相關，說明CaPI 在分枝發(fā)育過程中起重要作用。對于這一結果推測是由于CaPI 的異源表達，使擬南芥某些分枝發(fā)育相關基因的表達發(fā)生變化，從而影響了分枝發(fā)育的調控網(wǎng)絡。有研究表明PI 基因不僅在花中發(fā)揮作用，也有可能在枝條和葉片發(fā)育中發(fā)揮作用［41］，但在辣椒中CaPI 調控分枝發(fā)育使分枝增多的分子機制、CaPI 轉錄因子的靶蛋白目前還未知。

總之，本研究從蛋白結構、氨基酸序列和系統(tǒng)進化分析，都表明CaPI 蛋白與其他物種中的蛋白序列較為相似?；蚪M織表達，證明CaPI 符合II 型MADS?box 基因的表達情況。擬南芥中過量表達的結果表明CaPI 具有促進分枝的功能。綜上所述，本研究為進一步深入研究CaPI 調控辣椒分枝發(fā)育的功能及其分子機制奠定了基礎，為辣椒的分子育種提供基因元件，豐富茄科植物PI 類基因功能機制。

4 結論

從一年生辣椒中克隆獲得CaPI 基因，ORF 長648 bp，編碼215 個氨基酸。CaPI 在花中的表達量最高，其中，在花萼、花瓣和雄蕊中有高表達。過量表達CaPI 擬南芥?zhèn)戎υ龆啵珻aPI 能夠促進分枝發(fā)育。