劉銳 趙建龍 謝丙炎 李惠霞 茆振川

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 蔬菜生物育種全國重點實驗室，北京 100081）

近年來，隨著農(nóng)業(yè)種植業(yè)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化和調(diào)整，設(shè)施蔬菜栽培面積得以迅速發(fā)展，但長期連茬栽培為根結(jié)線蟲病等土傳病害的發(fā)生和危害提供了適宜的環(huán)境，導(dǎo)致根結(jié)線蟲病成為制約我國設(shè)施蔬菜發(fā)展的主要限制因素［1-2］。根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）在全世界范圍分布廣泛、寄主種類多、危害嚴重，每年造成巨大的損失，是危害農(nóng)作物最嚴重的線蟲之一，被列為全球十大植物寄生線蟲之首位［3-5］。

根結(jié)線蟲病是作物生產(chǎn)中極難防治的病害。根結(jié)線蟲侵染寄主植物后，造成植物矮小、葉片發(fā)育不良、畸形，嚴重時整株萎蔫枯死［6］。據(jù)報道，根結(jié)線蟲超過100 種，危害數(shù)千種植物［4,7］，嚴重影響農(nóng)作物生產(chǎn)的有南方根結(jié)線蟲（M.incognica）、爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）、花生根結(jié)線蟲（M.arenaria）和象耳豆根結(jié)線蟲（M.enterolobii），其中以南方根結(jié)線蟲危害最為嚴重［8］。雖然每種根結(jié)線蟲有獨特的寄主范圍和偏好的環(huán)境條件，危害寄主的癥狀略有不同，但在寄主根部形成癭瘤或腫脹是它們的共同特征。在寄生的過程中，該類線蟲誘導(dǎo)植物根部微管細胞重新分化形成取食位點，即巨型細胞（細胞核分裂，細胞質(zhì)不分裂而形成多核的巨細胞），這些細胞是線蟲發(fā)育過程中唯一的取食來源［9］。因此，取食位點的形成和維持在根結(jié)線蟲侵染及發(fā)育過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本文擬綜述根結(jié)線蟲誘導(dǎo)寄主植物形成巨型細胞的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)研究進展，及寄主植物的防御策略、線蟲-植物協(xié)同進化等，以解析巨型細胞形成過程，進一步揭示根結(jié)線蟲寄生的分子機制，為根結(jié)線蟲抗性育種及其有效防治開拓思路。

1 巨型細胞的形成和調(diào)控機制

1.1 巨型細胞的形成

根結(jié)線蟲以二齡幼蟲侵入植物后，在寄主中完成其整個生活史，一般在20-40 d 內(nèi)完成一個生命周期［10］。二齡幼蟲從寄主根部伸長區(qū)穿透寄主植物，沿細胞間向下遷移至根尖，向分生組織移動，最終進入維管束圓柱體木質(zhì)部發(fā)育區(qū)［11］。二齡幼蟲通過口針穿刺一些寄主細胞，誘導(dǎo)這些細胞成為永久性取食位點。通常，根結(jié)線蟲的取食位點由5-8個細胞經(jīng)歷形態(tài)和生理的變化，成為根結(jié)線蟲的營養(yǎng)庫。Treub 根據(jù)其形態(tài)特征，于1886 年首次將其命名為巨型細胞（giant cells）。在20 世紀60 年代，通過光學(xué)和電子顯微鏡技術(shù)對植物寄主中誘導(dǎo)的取食位點的形態(tài)特征進行了詳細的描述［12-13］。觀察發(fā)現(xiàn)，在寄主根部維管束內(nèi)巨型細胞形成的第一個證據(jù)是線蟲頭部附近出現(xiàn)雙核細胞［14］。隨后，巨型細胞前體細胞經(jīng)歷反復(fù)的核分裂但不進行細胞質(zhì)分裂，使其大小為正常細胞的100 多倍［15］，新的有絲分裂周期與胞質(zhì)分裂解偶聯(lián)導(dǎo)致巨型細胞呈多核狀態(tài)［16］。通常巨型細胞核仁增大，質(zhì)膜面積增加，細胞質(zhì)變得致密，包括線粒體、質(zhì)體、核糖體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器大量富集，且呈漩渦狀排列［17］。隨著巨型細胞的形成，細胞中央液泡由開始時的大液泡變成許多小液泡，細胞壁也隨之增厚［18］。

1.1.1 巨型細胞的細胞壁 在侵染寄主的過程中，由于植物細胞壁結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成的限制和保護，根結(jié)線蟲首先要克服寄主細胞壁的物理和化學(xué)屏障，才能成功地侵入寄主細胞，并在組織中遷移。根結(jié)線蟲在建立取食位點時，巨型細胞的細胞壁會發(fā)生修飾，增厚、向內(nèi)生長，并改變其成分，以滿足巨型細胞形成所需的物理和化學(xué)基礎(chǔ)。

在發(fā)育早期，巨型細胞出現(xiàn)細胞壁的增厚。最初，細胞壁上出現(xiàn)許多小斑塊，隨著這些斑塊擴大、合并，導(dǎo)致更大范圍的細胞壁增厚。但在成熟的巨型細胞中，細胞壁厚度是不均勻的，這表明在其發(fā)育過程中細胞壁是不對稱分布［19］。通過高倍電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)增厚的細胞壁與初生細胞壁相似，未顯示出任何的特殊結(jié)構(gòu)，染色后也未表現(xiàn)出明顯變化［12,20-21］。在韌皮部細胞、維管柱薄壁細胞及其鄰近的不同組織內(nèi)的巨型細胞中，細胞壁均向內(nèi)分散生長［19,22］。有研究發(fā)現(xiàn)，巨型細胞間存在胞間連絲，至少在兩個相鄰的巨型細胞之間的細胞壁中存在胞間連絲［18,22］。不過，也有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥受南方根結(jié)線蟲侵染形成的巨型細胞，其細胞壁缺乏胞間連絲，而營養(yǎng)物質(zhì)是通過發(fā)育良好的細胞壁向內(nèi)生長系統(tǒng)，以胞外增殖方式進入巨型細胞［19］。擬南芥轉(zhuǎn)錄因子PUCH1 基因在線蟲侵染早期上調(diào)表達，PUCH1 突變體中的細胞壁增厚，可能通過長鏈脂肪酸合成調(diào)節(jié)巨型細胞的發(fā)育［23］?？傊?，巨型細胞形成過程中細胞壁的修飾過程非常復(fù)雜，這些變化可能是由寄主細胞基因差異表達導(dǎo)致的。

與正常細胞相比，巨型細胞細胞壁的成分會發(fā)生變化。巨型細胞細胞壁的組成在細胞增大過程中也隨之變化。植物細胞壁的主要成分是纖維素，這是一種由1,4-β-葡聚糖組成的線性聚合物。在巨型細胞形成的過程中，兩種纖維素合成酶基因CesA2和At4g15290（AtCSLB5）下調(diào)表達［24］。此外，對根結(jié)中的10 個纖維素合成酶基因的全面分析發(fā)現(xiàn)，次生壁相關(guān)CesA 基因主要在巨型細胞內(nèi)表達，表明CesA 基因參與巨型細胞的形成［25］；控制細胞壁強度和延展性的關(guān)鍵是木聚糖的代謝，木葡聚糖代謝酶可分為兩大類：木葡聚糖轉(zhuǎn)糖基化酶（xyloglucan transglycosylases, XET）［26］和木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基化酶（xyloglucan endotransglycosylases, EXGT）［27］。同樣在南方根結(jié)線蟲侵染楊樹后形成的食位點中發(fā)現(xiàn)纖維素、木聚糖、木質(zhì)素的改變［28］。通過對根結(jié)線蟲感染擬南芥全基因組表達譜分析發(fā)現(xiàn)，兩個XET基因的表達在線蟲侵染后發(fā)生改變［29］；巨型細胞形成過程中還伴隨著擴張蛋白基因的表達變化。擴張蛋白是細胞外植物蛋白，有助于細胞壁修飾。擴張蛋白家族包括4 個家族：α-擴張蛋白α-expansins（EXPA）、β- 擴 張 蛋 白β-expansins（EXPB）、擴 張蛋白樣A expansin?like A（EXLA）和擴張蛋白樣B expansin?like B（EXLB）［30］。7 個EXPA 和2 個EXPB 基因在受南方根結(jié)線蟲誘導(dǎo)的擬南芥根中表達上調(diào)，且其表達受到暫時調(diào)控，其中6 個基因表達量在14 d 時高于7 d［29］。

1.1.2 巨型細胞的細胞骨架 通過基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，許多參與細胞骨架的基因在巨型細胞形成過程中存在差異表達［24］。植物細胞骨架主要由微管（MTs）和肌動蛋白絲（F?actin 或微絲，MFs）以及中間絲組成。線蟲取食過程中，微管和肌動蛋白同時受到影響，細胞骨架發(fā)生了重組。巨型細胞不能完成胞質(zhì)分裂，導(dǎo)致膜質(zhì)體發(fā)育不完全。細胞分裂完成依賴于分泌囊泡、動態(tài)細胞骨架和一組輔助蛋白的協(xié)調(diào)作用和相互融合［31］。

具有細胞支架作用的微管，也參與細胞分裂和胞內(nèi)運輸。在線蟲侵染后，其表達量會發(fā)生劇烈的變化。原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)，線蟲侵染初期α-、β-和γ-微管蛋白基因mRNA 含量升高，在線蟲侵染25 d后微管蛋白的表達逐漸減少［16］。微管蛋白MAP65?3的表達在巨型細胞形成初期受到上調(diào)，在巨型細胞將要完成發(fā)育時其表達量迅速下降。MAP65?3 與周圍細胞的有絲分裂MT 陣列有關(guān)，并且在缺失MAP65?3 后，巨型細胞開始發(fā)育但未能完全分化，最終被破壞。MAP65?3 在巨型細胞有絲分裂細胞骨架中起著關(guān)鍵作用［32］。

肌動蛋白與微管共同構(gòu)成胞質(zhì)骨架，在誘導(dǎo)取食位點的形成過程中，其相關(guān)基因的表達量顯著增加，肌動蛋白絲的密度也增加。肌動蛋白（G?actins）的兩個基因ACT2 和ACT7 在巨型細胞的發(fā)育過程中起作用［16］。用GFP 標記的肌動蛋白（GFP:mTalin或GFP:FABD）在巨型細胞和鄰近細胞顯示出強烈的GFP?ABD 熒光，表明在巨型細胞形成中肌動蛋白表達量較高［31］。肌動蛋白絲在巨型細胞相鄰的細胞中的分布具有隨機性，但在與巨型細胞直接相連的細胞中，表現(xiàn)出高密度分布［16］。在巨型細胞皮層中觀察到異常粗的肌動蛋白絲，進一步證明MF 網(wǎng)絡(luò)對線蟲侵染做出反應(yīng)。細胞觀察和免疫細胞化學(xué)研究揭示，MFs 在巨型細胞中肌動蛋白細胞骨架的組織紊亂［16］，且在細胞分裂過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中MFs 也明顯缺失［33］。Formmins，也被稱為Formin 同源蛋白（FH），是一種肌動蛋白成核蛋白，在真核生物中刺激細胞過程的MF 組裝，包括細胞分裂、黏附、建立極性和運動［34］。AtFH4 和AtFH21 在線蟲侵染后3 d 的巨型細胞中被抑制［24］。擬南芥肌動蛋白解聚因子（ADF）基因家族包括11 個表達成員，其中5個基因在根結(jié)中表達上調(diào)，根結(jié)線蟲誘導(dǎo)的線蟲取食細胞中ADF2 的高表達有助于線蟲成功寄生，主要原因是高濃度的ADF2 可能會導(dǎo)致MFs 的不穩(wěn)定，從而降低肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)的完整性，繼而促進線蟲的攝食及其發(fā)育［35］。因此，巨型細胞的生長和增大依賴于動態(tài)肌動蛋白絲數(shù)量的增加和體積增大，以支持巨型細胞的骨架和活躍的胞質(zhì)代謝。

肌動蛋白細胞骨架的結(jié)構(gòu)變化，可能是特定線蟲特定分泌物分泌到維管束細胞導(dǎo)致的結(jié)果，這些分泌物能夠觸發(fā)建立功能性巨型細胞形成所需的細胞骨架變化。線蟲可能將特定的效應(yīng)分子直接或間接傳遞到植物細胞中靶向細胞骨架，而對這些效應(yīng)分子功能的深入研究將有助于揭示巨型細胞形成的分子機制。

1.1.3 巨型細胞的液泡和細胞核 根結(jié)線蟲在誘導(dǎo)巨型細胞形成初期，迅速膨脹到相鄰細胞的10 倍以上。此時構(gòu)成細胞的大部分為大液泡，隨著巨型細胞的發(fā)育大液泡變成許多小液泡，細胞質(zhì)含量相應(yīng)增加。隨著巨型細胞的成熟，細胞核的數(shù)量明顯增加，大液泡被細胞質(zhì)的合成所取代，并成為隨后大量蛋白質(zhì)合成的來源［36］。研究表明，大液泡的形成是巨型細胞擴張的原因［37］。在根結(jié)快速發(fā)育的過程中，液泡膜內(nèi)在蛋白（TIPS）以及水通道蛋白（TobRB7）在巨型細胞中高表達［38-39］。研究人員關(guān)注巨型細胞發(fā)育后期，從大液泡到許多小液泡變化的原因。細胞分裂之前形成一個橫跨液泡的細胞質(zhì)膜，將液泡一分為二，形成占據(jù)兩個子細胞的較小的液泡。早期的研究表明巨型細胞中大液泡，可能是通過質(zhì)膜活動將其一分為二形成小的液泡［21］。因此大量的小液泡可能是細胞在沒有經(jīng)歷胞質(zhì)分裂的情況下進入有絲分裂周期而持續(xù)的液泡碎裂造成的。近些年關(guān)于巨型細胞的液泡相關(guān)研究較少，尤其是線蟲侵染后激活取食位點的細胞周期從而改變液泡的形成。

根結(jié)線蟲在寄主植物的維管束柱中誘導(dǎo)5-8 個細胞形成多細胞核的巨型細胞，這些巨型細胞分布于薄壁維管細胞和木質(zhì)部細胞中，經(jīng)歷多次有絲分裂［40］、細胞分裂中斷或阻斷［16］，最終誘導(dǎo)根結(jié)的形成。研究人員普遍認為，細胞核的增多是核內(nèi)復(fù)制的結(jié)果，在整個巨型細胞發(fā)育和擴增過程中，會發(fā)生多次且經(jīng)常同步的有絲分裂，最終形成超大的多核細胞［40］。通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察巨型細胞中細胞核的變化，線蟲侵染24 h 后未觀察到雙核細胞，48 h 開始可以觀察到雙核細胞，在72 h觀察到2-8 個甚至更多的細胞核。6 d 時觀察到大量的細胞核、中央液泡進一步縮小［41］。在侵染早期，根結(jié)線蟲誘導(dǎo)取食位點的細胞周期蛋白和細胞周期蛋白激酶的表達，促進巨型細胞內(nèi)復(fù)制，導(dǎo)致多核細胞的形成。

1.1.4 巨型細胞的周期變化 根結(jié)線蟲對取食位點中細胞周期的調(diào)控涉及大量的細胞周期基因的表達和激活［42］。在根結(jié)線蟲侵染寄主根部巨型細胞周期研究中，通過對周期蛋白依賴性激酶cdc2a 和有絲分裂周期蛋白cyc1At 基因的標記，發(fā)現(xiàn)在這些基因的轉(zhuǎn)錄激活與巨型細胞發(fā)育的早期階段相關(guān)［42-43］。同樣對根結(jié)線蟲侵染苜蓿（Medicago truncatula）根部研究發(fā)現(xiàn)，細胞分化和核內(nèi)復(fù)制所需的細胞周期基因CCS52a 在誘導(dǎo)的巨型細胞中積累［44］。此外，研究表明細胞周期抑制劑KRP2，觸發(fā)有絲分裂CDK 活性的抑制和核內(nèi)復(fù)制的過早發(fā)生，表明KRP2 參與巨型細胞的發(fā)育［45］。擬南芥細胞周期基因AtCDKA;1 的沉默，導(dǎo)致擬南芥對根結(jié)線蟲的敏感性降低。相反，擬南芥CDK 抑制物（ICK）/KIP相關(guān)蛋白（Krp）家族功能的缺失，對根結(jié)發(fā)育和線蟲繁殖的影響較?。?6］。而植物細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑，如擬南芥CDK 相互作用因子/抑制劑（ICK）/ kip 相關(guān)蛋白（KRP）家族中ICK2/KRP2 和ICK1/KRP1 參與控制南方根結(jié)線蟲誘導(dǎo)的巨型細胞有絲分裂到核內(nèi)復(fù)制，巨型細胞的發(fā)育受ICK2/KRP2 蛋白水平嚴格調(diào)控［47］。并不是所有的Krp 都以相同的方式調(diào)節(jié)細胞周期，Krp6作為有絲分裂細胞周期的激活劑，參與巨型細胞多核和細胞動力狀態(tài)的保持［48］。通過對61 個核心細胞周期基因的表達深入分析發(fā)現(xiàn)，其中大多數(shù)基因在巨型細胞中表達［49］。紡錘體組裝檢查點（spindle assembly checkpoint）是一種精細的監(jiān)測機制，確保進行有絲分裂的染色體在正確連接到紡錘體微管之前不會分離，而編碼紡錘體關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的基因都在巨型細胞中上調(diào)表達［50］。那么防治根結(jié)線蟲危害，是否可以通過控制細胞周期，抑制巨型細胞的形成，從而達到防治根結(jié)線蟲的目的，這一防治策略的可行性還有待深入研究。

1.2 巨型細胞的水分和營養(yǎng)供給

根結(jié)線蟲在建立取食位點后靜止不動，而完全依賴巨型細胞為其提供所需的養(yǎng)分和水分［15］。因此，取食位點內(nèi)的細胞壁修飾、水分運輸，蛋白運輸?shù)葘τ诰S持取食位點的正常功能至關(guān)重要。

巨型細胞也是線蟲所需水分的來源，而巨型細胞在形成的過程中額外增加了對水分的需求，因此，水分代謝是巨型細胞發(fā)育和維持的基礎(chǔ)。而線蟲誘導(dǎo)的巨型細胞的顯著特征之一是在木質(zhì)部處形成細胞壁突起，從細胞壁伸入取食細胞的原生質(zhì)中，幫助水分和營養(yǎng)物質(zhì)從木質(zhì)部運輸?shù)饺∈臣毎?2,41］。在巨型細胞中檢測到水通道蛋白特異性上調(diào)［38］，進一步發(fā)現(xiàn)該水通道蛋白屬于主要內(nèi)在蛋白（MIPs）家族，該家族的成員在巨型細胞中也被發(fā)現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)表達［24,29］。由于自身的物理化學(xué)性質(zhì)，質(zhì)膜的輸水能力有限。水通道蛋白除了擴散外，還可以通過質(zhì)膜形成水孔，進一步促進水分的短距離輸送。

根結(jié)線蟲在建立取食位點的過程中，單糖作為修復(fù)損傷組織和細胞骨架的原料，大量糖類物質(zhì)從地上部位向取食位點轉(zhuǎn)運。植物寄生線蟲通過口針刺穿寄主細胞的細胞壁，不同類型的線蟲從取食細胞中提取營養(yǎng)物質(zhì)略有不同。1975 年，Jones 等［20］通過研究鳳仙花根的跨膜電位，發(fā)現(xiàn)了根結(jié)線蟲寄生后活性糖轉(zhuǎn)運到巨型細胞的跡象。研究還發(fā)現(xiàn)根結(jié)線蟲侵染后，擬南芥根中幾種轉(zhuǎn)運基因的表達存在差異［37］。而在線蟲侵染21 d 時氨鹽基轉(zhuǎn)運基因AtAMT1;2 下調(diào)表達［51］。2021 年許立鶴［52］研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中擬禾本科根結(jié)線蟲取食位點巨型細胞內(nèi)，蔗糖是通過胞間連絲而非水稻蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白進行運輸。

植物寄生線蟲完全依賴寄主植物提供的水和營養(yǎng)，而如何獲取營養(yǎng)物質(zhì)取決于線蟲的取食策略。寄生線蟲-植物通過復(fù)雜的相互作用，誘導(dǎo)植物根部形成特定的取食結(jié)構(gòu)。研究表明，孢囊線蟲合胞體是同質(zhì)分離，在發(fā)育早期階段，運輸?shù)鞍棕撠?zé)營養(yǎng)供應(yīng)，之后通過胞間連絲與韌皮部建立聯(lián)系，從而獲得充足的同化產(chǎn)物［53］。但是，目前尚不清楚根結(jié)線蟲是如何迫使植物向其取食結(jié)構(gòu)提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)，以及如何完成從單質(zhì)向共質(zhì)的溶質(zhì)供應(yīng)的轉(zhuǎn)變，這些作用機制還需要更加深入研究。

1.3 植物激素對巨型細胞的調(diào)節(jié)作用

根結(jié)線蟲在侵染的過程中會通過調(diào)節(jié)寄主植物的激素來幫助自身成功寄生［54］。植物內(nèi)生激素在協(xié)調(diào)植物對寄生生物營養(yǎng)物和昆蟲的反應(yīng)方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用［55］。根結(jié)線蟲首先需要抑制植物防御系統(tǒng)，然后利用激素通路來建立和維修取食位點。因此，在巨型細胞發(fā)育的過程中，生長素、細胞分裂素、水楊酸、乙烯和茉莉酸等植物激素發(fā)揮重要作用［56-57］。

生長素可以調(diào)節(jié)植物細胞器的發(fā)生，而巨型細胞需要富集大量的細胞器以滿足旺盛的代謝需求，因此，巨型細胞發(fā)育和成熟與生長素的局部積累密切相關(guān)。研究認為，細胞增大、細胞壁增厚和細胞周期激活都可能有生長素調(diào)節(jié)，推測生長素可能是取食細胞形成和發(fā)育的基礎(chǔ)［43］。根據(jù)根結(jié)線蟲的分泌物中檢測到生長素及其相關(guān)化合物，推測線蟲通過分泌物干擾生長素合成酶來調(diào)控局部的生長素水平，從而誘導(dǎo)巨型細胞的形成［58］。在線蟲侵染早期，取食位點周圍的生長素的積累可能是由于線蟲自身的分泌，局部誘導(dǎo)的植物生物合成，并調(diào)控生長素的運輸［59-60］。研究表明，南方根結(jié)線蟲的分泌物在巨型細胞的形成過程中激活了生長素調(diào)節(jié)因子LBD16，該基因促進植物側(cè)根的發(fā)育，直接證明了根結(jié)線蟲可能或至少部分劫持了植物發(fā)育相關(guān)關(guān)鍵基因［60］。

巨型細胞中細胞分裂素的含量明顯增加，表明細胞分裂素參與巨型細胞的形成［61］。細胞分裂素在巨型細胞形成中發(fā)揮作用的直接證據(jù)是細胞分裂素氧化酶在根中的瞬時表達，該氧化酶負責(zé)細胞分裂素的降解，從而導(dǎo)致植物對RKN 更具抗性［62］。在巨型細胞顯微結(jié)構(gòu)中，觀察到細胞分裂素信號的負調(diào)節(jié)因子普遍下調(diào)［24］。研究表明，在根結(jié)線蟲巨型細胞的形成中，乙烯發(fā)揮了作用［24,63-64］，但之后研究人員還發(fā)現(xiàn)，乙烯可能通過減少線蟲對根部的吸引力，從而抑制根結(jié)線蟲的感染［65-68］。

水楊酸、茉莉酸的研究主要集中在作為防御激素的作用。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在線蟲侵染后的不同時間段，觀察到水楊酸途徑被抑制［24,68-69］。水楊酸正向調(diào)節(jié)線蟲的敏感性［70］，如超表達介導(dǎo)水楊酸信號的類似脂肪酸蛋白AtPAD4 或水楊酸途徑的正向調(diào)節(jié)因子NPR1 超表達時，植物對根結(jié)線蟲的敏感性均出現(xiàn)下降［71-72］，而水楊酸降解酶NahG 基因超表達，則增加了對線蟲的敏感性［65］。人們普遍認為外施茉莉酸會降低線蟲的感染［73］。油菜素類固醇（BRs）參與植物對根結(jié)線蟲的反應(yīng)［65］，BRs 可能對茉莉酸具有拮抗作用［74］。近些年除了經(jīng)典的植物激素外，多肽類激素也影響植物的生長和發(fā)育；值得注意的是，線蟲已經(jīng)進化出植物肽激素（PPH）效應(yīng)模擬物來促進寄生［54,75］。

在根結(jié)線蟲取食位點形成早期，生長素和細胞分裂素的積累有助于巨型細胞的形成。細胞分裂素能促進分生組織的細胞分化，可以調(diào)節(jié)有絲分裂G1/S 期，水稻根結(jié)線蟲通過調(diào)節(jié)生長素和細胞分裂素的平衡從而促進巨型細胞形成［76］。水楊酸、茉莉酸和油菜素內(nèi)酯等參與植物防御反應(yīng)，根結(jié)線蟲通過調(diào)控相關(guān)激素來抑制寄主的防衛(wèi)，從而幫助線蟲的寄生。取食位點形成的過程中，線蟲通過調(diào)節(jié)寄主不同激素間的平衡來促進取食位點的形成。線蟲與寄主植物激素相關(guān)的報道較多，但是關(guān)于線蟲取食位點形成過程中，如何調(diào)控不同激素介導(dǎo)的信號通路，及其相互作用尚缺乏研究。未來可以通過借助高通量測序等技術(shù)，加強根結(jié)線蟲效應(yīng)子與植物激素互作中的功能研究。

2 根結(jié)線蟲誘導(dǎo)巨型細胞形成的分子機制

根結(jié)線蟲從寄主的根部進入，首先需要突破寄主免疫防御反應(yīng)建立取食位點。目前植物寄生線蟲關(guān)于調(diào)控寄主免疫方面的效應(yīng)蛋白已經(jīng)有大量的報道［77］。同時根結(jié)線蟲可以分泌多種效應(yīng)物調(diào)控寄主植物根部細胞發(fā)育，誘導(dǎo)取食位點的形成［78］。并且巨型細胞的發(fā)育和維持需要線蟲的持續(xù)刺激。目前關(guān)于根結(jié)線蟲效應(yīng)蛋白調(diào)控巨型細胞形成相關(guān)的細胞壁、核內(nèi)復(fù)制、細胞骨架和物質(zhì)運輸?shù)确矫婢袌蟮馈?/p>

2.1 寄主植物的識別和防御

在植物與線蟲的互作中，許多的差異基因已經(jīng)被證實與線蟲的定殖相關(guān)，表明線蟲可操縱植物寄主細胞對植物基因表達進行大量的重新編程。在線蟲侵染過程中，對寄主影響的早期研究是在模式植物擬南芥中開展的，通過比較接種與未接種線蟲的擬南芥寄主根（根結(jié)區(qū)）的差異基因進行分析。之后大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)提供了不同宿主基因表達模式差異［24,29,37,51,79］，如番茄（Solanum lycopersi?cum）［80-81］、 豇 豆（Vigna unguigulata）［82］、 水 稻（Oryza sativa）［83］、 龍 葵（Solanum torvum Sw.）［84］西瓜（Citrullus lanatus）［85］等。雖然數(shù)千個差異表達的植物基因與線蟲感染有關(guān)，這些響應(yīng)線蟲的植物基因被歸類為與植物發(fā)育途徑和巨型細胞發(fā)育相關(guān)的類別，突出了防御和激素反應(yīng)、細胞周期和細胞骨架組織、細胞壁和代謝重編程等，它們在植物防御反應(yīng)、激素途徑，以及代謝重新編程中發(fā)揮著重要作用。植物觸發(fā)的免疫反應(yīng)包括首先感知病原體相關(guān)的分子模式（pathogen?associated molecular pattern, PAMPs）由被破壞的植物組織通過分子模式識別受體（pattern recognition receptors, PRRs）釋放的損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns, DAMPs）。然后，植物會通過激活防御反應(yīng)來識別根結(jié)線蟲并對其做出反應(yīng)。巨型細胞的發(fā)育與免疫反應(yīng)直接相關(guān)，在辣椒中的抗根結(jié)線蟲基因Me1 通過抑制巨大細胞的發(fā)育從而表現(xiàn)出抗根結(jié)線蟲作用［86］，而Me3 基因以及番茄中Mi?1 等基因則是誘發(fā)HR（hypersensitive response, HR）反應(yīng)，使巨型細胞的形成受阻，從而表現(xiàn)抗性［87-88］。對基因表達的全基因組分析表明，在根結(jié)線蟲與寄主的親和互作中，巨型細胞中參與防御途徑的大多數(shù)線蟲調(diào)控基因的表達受到抑制。例如，檢測到WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的普遍抑制，這些轉(zhuǎn)錄因子家族已知作用于幾種植物激素的下游，以激活植物防御或編碼病程相關(guān)（PR）蛋白的基因［24,29,89］。

2.2 取食位點中基因的表達模式

取食位點需經(jīng)歷一系列不同的階段，包括初期誘導(dǎo)、根結(jié)的形成、刺激細胞核分裂但細胞質(zhì)不分裂、細胞伸長和擴張、細胞壁增厚、細胞質(zhì)含量增加、DNA 內(nèi)復(fù)制和代謝活性增加等，這些過程都伴隨基因表達的調(diào)控。研究人員利用多種方法對線蟲取食位點內(nèi)的基因進行了上調(diào)表達和下調(diào)表達的分類，為確定哪些基因在取食位點的形成中起重要作用奠定基礎(chǔ)。例如，通過對南方根結(jié)線蟲侵染后的擬南芥全基因組的表達譜分析，鑒定出3 373 個基因存在顯著的差異表達，其中植物發(fā)育調(diào)控、非生物和生物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)基因的參與取食位點的形成［29］。2009 年研究人員對線蟲侵染植物后基因的變化進行了全面的綜述［39］。之后研究人員利用激光捕獲顯微切割技術(shù)對番茄感染線蟲早期的取食細胞進行分離和分析，與擬南芥相同發(fā)育階段的根結(jié)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果比對分析，發(fā)現(xiàn)植物根結(jié)中117 個同源基因被共調(diào)控［81］。利用轉(zhuǎn)錄組分析爪哇根結(jié)線蟲侵染擬南芥以及擬禾谷根結(jié)線蟲侵染水稻早期根組織，發(fā)現(xiàn)在巨型細胞發(fā)育過程中維管束細胞間存在分子聯(lián)系，并假定為巨型細胞為干細胞［24,69］。測序技術(shù)的進步為深入解析根結(jié)線蟲取食細胞的形成提供了數(shù)據(jù)支持。

2.3 線蟲效應(yīng)蛋白在巨型細胞形成中的作用機制

效應(yīng)蛋白是由病原物產(chǎn)生的能進入寄主細胞，調(diào)控寄主細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫響應(yīng)等功能的生物分子，植物寄生線蟲分泌蛋白，在線蟲侵入時抵御寄主防衛(wèi)反應(yīng)、建立取食位點的一些蛋白質(zhì)或小分子物質(zhì)也屬于效應(yīng)蛋白［90-91］。根結(jié)線蟲食道腺分泌效應(yīng)蛋白，通過口針注射到寄主植物細胞中，可調(diào)控寄主內(nèi)不同的分子途徑、細胞周期、招募或劫持植物的功能效應(yīng)分子，誘導(dǎo)維管細胞再分化形成巨型細胞［92-94］。在寄主植物和根結(jié)線蟲的互作中，已經(jīng)報道了一些關(guān)于效應(yīng)子在巨型細胞的形成中發(fā)揮作用，從而影響植物防御系統(tǒng)的研究［95］。

近年來隨著組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的關(guān)于根結(jié)線蟲巨型細胞相關(guān)的效應(yīng)蛋白相繼報道（表1）。效應(yīng)蛋白通過與寄主蛋白的互作，在植物的物質(zhì)代謝、細胞結(jié)構(gòu)、物質(zhì)運輸以及基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用，參與調(diào)控根結(jié)線蟲巨型細胞的形成。效應(yīng)蛋白參與降解細胞壁。在植物寄生線蟲中第一個鑒定出的相關(guān)效應(yīng)蛋白為β -1,4?Endoglucanase，它可以降解植物細胞壁，打破線蟲寄生的第一道屏障［114］；之后研究人員從根結(jié)線蟲中克隆到具有纖維素酶和果膠酶降解活性的一些基因，這些基因與降解細胞壁相關(guān)；在線蟲侵入時，線蟲也會產(chǎn)生一些功能性的延伸蛋白，有助于線蟲的寄生［115］；爪哇根結(jié)線蟲中克隆的Mj?pel?1，對果膠有高活性，在根結(jié)線蟲侵染早期起重要作用［96］。（1）效應(yīng)蛋白參與調(diào)節(jié)細胞骨架的形成和物質(zhì)運輸。第一個報道這類功能的效應(yīng)蛋白是通過口針分泌到寄主體內(nèi)的鈣網(wǎng)蛋白（Mi?CRT），線蟲在遷移期和靜止期分泌Mi?CRT，并在巨型細胞中聚集，為線蟲食道腺蛋白分泌到取食位點提供證據(jù)［97］；可以促進線蟲寄生的效應(yīng)蛋白MiPFN3，影響寄主中的肌動蛋白的多聚過程，從而影響細胞骨架［98］；北方根結(jié)線蟲和南方根結(jié)線蟲食道腺產(chǎn)生的8D05/Msp9 與寄主植物中的水通道蛋白TIP2 特異性結(jié)合，在線蟲寄生過程中參與調(diào)節(jié)巨型細胞內(nèi)溶質(zhì)和水分子的運輸［99］。（2）線蟲效應(yīng)蛋白與植物靶標蛋白在細胞核中互作的功能研究。一些效應(yīng)蛋白定位在細胞核中，如爪哇根結(jié)線蟲的背腹食道腺中分泌的效應(yīng)蛋白MJ?NULG1a 定位在巨型細胞的細胞核中，在線蟲寄生的過程中起關(guān)鍵作用［100］；南方根結(jié)線蟲可以將效應(yīng)蛋白MiEFF1 和MiEFF18分泌到寄主體內(nèi)，其中MiEFF1 定位在巨型細胞核內(nèi)，與脅迫蛋白、胞質(zhì)甘油醛?3 磷酸脫氫酶相互作用，影響線蟲的寄生［101-102］；而MiEFF18 是根結(jié)線蟲保守的效應(yīng)蛋白，誘導(dǎo)植物根細胞再分化為巨型細胞，并與茄科植物中保守的剪切體SmD1 蛋白互作，通過選擇性剪切影響巨型細胞的形成和線蟲的發(fā)育［103-104］；最近的研究表明南方根結(jié)線蟲效應(yīng)蛋白Mi2G02 與寄主植物的trihelix 轉(zhuǎn)錄因子GT?3 互作，通過調(diào)控下游基因的表達，從而誘導(dǎo)寄主的生長發(fā)育和線蟲取食細胞的形成［105］。（3）效應(yīng)蛋白參與調(diào)節(jié)植物激素。南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲中發(fā)現(xiàn)的分支酸變位酶CM?1/CM?2 參與巨型細胞的分化和取食位點的形成［106］，Mj?CM?1 通過引起對分支酸的競爭來減少吲哚乙酸合成，導(dǎo)致分支酸衍生的代謝物的改變，并最終影響植物細胞的發(fā)育［107］。（4）效應(yīng)蛋白參與細胞代謝。爪哇根結(jié)線蟲和南方根結(jié)線蟲中均可產(chǎn)生的一類脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白FAR?1，在植物中表達時被證明影響植物細胞質(zhì)代謝，促進巨型細胞和線蟲的發(fā)育［108-109］；南方根結(jié)線蟲效應(yīng)蛋白Mi?SBP?1（含有DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域）可調(diào)控寄主的幾種脂肪酸的合成，當(dāng)Mi?sbp?1 基因沉默后巨型細胞中脂肪儲備能力喪失，線蟲發(fā)育減慢，寄生能力降低［110］；最新研究發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲分泌效應(yīng)蛋白MeMSP1 到巨型細胞中，與擬南芥中的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（AtGSTFs）互作，導(dǎo)致寄主谷胱甘肽積累，有利于線蟲的寄生［111］。效應(yīng)子可以對寄主細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄過程重新編程［116］。在多種線蟲的亞腹食道腺發(fā)現(xiàn)效應(yīng)蛋白16D10/Msp16 可以刺激根系生長，并與寄主擬南芥中SCARECROW 類轉(zhuǎn)錄因子（SCARECROW?like transcription factors）AtSCL6 和AtSCL21 互作，誘導(dǎo)巨型細胞形成和維持［112-113］。

表1 根結(jié)線蟲中已報道參與巨型細胞相關(guān)效應(yīng)蛋白Table1 Reported relevant giant cell-associated effectors in root-knot nematodes

3 展望

根結(jié)線蟲誘導(dǎo)寄主植物維管束部分細胞形成巨型細胞，為線蟲自身的生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)。根結(jié)線蟲可誘導(dǎo)數(shù)千種寄主植物形成類似取食位點，這種模式在線蟲和寄主植物相互進化的過程中具有保守性。早期的研究主要集中于寄主的抗性或者是線蟲的生長發(fā)育［117］。近年來，隨著基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及比較基因組的快速發(fā)展，巨型細胞形成的分子機制也得到一定程度的揭示。線蟲-寄主植物互作的報道明顯增加，尤其是對根結(jié)線蟲效應(yīng)因子在調(diào)控寄主免疫反應(yīng)、降解寄主細胞壁、激素相關(guān)的調(diào)控等研究方面取得了實質(zhì)性的進展［77,118］。通過免疫組化的方法，發(fā)現(xiàn)許多效應(yīng)蛋白可以分泌到巨型細胞中，但這些效應(yīng)蛋白的功能及其在巨型細胞形成和維護中的作用仍需要進一步研究，特別是線蟲效應(yīng)蛋白是如何直接或間接地影響巨型細胞的細胞周期。據(jù)推測，一些蛋白可能特異性地激活巨型細胞有絲分裂M 期促進因子的活性或者誘導(dǎo)S 期相關(guān)基因的表達，而另外一些分泌蛋白可能改變巨型細胞中的泛素化途徑來影響細胞周期［119］。這些問題尚需進一步證實。而與細胞壁重塑相關(guān)的線蟲效應(yīng)子或植物基因尚未被鑒定出來，且其在巨型細胞壁的生物合成中的作用仍知之甚少。

借助轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，巨型細胞與正常的維管束細胞中存在著大量的差異表達基因，這些基因的差異表達可能是由于可變剪切機制誘導(dǎo)產(chǎn)生的。最近報道的具有核定位的效應(yīng)子MiEFF18，可以與寄主中的可變剪切體SmD1 蛋白互作，通過RNA?seq 分析該效應(yīng)子發(fā)現(xiàn)，其通過可變剪切的手段影響巨型細胞的發(fā)育［103-104］。然而，植物全基因組可變剪切在根結(jié)線蟲侵染過程中功能的普遍性，以及根結(jié)線蟲效應(yīng)子調(diào)節(jié)可變剪切的機制尚不清楚。根結(jié)線蟲在寄生過程分泌許多核定位的效應(yīng)子，這些效應(yīng)子是否參與調(diào)節(jié)寄主植物細胞基因的可變剪切，進而促進“巨型細胞”形成和干擾植物免疫反應(yīng)也有待進一步驗證。

在巨型細胞的形成過程中各種激素之間相互協(xié)調(diào)，發(fā)揮作用。越來越多的研究表明，線蟲已經(jīng)進化出植物肽激素效應(yīng)模擬物和植物激素，協(xié)調(diào)或調(diào)節(jié)巨型細胞的形成，微調(diào)根系的發(fā)育程序，以促進巨型細胞的形成。根結(jié)線蟲可能通過招募一些基因驅(qū)動多能細胞，誘導(dǎo)這些細胞分化形成巨型細胞，但對線蟲招募的基因了解仍然較少［120］。隨著現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以及基因編輯的大量應(yīng)用，可以找到線蟲互作的植物靶標，通過干擾或者編輯的手段開辟根結(jié)線蟲控制新策略，并進一步開發(fā)應(yīng)用。