雷棋怡 徐楊 李鵬飛

（1.蘇州大學附屬第一醫(yī)院血液科，蘇州 215000；2.蘇州大學造血干細胞移植研究所，蘇州 215000）

腸黏膜屏障是腸道與外界環(huán)境接觸的第一道屏障，對減少病原體的侵襲、毒素的吸收有極其重要的作用。腸道屏障功能的減退或缺失往往伴隨著腸道菌群失調(diào)，甚至會導致腸道菌群的易位，致使菌群進入血液，進而引發(fā)多種腸道和血液疾病，如炎癥性腸病（inflammatory bowel disease, IBD）［1］、膿毒血癥（Sepsis）［2-3］、移植物抗宿主癥（graft ver?sus?host disease, GVHD）［4］等。因此，腸道菌群與腸道屏障之間的相互作用備受矚目。一方面，腸道菌群為宿主提供能量和營養(yǎng)，促進免疫系統(tǒng)的發(fā)育，幫助宿主抵御病原體。另一方面腸道細菌的代謝物如短鏈脂肪酸（short chain fatty acid, SCFAs）可以影響人類腸道上皮和黏膜屏障的完整性、免疫反應和微生物群的多樣性［5］。但是，能應用到臨床治療的菌群產(chǎn)物依然十分有限,需要進一步探索腸道菌群與宿主之間相互作用的機制。

作為腸道中最主要的共生菌類群之一，擬桿菌的多個成員被認為是腸道有益菌，在調(diào)節(jié)腸道炎癥反應和維持腸道屏障等方面起到重要作用［6-8］。值得注意的是，基因組測序結(jié)果表明，約50%的擬桿菌目細菌中都存在著六型分泌系統(tǒng)（T6SS）［9］。T6SS 是存在于革蘭氏陰性菌中的蛋白分泌系統(tǒng)，一般通過接觸依賴的方式將效應物注入到相同生態(tài)位的靶細胞中，在多種水平上調(diào)節(jié)和塑造腸道菌群的穩(wěn)定性［10］。早期研究表明T6SS 可以殺傷相同生態(tài)位的細菌以影響菌群構(gòu)成，有助于細菌在腸道的定殖［11］。在腸道病原菌中，T6SS 效應蛋白通過黏附修飾、細胞骨架重構(gòu)和逃避宿主固有免疫等過程來實現(xiàn)胞內(nèi)病原菌的定位、存活和傳播［12-14］。目前鑒定出來的T6SS 效應蛋白多為核酸酶或者核酸靶向酶，然而絕大多數(shù)共生菌T6SS 的功能，尤其是對腸道屏障的功能尚不清楚。

腸道炎癥的發(fā)病因素包括遺傳易感、黏膜屏障的損壞、腸道微生物群的失調(diào)和免疫紊亂等。靶向腸道菌群的定向精準干預，是治療腸道炎癥相關疾病的新選擇。本研究擬利用硫酸葡聚糖鈉鹽（DSS）誘導的小鼠腸道屏障損傷模型，探討腸道擬桿菌T6SS 以及其分泌蛋白對腸道炎癥以及腸道屏障的作用。本研究進一步通過非靶向代謝組分析探討T6SS介導的細菌間競爭對腸道代謝組的影響，為其作為益生菌改善腸道屏障功能提供理論依據(jù)［15］。

1 材料與方法

1.1 材料

Bacteroides fragilis（脆弱擬桿菌, B.fragilis）菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；限制性內(nèi)切酶BamH I 和Sal I 購自NEB；感受態(tài)細胞 S17?pir 購自源葉生物；紅霉素購自索萊寶；四環(huán)素購自Cayman；DSS（36-50 kD）購自MP Biomedicals；異硫氰酸熒光素葡聚糖購自Sigma?aldrich；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；SYBR Green 探針購自上海藍木；引物由金唯智公司負責合成（表1）；多功能酶標儀用Synergy HTX Multimode Reader 購自BioTek；qRT?PCR 儀購自Applied Biosystems。

表1 引物列表Table 1 Primer sequence

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) B.fragilis 按1∶100 接種到新鮮的腦心浸液肉湯（BHI）培養(yǎng)基中，活化過夜2 次。二次活化培養(yǎng)16 h 后，離心濃縮細菌（6 000 ×g，4℃，10 min），并用磷酸緩沖鹽水（PBS）洗滌2 次，最后將收集的細胞重新懸浮于PBS 溶液中調(diào)整至所需終濃度。

1.2.2 缺陷株的制備 本實驗采用自殺質(zhì)粒pLGB13構(gòu)建T6SS 缺陷株［16-17］。將選定基因上下游500-3 000 bp 序列通過BamH I 和Sal I 雙酶切位點克隆到自殺質(zhì)粒上，隨后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞S17?pir 中。然后通過接合轉(zhuǎn)化的方式將質(zhì)粒轉(zhuǎn)到B.fragilis WT菌株中。第一輪篩選采用紅霉素（索萊寶，e8100）和特異性引物得到發(fā)生單邊同源重組的克隆。第二輪篩選將細菌用有限稀釋法涂布于含有四環(huán)素（6 μg/mL）的血平板上進行培養(yǎng)，利用特異性PCR 篩選，得到T6SS 缺陷株。利用全基因組測序確定突變株的基因敲除。

1.2.3 同源進化樹的構(gòu)建 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中T6SS 保守基因tssH，利用MEGA11［18］構(gòu)建N?J［19］同源進化樹分析其序列多態(tài)性。

1.2.4 動物實驗設計 選用SPF 級雌性C57BL/6J 小鼠，8-10 周齡，體重為（20±2）g/只。動物隨機分為3 組，每組10 只，分別在溫度21-25℃、相對濕度40%-60%的標準條件下和標準光周期（12 h白天/12 h 黑夜）下飼養(yǎng)。給予小鼠酸化水和標準食物，并在實驗前進行為期7 d 的馴化。隨后，各組小鼠飲水中加入3%（W/V）DSS，維持7 d，第8天改為常規(guī)飲用水。B.fragilis WT 和ΔT6SS 組每24 h 分別灌胃1 × 109CFU 相應脆弱桿菌株活菌制劑，共7 d，每24 h 灌胃一次。

1.2.5 血清熒光素的測定 在第9 天前一晚所有小鼠禁食、禁飲12 h 后，灌胃異硫氰酸熒光素葡聚糖。所有小鼠在異氟醚下處死。收集眼球血及結(jié)腸。眼球血室溫放置30 min 待血液凝固后，離心3 000×g，RT 15 min，取上清測定血清中的熒光強度。本項目經(jīng)蘇州大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查同意并按相關規(guī)定進行（2021 倫審（申報）批第248 號）。

1.2.6 組織病理學 建立DSS 模型后第9 天，根據(jù)實驗分組，收集小鼠的結(jié)腸，用體積分數(shù)為4%的多聚甲醛液固定后經(jīng)石蠟包埋、切片及HE 染色后，在鏡下觀察小鼠結(jié)腸的病理損傷程度。

1.2.7 免疫組化 建立DSS 模型后第9 天，將新鮮結(jié)腸組織標本（0.5 cm）轉(zhuǎn)移到含4%多聚甲醛的離心管中固定后，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復、封閉后，分別加入鼠源Claudin?2、Claudin?3 和Claudin?4 一抗，并于37℃孵育1 h。經(jīng)PBST 洗滌3 次后，每張切片滴加HRP 標記的二抗（抗鼠），室溫孵育30 min。使用DAB 法顯色5 min 后，經(jīng)過復染、脫色反藍后封片。

1.2.8 小鼠腸道組織緊密連接蛋白基因表達檢測 建立DSS 模型后第9 天，剪取結(jié)腸組織50 mg，利用Trizol?氯仿法提取組織總RNA。利用試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green 探針檢測8種緊密連接蛋白（Claudin?1、Claudin?2、Claudin?3、Claudin?4、Occludin、ZO?1、Jam 和Muc?1）的表達情況。RT?PCR 反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 35 s，60℃ 35 s，72℃ 35 s，共35 個循環(huán)；72℃ 10 min。引物序列見表1。

1.2.9 代謝組分析 收集第7 天的小鼠糞便，液氮速凍后，由天津諾禾致源公司（Novogene Co.Ltd）采用液質(zhì)聯(lián)用技術（LC?MS）進行非靶向代謝組測序［20-21］。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 應用GraphPad Prism 9（Version 9.5.0）統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果。兩組間采用t 檢驗進行差異分析。多組間比較采用One?way ANOVA 進行方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett 方法。差異結(jié)果用均數(shù)±標準誤差（mean±SEM）表示。P＜0.05 具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 T6SS在擬桿菌細菌中廣泛存在

以B.fragilis T6SS 保守基因tssH 為模板在NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源比對并構(gòu)建Neighbor?Joining 同源進化樹，結(jié)果表明T6SS 在擬桿菌屬細菌中分布廣泛（圖1）。

圖1 基于擬桿菌屬細菌tssH 基因構(gòu)建的N-J 同源進化樹Fig.1 Neighbor-Joining homogeneous phylogenetic tree based on tssH gene in Bacteroides genus

2.2 T6SS的缺失不影響B(tài).fragilis的生物活性

為了探討B(tài).fragilisT6SS 與腸道屏障之間的作用，本研究采用自殺質(zhì)粒pLGB13 定向敲除T6SS 分泌系統(tǒng)中的tssB?tssC?tssH 基因。細菌全基因組測序驗證了在2365875-2370215 序列的缺失（圖2?A）。篩選得到的缺陷株B.fragilis ΔT6SS 失去了將效應蛋白分泌到靶細胞中的能力，但是并不影響其在液體培養(yǎng)基的生長曲線（圖2?B），也不影響細菌的轉(zhuǎn)錄組和代謝組（圖2?C-D）。

圖2 B.fragilis T6SS 缺陷株的構(gòu)建Fig.2 Construction of B.fragilis ΔT6SS strain

2.3 脆弱桿菌T6SS的缺失導致對DSS的保護性降低

隨著DSS 誘導腸炎的進行，各組小鼠體重與初始相比均有所降低。在誘導后7 d，與對照組相比，B.fragilis WT 實驗組小鼠的體重下降趨勢有顯著改善；而B.fragilis ΔT6SS 實 驗 組 體 重 與B.fragilis WT 組相比明顯降低（圖3?A）。第10 天處死小鼠，統(tǒng)計各組小鼠結(jié)腸長度。B.fragilis WT 組小鼠結(jié)腸長度比對照組（P = 0.025 0）和B.fragilis ΔT6SS 組（P =0.028 4）有明顯改善（圖3?C）。

圖3 B.fragilis T6SS 參與到對DSS 誘導腸道炎癥的保護性Fig.3 B.fragilis T6SS involved in protection on DSS-induced colitis

2.4 B.fragilis T6SS有助于DSS誘導腸道損傷的保護性

DSS 誘導的小鼠結(jié)腸炎病變以盲腸和遠段結(jié)腸為著。因此，選擇小鼠結(jié)腸進行病理切片觀察。與對照組相比，B.fragilis WT 組小鼠結(jié)腸組織病理得到明顯改善，而B.fragilis ΔT6SS 組小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)了和對照組類似的嚴重組織學損傷，具體表現(xiàn)為隱窩細胞和杯狀細胞減少，腸道上皮損傷和炎性細胞浸潤（圖4?A）。此外，在第9 天給小鼠灌服熒光素葡聚糖后，收集血清檢測熒光強度。結(jié)果表明，B.fragilis WT 組小鼠血清中熒光素葡聚糖濃度顯著低于對照組和B.fragilis ΔT6SS 組，而對照組和B.fragilis ΔT6SS 組小鼠血清中熒光素葡聚糖濃度無顯著差異（圖4?B）。

圖4 B.fragilis T6SS 有助于DSS 誘導腸道炎癥中腸道屏障的維持Fig.4 B.fragilis T6SS contributes to the maintenance of the intestinal barrier in the DSS-induced colitis

2.5 B.fragilis T6SS 有助于上調(diào)腸道細胞緊密連接蛋白的表達

上皮屏障功能的喪失可能是由于細胞旁緊密連接通透性的變化造成的。第9 天收集小鼠的大腸，提取RNA 后進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應。結(jié)果顯示，B.fragilis WT 組相比于其他兩組，上皮細胞緊密連接 蛋 白Claudin?2、Claudin?3、MUC?1 和Occludin的mRNA 水平更高（圖5?A）。免疫組化也表明B.fragilis WT 組小鼠腸道組織中Claudin?2、Claudin?3和Claudin?4 有更高的表達量（圖5?B）。對照組和B.fragilis ΔT6SS 組小鼠腸道組織中緊密連接蛋白的表達無顯著差異。

圖5 B.fragilis T6SS 有助于上調(diào)腸道細胞緊密連接蛋白的表達Fig.5 B.fragilis T6SS upregulates the expressions of intestinal tight junction proteins

2.6 代謝組測序

腸道菌群的代謝產(chǎn)物對腸道屏障有直接的作用，因此，我們進一步采用代謝組測序來探索B.fragilis T6SS 參與的菌種競爭對腸道代謝組的影響。結(jié)果表明，灌服B.fragilis WT 和B.fragilis ΔT6SS 小鼠糞便的代謝組有明顯區(qū)別（圖6?A）。與B.fragilis ΔT6SS組相比，灌服B.fragilis WT 的小鼠糞便有96 個顯著差異代謝產(chǎn)物，其中上調(diào)代謝產(chǎn)物86 個，下調(diào)代謝產(chǎn)物10 個（圖6?B）。差異代謝產(chǎn)物見圖6?C，其中上調(diào)最為顯著的代謝產(chǎn)物為甘氨酸（Glycitein）、D?泛黃酸鈣（calcium D?panthotenate）和大豆黃酮（daidzein）。KEGG 通路富集分析表明，差異代謝產(chǎn)物集中在膽堿能突觸（cholinergic synapse）和甘油磷脂代謝（glycerophospholipid metabolism），且均為上調(diào)（圖7）。

圖6 T6SS 對腸道代謝組學的影響Fig.6 Effect of T6SS on intestinal metabolome

圖7 差異代謝物的KEGG 富集結(jié)果Fig.7 KEGG enrichment of differentially expressed metabolites

3 討論

腸道微生物與腸道屏障的相互作用，以及其在人類健康中的病理生理作用一直是研究的活躍領域。由于頻繁使用廣譜抗生素和放化療，血液病和腫瘤學疾病患者的腸道通透性增加的風險尤其高。靶向腸道屏障穩(wěn)態(tài)已成為診斷和治療大量疾病的挑戰(zhàn)。通過FMT 或者定向補充特定益生菌是提高腸道屏障功能的潛在途徑［22］。安全性方面研究最充分的產(chǎn)品是乳酸桿菌、雙歧桿菌和布拉酵母。它們通過增加緊密連接蛋白的表達、減少腸道炎癥和調(diào)節(jié)局部免疫反應來發(fā)揮其活性［23］。深入探索腸道微生物與腸道屏障之間的作用機制，有助于發(fā)現(xiàn)新的具有生物活性的細菌產(chǎn)物，并應用到臨床實踐。

本研究表明，作為主要的腸道共生細菌之一，擬桿菌B.fragilis 的蛋白分泌系統(tǒng)T6SS 有助于上調(diào)腸道緊密連接蛋白的表達，進而改善腸道屏障的通透性，減輕DSS 誘導的腸炎。在腸道炎癥患者中，腸道屏障可能由于黏膜損傷、細胞分子變化或自身免疫性疾病引起的免疫反應失調(diào)而被破壞，而腸道通透性的增加會導致細菌、毒素等入侵黏膜層，進一步損害屏障的完整性［24-25］。已有研究表明，B.fragilis 單個菌株可以調(diào)節(jié)腸道T 細胞炎癥因子的釋放和短鏈脂肪酸（SCFAs）的含量來減輕腸道炎癥反應，提高腸道的完整性［26］。本研究表明B.fragilis利用其T6SS 提高腸道屏障的完整性，為其作為益生菌改善腸道炎癥提供進一步的理論依據(jù)。

此外，小鼠腸道非靶向代謝組分析表明，B.fragilis T6SS 能顯著影響腸道代謝組，上調(diào)甘氨酸、D?泛黃酸鈣和大豆黃酮等96 個代謝產(chǎn)物，且多個代謝產(chǎn)物富集到膽堿能突觸代謝和甘油磷脂代謝相關通路。由于后生素進一步避免了細菌通過胃腸道屏障或者抗生素耐藥的風險，同時保留了益生菌的功效，被認為是對易受感染的患者（例如免疫功能低下或重病兒童和早產(chǎn)兒）使用活菌更安全的替代品［27-29］。深度測序的發(fā)展有助于進一步揭示特定腸道微生物群落及其代謝產(chǎn)物與疾病發(fā)生發(fā)展的相關性。已有研究表明腸道微生物可以分解膳食中的碳水化合物產(chǎn)生丁酸鹽等，有助于修復腸道屏障并抑制IEC 細胞凋亡，也可能通過降低IEC 組蛋白乙酰化水平，從而減輕aGVHD［5］。丁酸鹽還具有抗炎特性，可以調(diào)節(jié)局部入侵細菌誘導的炎癥反應。本研究表明B.fragilis T6SS 顯著改變腸道代謝組，這或許是由于T6SS 對菌群結(jié)構(gòu)數(shù)量的改變所引起的。本研究篩選到的差異代謝產(chǎn)物，是否對腸道屏障起到直接的保護作用，還需要進行深入的機制研究和功能驗證。

在營養(yǎng)和空間有限的腸道環(huán)境中，微生物必須使用各種策略與宿主和其他細菌共存或競爭。T6SS在腸道細菌中普遍存在，是影響微生物群組成的相互作用力之一。T6SS 最初被認為是革蘭氏陰性菌中的一種接觸依賴性殺菌機制［30］。然而，近年的研究極大擴展了其功能靶標和分泌機制［31］。病原菌可以利用T6SS 促進人類腸道中宿主細胞的相互作用和發(fā)病機制，而共生生物可以通過菌群競爭殺傷其他細菌來定殖特定的生態(tài)位。每分鐘每克結(jié)腸內(nèi)發(fā)生超過109次T6SS 分泌事件，表明T6SS 在多種水平上調(diào)節(jié)和塑造腸道菌群的穩(wěn)定性［32］。目前，通過表達針對靶標的納米抗體，構(gòu)建了具有增強細胞黏附能力的程序化抑制細胞（PIC），可以增加T6SS 的殺傷能力和殺傷譜［33］。結(jié)合這些成功的嘗試和本研究的結(jié)果，對T6SS 進行利用和工程化改造，是對腸道菌群進行定向干預的方法之一。

B.fragilis T6SS 對腸道屏障的保護性是通過直接的蛋白分泌，或是通過間接的菌種競爭尚需進一步地探索。對共生菌T6SS 作用機制的深入研究能夠進一步剖析腸道微生物及細菌產(chǎn)物與人類細胞相互作用的分子機制，可以為腸道精準改造治療提供更為安全有效的備選工程菌，具有重大的臨床意義。

4 結(jié)論

本研究表明擬桿菌B.fragilis T6SS 顯著改變腸道代謝組，并影響腸道緊密連接蛋白的表達，保護腸道屏障的完整性，減輕DSS 誘導的腸炎。