劉燦 閆曉陽(yáng) 曾焱 歐祥龍 廖永洪，2

（1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；2.國(guó)家生豬技術(shù)創(chuàng)新中心，重慶 402460）

細(xì)菌外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）是大多數(shù)革蘭陰性菌在正常生理活動(dòng)下分泌的一種納米級(jí)雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，其直徑約為20-250 nm［1］，主要由細(xì)胞外膜的成分組成，包括豐富的外膜蛋白、脂多糖、肽聚糖以及一系列與宿主組織黏附和侵襲有關(guān)的毒力因子，同時(shí)也含有一些細(xì)胞內(nèi)成分，例如DNA、RNA 和酶等，其組成成分決定它會(huì)影響細(xì)菌多種生物過(guò)程，包括生物膜的形成、DNA 轉(zhuǎn)移、營(yíng)養(yǎng)攝取、抗菌防御和細(xì)胞物質(zhì)與毒力因子的運(yùn)輸?shù)龋?-3］。

OMVs 由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、含有大量免疫原性良好的物質(zhì)以及不具有復(fù)制能力等特點(diǎn)，使OMVs 成為疫苗研發(fā)環(huán)節(jié)中優(yōu)質(zhì)的候選抗原［3］。目前，已有以O(shè)MVs 作為主要抗原成分的疫苗上市，其中最著名的是針對(duì)B 群腦膜炎奈瑟球菌開(kāi)發(fā)的外膜囊泡疫苗［4-5］。此外，OMVs 還可以作為疫苗佐劑和載體平臺(tái)用于遞送抗原或藥物［6］。

OMVs 具有廣闊應(yīng)用前景，但天然OMVs 產(chǎn)量低，因此增加其產(chǎn)量是產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中必須解決的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。本文主要從細(xì)菌基因改造、生長(zhǎng)培養(yǎng)條件優(yōu)化和生產(chǎn)純化工藝優(yōu)化3 個(gè)方面對(duì)增加OMVs 產(chǎn)量研究的進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為OMVs 疫苗的相關(guān)研究提供參考。

1 外膜囊泡的生物發(fā)生機(jī)制

目前關(guān)于OMVs 的生物發(fā)生機(jī)制研究主要集中于3 個(gè)學(xué)說(shuō)（圖1）［7］。

圖1 革蘭陰性菌外膜囊泡生物發(fā)生過(guò)程Fig.1 Biogenesis of outer membrane vesicles in gram-negative bacteria

1.1 壓力聚集學(xué)說(shuō)

革蘭陰性菌的細(xì)胞膜由外膜（outer membrane,OM）和內(nèi)膜（inner membrane, IM）組成，在OM 與IM 之間有一層肽聚糖（peptidoglycan, PG）連接OM和IM。Mcbroom 等［8］發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌OMVs 的產(chǎn)生是一種包膜應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞周質(zhì)中存在錯(cuò)誤折疊的有毒產(chǎn)物、高度過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)、肽聚糖片段以及脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）片段時(shí)，異常組分在局部聚集引起了包膜應(yīng)激（圖1?a），最終外膜會(huì)包裹異常組分向外突出形成OMVs 并將其釋放。

1.2 膜交聯(lián)學(xué)說(shuō)

膜交聯(lián)學(xué)說(shuō)是最早提出的OMVs 生物發(fā)生機(jī)制，該學(xué)說(shuō)將OMVs 的生物發(fā)生與囊泡形成部位的外膜-肽聚糖-內(nèi)膜交聯(lián)的減少聯(lián)系起來(lái)（圖1?b），外膜和肽聚糖層通過(guò)交聯(lián)蛋白共價(jià)連接，并通過(guò)此連接與內(nèi)膜共價(jià)連接。當(dāng)去除連接外膜層與肽聚糖層的蛋白質(zhì)、參與肽聚糖平衡代謝進(jìn)而影響外膜層與肽聚糖層交聯(lián)的蛋白質(zhì)以及連接外膜層與內(nèi)膜層的蛋白質(zhì)時(shí)，外膜的一部分會(huì)從肽聚糖層解離并向胞外凸起，夾斷后就形成了囊泡［9-11］。

1.3 脂類(lèi)富集學(xué)說(shuō)

在外膜中加入修飾過(guò)的曲率誘導(dǎo)分子，如LPS或磷脂等脂類(lèi)，這些曲率誘導(dǎo)分子會(huì)改變外膜局部的膜磷脂組成成分、電荷或空間構(gòu)型等，進(jìn)而使外膜的曲率發(fā)生改變，導(dǎo)致OM 發(fā)生局部彎曲（圖1?c），OM?PG 連接被破壞，從而誘導(dǎo)OMVs 的形成和釋放［8,12-13］。

2 基于基因改造增加OMVs 產(chǎn)量的研究

通過(guò)基因改造的方法增加OMVs 產(chǎn)量的研究已在國(guó)內(nèi)外有諸多報(bào)道，研究大多基于細(xì)菌自身OMVs 的生物發(fā)生機(jī)制進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而選擇相應(yīng)的基因進(jìn)行改造，以確認(rèn)通過(guò)某些基因的改造是否能達(dá)到增加OMVs 產(chǎn)量的效果。

2.1 基于壓力聚集學(xué)說(shuō)的基因改造

革蘭陰性菌OMVs 的產(chǎn)生是一種包膜應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)革蘭陰性菌的周質(zhì)中存在錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)廢物、PG 片段和LPS 片段時(shí)，這些廢物會(huì)被包裹在OMVs中并釋放［8］。因此在革蘭陰性菌中缺失參與修復(fù)和/或消除錯(cuò)誤折疊的周質(zhì)蛋白基因，基因缺失突變株都會(huì)表現(xiàn)出OMVs 產(chǎn)量增加。

人工誘導(dǎo)蛋白質(zhì)廢物在周質(zhì)中積累主要是通過(guò)缺失蛋白酶基因或缺失參與σE包膜應(yīng)激反應(yīng)途徑的蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。通常認(rèn)為DegP 蛋白在高溫下主要作為蛋白酶發(fā)揮水解蛋白質(zhì)的作用，以消除未折疊的外膜蛋白［13］。研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌和銅綠假單胞菌中缺失DegP 蛋白后均表現(xiàn)出囊泡增加［8］。值得注意的是，這種情況下增加的囊泡并不依賴(lài)于OM?PG 交聯(lián)水平減少［14］；degQ 基因編碼絲氨酸蛋白酶，其作用是斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)，對(duì)Shewanella oneidensis degQ 突變株進(jìn)行OMVs 定量評(píng)估表明，與野生型菌株相比，degQ 突變株的OMVs產(chǎn)量增加了5 倍［15-16］。在多數(shù)革蘭陰性菌中，σE包膜應(yīng)激反應(yīng)途徑由錯(cuò)誤折疊的外膜蛋白激活，導(dǎo)致σE轉(zhuǎn)錄因子的釋放以及消除錯(cuò)誤折疊的外膜蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄活化［17］。degS 基因編碼屬于HtrA 家族的內(nèi)膜錨定的周質(zhì)內(nèi)肽酶，在存在未折疊蛋白（例如外膜蛋白）的情況下，DegS 參與釋放σE并激活參與修復(fù)和/或消除錯(cuò)誤折疊的周質(zhì)蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄［17］。目前僅有鼠傷寒沙門(mén)氏菌和大腸桿菌中有degS 缺失的研究報(bào)道，其結(jié)果表明degS 缺失后，囊泡的產(chǎn)量明顯增加［18］；此外，還有一種同樣參與σE包膜應(yīng)激反應(yīng)途徑的RseA 蛋白，目前僅在鼠疫桿菌中進(jìn)行了基因缺失，其突變株也表現(xiàn)出高囊泡性［19］。

人工誘導(dǎo)PG 片段在周質(zhì)中積累主要通過(guò)抑制細(xì)菌的肽聚糖回收循環(huán)和β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)過(guò)程［20］。Schwechheimer 等［20］的研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌ΔampGΔamiD 雙基因突變株（AmpG：IM 滲透酶，負(fù)責(zé)將多肽從周質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)以進(jìn)行肽聚糖循環(huán)；AmiD：β-內(nèi)酰胺酶）中，存在PG 片段過(guò)大無(wú)法通過(guò)孔蛋白而在周質(zhì)中聚集的現(xiàn)象，與野生株相比，突變株OMVs 產(chǎn)量增加了約14 倍。此外，牙齦卟啉單胞菌自身溶血素的突變株（ami 突變）也表現(xiàn)出OMVs 產(chǎn)量增加。因?yàn)槿狈ψ陨砣苎鼗钚宰柚沽搜例l卟啉單胞菌降解周質(zhì)肽聚糖片段，周質(zhì)中不能被降解的肽聚糖則發(fā)生聚集并通過(guò)OMVs 排出［21］。

最近研究結(jié)果表明，大腸桿菌ΔrfaC，ΔrfaG 和ΔrfaP 突變株改變了LPS 核心多糖結(jié)構(gòu)，包膜中LPS合成過(guò)程被破壞從而導(dǎo)致細(xì)菌周質(zhì)出現(xiàn)LPS 積累，對(duì)上述3 株突變株OMVs 產(chǎn)量分析發(fā)現(xiàn)OMVs 產(chǎn)量均增加［20］。

2.2 基于膜交聯(lián)學(xué)說(shuō)的基因改造

膜交聯(lián)學(xué)說(shuō)涉及到的蛋白質(zhì)可以分為1.2 中所述的三類(lèi)蛋白，在大多數(shù)革蘭陰性菌中缺失相關(guān)的蛋白基因后，基因缺失突變株表現(xiàn)出OMVs 的產(chǎn)量增加。

連接外膜層與肽聚糖層的蛋白有Pal、Lpp、NlpI 和OmpA 蛋白等脂蛋白或外膜蛋白［1］。Pal 定位于外膜的內(nèi)層，與肽聚糖層相互作用，促進(jìn)膜的穩(wěn)定性，Pal 蛋白的破壞會(huì)導(dǎo)致沙門(mén)氏桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、霍亂弧菌等多種革蘭陰性菌的OMVs 釋放增加［12,22］；Lpp 是革蘭陰性菌中的主要外膜脂蛋白，是唯一與肽聚糖層相連并在包膜結(jié)構(gòu)中起獨(dú)特作用的共價(jià)脂蛋白，Lpp 的N 端結(jié)構(gòu)域被?；⒉迦氲酵饽ぶ校鳦 端結(jié)構(gòu)域與肽聚糖層共價(jià)連接［22］。Lpp 的失活會(huì)導(dǎo)致銅綠假單胞菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌的OMVs 產(chǎn)量增加［18,23］；OmpA 蛋白是革蘭陰性菌的主要外膜蛋白之一，它在外膜和底層肽聚糖層之間提供物理聯(lián)系，即連接作用［11］。缺失ompA 會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和霍亂弧菌的外膜囊泡增加［20］。

NlpI 是一種脂蛋白，不僅部分決定（約40%）Lpp?PG 交聯(lián)的形成，還可以通過(guò)參與肽聚糖分解和合成的平衡，影響肽聚糖層結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響外膜與肽聚糖層交聯(lián)。在沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌、幽門(mén)螺旋桿菌和副豬嗜血桿菌中nlpI 基因缺失均導(dǎo)致OMVs 產(chǎn)量增加［13］。除nlpI 外，能影響肽聚糖的合成與重塑的基因還有mrcB 和yipP［18］。據(jù)報(bào)道，在大腸桿菌和傷寒沙門(mén)氏菌中缺失mrcB 會(huì)影響包膜穩(wěn)定性，促進(jìn)囊泡分泌［20］。yibP 基因（也稱(chēng)為envC）編碼一種與細(xì)胞分裂和肽聚糖水解相關(guān)的酶，缺失yibP 會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌分裂缺陷，在大腸桿菌和沙門(mén)氏菌中會(huì)產(chǎn)生絲狀細(xì)菌，但是突變株的OMVs 產(chǎn)量會(huì)增加［18］。

連接外膜層與內(nèi)膜層的蛋白質(zhì)主要包括TolA、TolB、TolQ 和TolR 等 蛋 白， 其 中TolA、TolQ 和TolR 在內(nèi)膜形成一個(gè)復(fù)合體，而TolB 是一個(gè)外膜蛋白，與Lpp、OmpA 和Pal 相互作用，這4 種蛋白與Pal 蛋白組成Tol?Pal 系統(tǒng)，這些蛋白中任何一個(gè)發(fā)生突變都會(huì)導(dǎo)致外膜完整性出現(xiàn)缺陷（周質(zhì)內(nèi)容物泄漏、洗滌劑不耐受），但是也會(huì)出現(xiàn)OMVs 產(chǎn)量增加［1,18］。研究還發(fā)現(xiàn)，Tol 蛋白或與Tol?Pal 系統(tǒng)相互作用的蛋白質(zhì)（例如絲狀噬菌體的次要外殼g3p 蛋白和大腸桿菌素的易位結(jié)構(gòu)域）過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致特異性地破壞細(xì)胞包膜的穩(wěn)定性從而誘導(dǎo)囊泡大量產(chǎn)生［3］。上述蛋白基因中最令人感興趣的是tolR，該基因已被證明可使不同革蘭陰性菌（包括大腸桿菌、志賀氏菌和沙門(mén)氏菌）的囊泡增產(chǎn)至足以支持疫苗試驗(yàn)。盡管膜完整性受損，但缺失tolR 的細(xì)菌已成為OMVs 應(yīng)用的寶貴工具，因?yàn)槿笔е昴墚a(chǎn)生由外膜相關(guān)蛋白和周質(zhì)蛋白組成的均勻OMVs，同時(shí)OMVs 內(nèi)還不含有由于基因編輯而“泄漏”的內(nèi)膜相關(guān)蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白［24］。此外，還可以進(jìn)一步進(jìn)行基因工程改造加工OMVs，例如設(shè)計(jì)抗原呈遞。迄今為止已測(cè)序的所有革蘭陰性菌的基因組中均發(fā)現(xiàn)有Tol?Pal 系統(tǒng)蛋白的同系物，因此Tol?Pal 編輯很可能是囊泡大量生產(chǎn)的通用策略。事實(shí)上，Tol?Pal 途徑的修飾已被證明可以增加非致病性大腸桿菌、腸外致病性大腸桿菌、福氏志賀氏菌、沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的OMVs 產(chǎn)量［1,12,20,25］。

2.3 基于脂類(lèi)富集學(xué)說(shuō)的基因改造

在外膜層中加入修飾過(guò)的磷脂或LPS 等曲率誘導(dǎo)分子，使OM 的曲率發(fā)生變化，OM?PG 連接被破壞，從而促進(jìn)產(chǎn)生OMVs［2,9,26-27］。

通過(guò)膜磷脂的修飾改變細(xì)菌OM 曲率進(jìn)而增加OMVs 產(chǎn)量的方法主要涉及兩方面。第一方面是通過(guò)基因修飾改變膜磷脂的組成成分，膜磷脂成分的改變會(huì)導(dǎo)致外膜曲率發(fā)生改變，進(jìn)而會(huì)引起包膜應(yīng)激［3］。嗜冷的南極細(xì)菌Shewanella livingstonensis Ac10 的orf5 和plsC1 基因在其合成二十碳五烯酸（EPA）的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，二十碳五烯酸是其膜磷脂的組成成分，作為磷脂的?；嬖谟诩?xì)胞膜中；另外該細(xì)菌的plsC1 和plsC4 基因編碼參與膜磷脂合成的?；D(zhuǎn)移酶。Yokoyama 等［15］分別構(gòu)建該細(xì)菌的orf5、plsC1 或plsC4 基因缺失突變株，發(fā)現(xiàn)突變株的膜磷脂的組成成分發(fā)生了改變，并對(duì)缺失株進(jìn)行囊泡產(chǎn)量進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，基因缺失株的OMVs 產(chǎn)量增加了約5 倍；第二方面是通過(guò)基因修飾影響磷脂由外膜向內(nèi)膜的逆行轉(zhuǎn)移過(guò)程，導(dǎo)致磷脂在外膜中積累，影響外膜的曲率。在革蘭陰性菌中，OmpC?Mla 系統(tǒng)負(fù)責(zé)將外膜外層中錯(cuò)位磷脂運(yùn)送到內(nèi)膜。MlaA 脂蛋白與嵌入外膜的OmpC 蛋白相互作用，并將外膜外層中的磷脂轉(zhuǎn)移到該系統(tǒng)的另一個(gè)組成成分MlaC 蛋白。隨后MlaC將這些磷脂送到位于內(nèi)膜的MlaFEDB 復(fù)合物，該復(fù)合物可以將磷脂重新整合到內(nèi)膜上。Sutterlin 等［28］構(gòu)建了大腸桿菌mlaA 缺失突變株，發(fā)現(xiàn)突變株囊泡產(chǎn)量增加，但是突變株會(huì)因?yàn)槟遗莸倪^(guò)度產(chǎn)生而降低外膜中的脂質(zhì)水平，降低的脂質(zhì)水平會(huì)被來(lái)自?xún)?nèi)膜的脂質(zhì)所補(bǔ)充，而內(nèi)膜脂質(zhì)的降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解。Roier 等［10］突變了流感嗜血桿菌的vacJ 和yrbE基因，它們分別與大腸桿菌的mlaA 和mlaE 基因同源，vacJ 和yrbE 突變株的囊泡產(chǎn)量分別增加了1.6倍和2.2 倍，同時(shí)在霍亂弧菌和空腸彎曲桿菌中構(gòu)建了vacJ 和yrbE 的突變株，也發(fā)現(xiàn)突變株外膜囊泡產(chǎn)量增加。

通過(guò)LPS 的修飾改變細(xì)菌OM 曲率進(jìn)而增加OMVs 產(chǎn)量的方法主要分為兩方面。第一方面是改變LPS 攜帶的電荷。有研究指出，LPS 可以在OMVs 中富集，直接或間接影響OMVs 組成和外膜曲率，進(jìn)而影響OMVs 產(chǎn)量［29］。例如，銅綠假單胞菌產(chǎn)生兩種含有不同O 側(cè)鏈抗原的LPS：帶中性電荷的LPS 和帶負(fù)電荷的LPS，對(duì)OMVs 進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)囊泡內(nèi)僅有帶負(fù)電荷的LPS，對(duì)這個(gè)現(xiàn)象的假設(shè)是OMVs 是在帶負(fù)電荷的LPS 更豐富的區(qū)域產(chǎn)生的，并且電荷排斥會(huì)導(dǎo)致外膜曲率發(fā)生改變進(jìn)而促進(jìn)外膜彎曲釋放OMVs，在僅產(chǎn)生帶負(fù)電荷的LPS 的菌株中發(fā)現(xiàn)OMVs 產(chǎn)量增加也證實(shí)了這種假設(shè)［30］；鼠腸道病原體嚙齒枸櫞酸桿菌中的pmrC 和cptA 均負(fù)責(zé)LPS 修飾，PmrC 和CptA 起連接磷酸乙醇胺和核心多糖的作用。但是成功連接后細(xì)菌內(nèi)帶負(fù)電荷的LPS 的合成減少，所以在嚙齒枸櫞酸桿菌的ΔcptA 和ΔpmrC 突變株中，OMVs 的分泌量都高于野生株［31］。第二方面是改變LPS 的空間構(gòu)型。PagL 是一種通過(guò)去除酰基鏈來(lái)修飾脂質(zhì)A 的酶，在鼠傷寒沙門(mén)氏菌中，表達(dá)PagL 的菌株外膜顯示六?；|(zhì)A 占主導(dǎo)地位，而在OMVs 主要含有五?；|(zhì)A。上述差異現(xiàn)象是由于完全?；兔擋；闹|(zhì)A 其疏水部分橫截面的變化而具有不同的空間構(gòu)型導(dǎo)致的，六?；|(zhì)A 呈圓錐形，而脫?；|(zhì)A 呈圓柱形或倒錐形，具有圓柱形或倒錐形的脂質(zhì)會(huì)增大膜曲率，導(dǎo)致外膜突出并形成OMVs。所以當(dāng)PagL 在鼠傷寒沙門(mén)氏菌中過(guò)表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生的OMVs 幾乎是野生株的4 倍［20,30］。

此外，還有一種獨(dú)特的僅限于銅綠假單胞菌和產(chǎn)生喹諾酮信號(hào)（pseudomonas quinolone signal, PQS）的相關(guān)細(xì)菌的雙層耦合模型，銅綠假單胞菌分泌的PQS 會(huì)插入OM 中增大OM 曲率，使OM 迅速擴(kuò)增，最終導(dǎo)致囊泡形成［32］。在其他革蘭陰性菌中添加外源性PQS 也會(huì)刺激OMVs 的形成，在銅綠假單胞菌中缺失oprF 基因會(huì)上調(diào)PQS 來(lái)誘導(dǎo)OMVs 的分泌［9,25］。

3 基于優(yōu)化生長(zhǎng)條件增產(chǎn)OMVs

細(xì)菌OMVs 的產(chǎn)生是一種受環(huán)境控制的特定的分泌過(guò)程，在生產(chǎn)OMVs 的時(shí)候，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行特定的一些處理。物理刺激如溫度、溶解氧含量和超聲處理等；生化刺激如洗滌劑樣分子、抗生素、抗菌肽和提取劑等；以及限制生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)元素如鐵、氨基酸和硫酸鹽等，均會(huì)對(duì)OMVs 的生成產(chǎn)生一定影響［33-38］。

3.1 物理?xiàng)l件刺激增加OMVs產(chǎn)量

研究表明，生長(zhǎng)溫度對(duì)絕大多數(shù)細(xì)菌的OMVs產(chǎn)生均有影響。37℃培養(yǎng)條件下大腸桿菌的囊泡產(chǎn)量約為30℃培養(yǎng)條件下的5 倍。這種現(xiàn)象在大腸桿菌degP 缺失突變株中顯著增強(qiáng)，OMVs 產(chǎn)量增加超過(guò)150 倍［37-38］。推測(cè)其原因可能是由于degP 缺失突變株周質(zhì)中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)水平升高，從而激活影響囊泡的應(yīng)激反應(yīng)途徑，且膜也變得更有流動(dòng)性，使OM 能夠凸起并釋放OMVs。另外，較高的生長(zhǎng)溫度也會(huì)增加細(xì)胞分裂的速度，同時(shí)增加細(xì)胞壁的生長(zhǎng)和周轉(zhuǎn)率，進(jìn)一步促進(jìn)OMVs 的釋放。百日咳桿菌和支氣管敗血波氏桿菌在55℃下孵育1 h可顯著增強(qiáng)OMVs 釋放，且不會(huì)影響蛋白質(zhì)的含量和構(gòu)象。并且熱休克蛋白GroEL 的含量在溫度變化后沒(méi)有增加，這可能是因?yàn)樵?6℃時(shí)細(xì)菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成完全受到抑制［39-41］。

在工業(yè)生產(chǎn)OMVs 的過(guò)程中，通過(guò)控制培養(yǎng)液中的溶解氧含量，可以在發(fā)酵罐中通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)刺激細(xì)菌產(chǎn)生更多的OMVs［42-43］。例如在腦膜炎奈瑟球菌中，將溶氧含量從30%增加到150%后，OMVs 的產(chǎn)量提高了4 倍［42-43］，其作用機(jī)制可能是OMVs 的釋放可以減輕細(xì)菌承受的氧含量高的環(huán)境壓力。這種以釋放OMVs 的形式減輕環(huán)境應(yīng)激壓力的方式可能與細(xì)菌為消除錯(cuò)誤或未折疊蛋白質(zhì)而釋放OMVs 的形式相似。然而在銅綠假單胞菌中，將有氧培養(yǎng)改變?yōu)槿毖跖囵B(yǎng)，OMVs 產(chǎn)量提高了6 倍，該現(xiàn)象的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未得到進(jìn)一步研究［43］。

在副豬嗜血桿菌中，可以通過(guò)超聲處理來(lái)誘導(dǎo)OMVs 的分泌［11］。但是這種方法是通過(guò)對(duì)細(xì)菌沉淀進(jìn)行超聲處理來(lái)制備，超聲使細(xì)菌的膜破碎并融合裂解形成OMVs，由于上述OMVs 不是從細(xì)菌上清液制備的，而細(xì)菌上清液是傳統(tǒng)天然OMVs 的聚集地，因此超聲誘導(dǎo)的OMVs 可能含有天然OMVs 中并不存在的物質(zhì)。所以，盡管通過(guò)細(xì)菌超聲處理獲得了高OMVs 產(chǎn)量，但由此產(chǎn)生的囊泡并不一定含有天然OMVs 的蛋白組成。因此，若想要將超聲處理誘導(dǎo)的OMVs 作為疫苗開(kāi)發(fā)還需要進(jìn)一步研究。

3.2 生化條件刺激增加OMVs產(chǎn)量

洗滌劑提取OMVs 是傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)中使用最廣泛的方法，第一代腦膜炎奈瑟菌B 群OMVs 疫苗即是基于洗滌劑提取制備的［7］。洗滌劑樣分子例如脫氧膽酸鹽或十二烷基硫酸鈉處理細(xì)菌后，洗滌劑與細(xì)菌膜相互作用以增加外膜囊泡的形成，同時(shí)去除外膜中的LPS，由此產(chǎn)生的OMVs 缺乏LPS，缺乏LPS 的OMVs 減少了動(dòng)物機(jī)體對(duì)LPS 的炎癥反應(yīng)［44］。然而LPS 丟失的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致許多抗原的丟失。此外，OMVs 的內(nèi)在佐劑活性在LPS 去除時(shí)同樣會(huì)喪失。所以這種制備方法的使用在現(xiàn)代生產(chǎn)中越來(lái)越少，科學(xué)家們一直致力于尋找新的方法來(lái)誘導(dǎo)OMVs 釋放并減少LPS 的毒性。

現(xiàn)代生產(chǎn)中常用的誘導(dǎo)OMVs 的另一種方法是使用提取分子，如EDTA。這些提取分子旨在破壞細(xì)菌膜的穩(wěn)定性，從而達(dá)到增產(chǎn)OMVs 的目的［4,44］。其具體作用原理為EDTA 作為一種螯合劑，可以去除環(huán)境中的鈣離子，而細(xì)菌體內(nèi)鈣離子通過(guò)中和LPS 和其他陰離子脂質(zhì)的負(fù)電荷來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞壁。鈣離子的去除會(huì)導(dǎo)致LPS 的負(fù)電荷相互排斥，從而破壞膜的穩(wěn)定性。但EDTA 的作用相對(duì)來(lái)說(shuō)比較溫和，因此會(huì)在OMVs 中保留LPS 和天然成分［4］。因此，使用EDTA 可以提高OMVs 的產(chǎn)量，并且這些OMVs 更適合用于疫苗開(kāi)發(fā)，但由于LPS 仍然存在，且缺乏鈣離子，因此這些OMVs 可能尚不穩(wěn)定。

目前增加OMVs 釋放的另一種方法是通過(guò)補(bǔ)充外部分子來(lái)誘導(dǎo)膜應(yīng)激，例如天然存在的抗菌肽（antimicrobial Peptides, AMPs）［37,43］。AMPs 是 先 天免疫系統(tǒng)的一部分，可由不同的細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)。其通常對(duì)細(xì)菌膜具有高親和力，能破壞膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)外屏障喪失，從而殺死細(xì)菌，因此AMPs增加OMVs 的產(chǎn)生可能是細(xì)菌免受誘導(dǎo)應(yīng)激的一種手段［45］。此外還有多肽類(lèi)抗生素，如多黏菌素B 和多黏菌素E 等，這些分子也被證明可以誘導(dǎo)OMVs釋放。它們誘導(dǎo)OMVs 的機(jī)制可能與AMPs 機(jī)制相似，即基于膜的破壞導(dǎo)致細(xì)菌應(yīng)激并釋放OMVs［37,43］。

靶向細(xì)菌胞內(nèi)發(fā)揮作用的抗生素也被證明可以誘導(dǎo)OMVs 釋放，例如環(huán)丙沙星、慶大霉素、氨芐西林和亞胺培南等。Maredia 等［46］證實(shí)，與未處理的細(xì)菌相比，用環(huán)丙沙星處理的銅綠假單胞菌OMVs 的產(chǎn)量增加了100 倍；同樣是在銅綠假單胞菌中，有研究表明抗生素會(huì)誘導(dǎo)PQS 分泌，而PQS 又被證明誘導(dǎo)OMVs 形成，因此在這個(gè)過(guò)程中OMVs 的形成可能與細(xì)菌對(duì)抗生素的反應(yīng)有關(guān)［47-48］；有學(xué)者對(duì)通過(guò)慶大霉素誘導(dǎo)腸外致病性大腸桿菌產(chǎn)生的OMVs 進(jìn)行表征和質(zhì)譜法分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)得到的OMVs 直徑?jīng)]有改變。相對(duì)于天然OMVs，抗生素誘導(dǎo)得到的大多數(shù)OMVs 內(nèi)存在大量細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)蛋白，這些蛋白可能是慶大霉素干擾核糖體機(jī)制后形成的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)［49］；另外由氨芐西林誘導(dǎo)的大腸桿菌OMVs 也被證明含有過(guò)量的Pal 蛋白，進(jìn)一步證明抗生素可以改變OMVs 內(nèi)物質(zhì)［33,49］；在另一項(xiàng)研究中，將鮑曼不動(dòng)桿菌用四環(huán)素和亞胺培南刺激，并且對(duì)所得的OMVs 進(jìn)行了定量分析。四環(huán)素沒(méi)有誘導(dǎo)OMVs 釋放，但與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，OMVs 產(chǎn)量在暴露于亞胺培南后增加了2.2 倍，并且外膜蛋白和蛋白酶含量均相對(duì)增加。此外埃伐環(huán)素誘導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生的OMVs 同樣不僅含有相對(duì)更多的外膜蛋白，還含有抗性相關(guān)蛋白，如ATP 結(jié)合盒式蛋白（ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）和其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［34,50］。結(jié)果表明這種誘導(dǎo)方法的可能風(fēng)險(xiǎn)，即亞致死濃度的抗生素可能導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性的產(chǎn)生。

3.3 限制生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)元素增加OMVs產(chǎn)量

在試驗(yàn)或者生產(chǎn)中，通過(guò)補(bǔ)充鐵螯合物質(zhì)如去鐵氧胺、乙二胺二羥基苯乙酸和雙嘧啶來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行鐵限制。幽門(mén)螺桿菌中在鐵限制培養(yǎng)條件下會(huì)導(dǎo)致OMVs 產(chǎn)量顯著增加，但OMVs 中相關(guān)毒力因子VacA 的表達(dá)降低，鐵鹽環(huán)境能夠恢復(fù)其表達(dá)水平［43］。同樣，對(duì)流感嗜血桿菌、大腸桿菌和霍亂弧菌產(chǎn)生的OMVs 的研究發(fā)現(xiàn)，鐵限制條件有利于OMVs 產(chǎn)量的增加［35,39］。對(duì)腦膜炎奈瑟菌的研究表明，半胱氨酸的耗竭可以引發(fā)細(xì)菌生長(zhǎng)停滯，并釋放出足夠數(shù)量的OMVs 以用于疫苗生產(chǎn)，這些囊泡是自發(fā)釋放的，且與人類(lèi)疫苗生產(chǎn)系統(tǒng)所需的囊泡高度相似。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析表明，在該研究中半胱氨酸消耗會(huì)損害鐵硫蛋白組裝引起氧化應(yīng)激作為囊泡增加的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)［51］。

由于半胱氨酸消耗時(shí)增強(qiáng)的OMVs 釋放與氧化應(yīng)激和氧化還原反應(yīng)有關(guān)，因此該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究了更多氧化硫源對(duì)OMVs 釋放的影響。結(jié)果表明，腦膜炎奈瑟菌在硫酸鹽（氧化硫源）上的生長(zhǎng)過(guò)程相似，OMVs 釋放通常由硫消耗引發(fā)。硫酸鹽耗竭導(dǎo)致OMVs 釋放增加超過(guò)半胱氨酸耗竭。蛋白質(zhì)組學(xué)表明，硫消耗還會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)并上調(diào)磷脂和LPS 生物合成。此外，硫消耗產(chǎn)生的OMVs 中磷脂富集［51］。因此對(duì)該現(xiàn)象推測(cè)為硫消耗引起磷脂過(guò)度產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致外膜膨脹增加并隨后釋放OMVs。

4 基于優(yōu)化生產(chǎn)工藝提升OMVs 產(chǎn)量

實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)中，OMVs 典型的工藝流程包括以下步驟：（1）在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；（2）去除完整的細(xì)菌：低速離心法去除大部分細(xì)菌，其余細(xì)菌通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾進(jìn)一步消除；（3）濃縮培養(yǎng)物濾液：可以直接對(duì)培養(yǎng)物濾液進(jìn)行超速離心，由于通常取得的OMVs 濃度較低，在離心之前，可以使用沉淀或超濾來(lái)預(yù)濃縮濾液；（4）純化：根據(jù)生產(chǎn)的OMVs 制劑所需的純度，選擇一種合適的純化方法以除去其他細(xì)胞外物質(zhì)如鞭毛、纖毛、毛狀體和大蛋白質(zhì)復(fù)合物或聚集體等，常用的純化方法有密度梯度離心和凝膠過(guò)濾［39,52］。

在生產(chǎn)中對(duì)這套工藝流程進(jìn)行優(yōu)化，使用新的技術(shù)代替原有步驟是一個(gè)很好的切入點(diǎn)。例如OMVs 傳統(tǒng)上是通過(guò)超速離心、梯度離心、超濾或尺寸排阻色譜法分離［53］，但這些技術(shù)或者具有相對(duì)較高的操作成本，或者缺乏大規(guī)模生產(chǎn)所需的可靠性、產(chǎn)量和可重復(fù)性。相反有一種新的靜水過(guò)濾透析（HFD）分離方法，作為通過(guò)選擇性富集尿液樣本快速識(shí)別細(xì)菌性尿路感染的一種方法［54］?，F(xiàn)已有實(shí)驗(yàn)成功地將其用于從革蘭陰性病原體肺炎放線(xiàn)芽孢桿菌和厭食桿菌中大規(guī)模分離OMVs［52］。HFD已被證明是一種經(jīng)濟(jì)高效且簡(jiǎn)單可靠的OMVs 分離方法，特別是在需要大量OMVs 的情況下，例如體內(nèi)免疫試驗(yàn)。HFD 的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它提供了相當(dāng)一致的批次再現(xiàn)性，這一特征對(duì)于疫苗開(kāi)發(fā)至關(guān)重要［52］。由于HFD 最近才被開(kāi)發(fā)為OMVs 分離技術(shù)，因此目前使用HFD 進(jìn)行OMVs 分離的研究較少，無(wú)法與其他OMVs 分離方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋容^。盡管如此，HFD 仍然是大規(guī)模生產(chǎn)OMVs 疫苗最有前途的技術(shù)之一。

此外，目前的OMVs 生產(chǎn)工藝大多是批量工藝，批量工藝生產(chǎn)OMVs 的特點(diǎn)是產(chǎn)量相對(duì)較低，成本較高。而將OMVs 生產(chǎn)過(guò)程從批量處理過(guò)渡到連續(xù)處理可以提高體積生產(chǎn)率，提高設(shè)備利用率，縮短周期時(shí)間和減少設(shè)施占地面積，從而降低生產(chǎn)和投資成本，并產(chǎn)生更高質(zhì)量的產(chǎn)品［55］。批量處理即原材料在工藝開(kāi)始時(shí)被裝入系統(tǒng)，產(chǎn)品被一次性排出，并且在原料充填和產(chǎn)品排出之間，沒(méi)有任何成分會(huì)排出系統(tǒng)；而連續(xù)處理則是在整個(gè)工藝過(guò)程中，原料和產(chǎn)品分別不斷地被注入和排出系統(tǒng)。Gerritzen 等［56］研究了腦膜炎奈瑟菌OMVs 的持續(xù)生產(chǎn)工藝，當(dāng)連續(xù)培養(yǎng)腦膜炎奈瑟菌達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，其OMVs 濃度與周質(zhì)在批量工藝中達(dá)到的濃度相似，并且連續(xù)培養(yǎng)時(shí)穩(wěn)態(tài)是可重復(fù)的，可以保持至少600 d。當(dāng)稀釋速率達(dá)到L/d 時(shí)，連續(xù)培養(yǎng)的體積生產(chǎn)率可達(dá)到4.0×1014OMVs/（L·d）（稀釋速率等于培養(yǎng)液在發(fā)酵罐中平均停留時(shí)間的倒數(shù)），通過(guò)提高稀釋率來(lái)優(yōu)化體積生產(chǎn)率，可以進(jìn)一步強(qiáng)化該過(guò)程。當(dāng)以3.6/d 的稀釋速率連續(xù)生產(chǎn)OMVs 時(shí)，與批量OMVs 生產(chǎn)相比，OMVs 產(chǎn)量增加了9 倍。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，OMVs 的測(cè)試特性沒(méi)有變化，表明連續(xù)生產(chǎn)工藝對(duì)于任何應(yīng)用的OMVs 生產(chǎn)都是可行的。

5 展望

革蘭陰性菌OMVs 的納米尺寸、脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)以及遠(yuǎn)距離遞送活性分子等特點(diǎn)，使其成為具有廣泛應(yīng)用前景的疫苗開(kāi)發(fā)平臺(tái)［6,57］。但天然OMVs 的產(chǎn)量較低，因此在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)中提高OMVs 產(chǎn)量是未來(lái)OMVs 疫苗研究和開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本文綜述了通過(guò)遺傳基因改造、物理?xiàng)l件刺激、生化條件刺激、限制生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)元素和優(yōu)化生產(chǎn)工藝等方式增加OMVs 產(chǎn)量的研究進(jìn)展。目前已有的絕大部分增產(chǎn)方法僅在實(shí)驗(yàn)室里應(yīng)用，具體應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中還有待進(jìn)一步研究。此外還需要不斷的尋找新的低成本、簡(jiǎn)易的增產(chǎn)方法以滿(mǎn)足生產(chǎn)所需。在研究增產(chǎn)的同時(shí)還應(yīng)該考慮到，這些干預(yù)措施中的任何一種方法都可能會(huì)引起OMVs 成分的變化，這在疫苗開(kāi)發(fā)中可能是有利的，因?yàn)镺MVs 本身可以被認(rèn)為是免疫調(diào)節(jié)蛋白的“載體”，通過(guò)結(jié)合遺傳操作、培養(yǎng)條件以及分離和純化方案，可以設(shè)計(jì)囊泡內(nèi)容物以滿(mǎn)足疫苗開(kāi)發(fā)的需求。此外，由于人工干預(yù)的囊泡與細(xì)菌生理釋放的天然囊泡大不相同，因此在研究OMVs 的生理和環(huán)境作用時(shí)，應(yīng)避免對(duì)囊泡釋放過(guò)程的影響。最后，基于OMVs 的疫苗開(kāi)發(fā)還有一個(gè)挑戰(zhàn)，就是由于LPS 的存在而導(dǎo)致的體內(nèi)毒性效應(yīng)，雖然現(xiàn)在已經(jīng)研究了許多方案，例如通過(guò)遺傳修飾和洗滌劑處理等以降低毒性，但要在增產(chǎn)和減毒之間達(dá)到理想平衡，還有很長(zhǎng)的路要走。