丁嘉麗 雷春妮 王波 張繼元 牛育林 何曉麗 張歡 張波，*

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室/甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅蘭州 730070；2蘭州海關(guān)技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730010；3甘肅莫高實業(yè)發(fā)展股份有限公司葡萄酒廠，甘肅 武威 733008）

香氣是決定葡萄酒質(zhì)量的主要指標(biāo)之一，同時也是影響消費者購買意向的重要選擇因素［1］。葡萄酒中已鑒定出數(shù)百種香氣化合物，根據(jù)其來源可分為品種香氣、發(fā)酵香氣和陳釀香氣三類，其中品種香對體現(xiàn)葡萄酒的特點起決定性作用［2］。研究顯示，品種香氣主要由C6/C9化合物、萜烯類［3］、C13降異戊二烯類、揮發(fā)性硫化物和吡嗪類［4］等物質(zhì)組成，反映了葡萄及葡萄酒的品質(zhì)特征和產(chǎn)地屬性等信息［5］。

研究發(fā)現(xiàn)，借助C6/C9化合物（己醛、己醇等）、萜烯類（香茅醇等）和C13降異戊二烯類（β-大馬酮等）化合物可快速區(qū)分不同產(chǎn)地來源的葡萄原料［6-7］，類似的結(jié)果在陳巧迎等［8］的研究中也有報道。同時，因葡萄品種、地理來源等的不同，其釀制的葡萄酒中香氣物質(zhì)構(gòu)成和比例也呈現(xiàn)出較大的差異［9-12］。例如，依據(jù)C6/C9系列物質(zhì)中C6醇類間的比率，可作為溯源單品種葡萄酒原產(chǎn)地的有效工具［11］。此外，萜烯類以及C13降異戊二烯類化合物對葡萄酒的品種香氣也有很大貢獻，可在較低濃度下增強酒體果香。同時，芳樟醇和β-大馬酮還可用來區(qū)分來自不同地區(qū)和年份的葡萄酒［12-13］。盡管已有大量葡萄酒香氣尤其是葡萄酒品種香氣的研究，但大多數(shù)研究均是圍繞造成不同酒樣品種香氣的主要差異化合物展開，有關(guān)化合物與葡萄酒風(fēng)味質(zhì)量間的相關(guān)性聯(lián)系還鮮有報道。

甘肅河西走廊產(chǎn)區(qū)位于甘肅省西北部，具有良好的釀酒葡萄種植自然資源和氣候條件［14］，特別是域內(nèi)武威、張掖、嘉峪關(guān)地區(qū)已形成了一定的種植規(guī)模［15］。然而，由于各種植區(qū)氣候、土壤和栽培條件的不同，不同品種葡萄的質(zhì)量表現(xiàn)存在一定差異，并對相應(yīng)葡萄酒產(chǎn)品也產(chǎn)生了潛在影響［16］。但相關(guān)研究結(jié)果有限，需要更具體的研究分析。

為此，本研究以甘肅河西走廊出產(chǎn)的赤霞珠和美樂干紅葡萄酒為研究試材，以葡萄酒中常見的8種品種香氣物質(zhì)（正己醛、正己醇、葉醇、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇、香茅醇、橙花醇和β-大馬酮）為評價指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化其靜態(tài)頂空-氣相色譜（static headspace gas chromatog raphy，SHS-GC）檢測條件，并針對上述8種重要的風(fēng)味物質(zhì)，分別對來自產(chǎn)區(qū)內(nèi)不同地區(qū)以及年份的赤霞珠和美樂干紅葡萄酒進行風(fēng)味判別分析，以期為葡萄酒香氣成分的定性定量分析提供一定的技術(shù)參考，同時為葡萄酒特征香氣分析提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本試驗收集了來自甘肅河西走廊產(chǎn)區(qū)內(nèi)武威（W）、張掖（Z）和嘉峪關(guān)（J）地區(qū)的赤霞珠（C）和美樂（M）干紅葡萄酒樣品，生產(chǎn)年份為2017—2022年，樣品共計17份，詳見表1。

表1 葡萄酒樣品信息Table 1 Wine sample information

己醛、己醇、葉醇、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇、香茅醇、橙花醇和β-大馬酮（純度均≥98%），上海麥克林生化科技股份有限公司；無水乙醇（色譜純），成都市科隆化學(xué)品有限公司；氯化鈉，天津匯豐化學(xué)試劑廠；酒石酸，天津致遠化學(xué)試劑有限公司；超純水由實驗室純水儀制備。

Clarus600型氣相色譜儀、全自動頂空分析儀、HPINNOWAX毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），美國安捷倫公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 模擬酒溶液的配制 本試驗構(gòu)建模擬葡萄酒環(huán)境，具體配制方法：準(zhǔn)確稱取5 g酒石酸于燒杯中充分?jǐn)嚢枞芙?，加?2%乙醇，定容至1 L，用氯化鈉調(diào)節(jié)模擬溶液的離子強度為0.2 mol·L-1，用氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)至3.6，將配好的溶液置于1 L棕色容量瓶中密封保存。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配置 （1）用模擬酒溶液分別配制濃度為800 mg·L-1的己醛、己醇、葉醇、順-3-壬烯-1-醇、香茅醇、橙花醇、芳樟醇、β-大馬酮單一標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，定容至500 mL容量瓶（棕色）中混勻備用。（2）配制總濃度為800 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，定容至500 mL容量瓶（棕色）中，混勻備用。（3）用模擬酒梯度稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成5、100、300、500、700、800 mg·L-1的系列工作液，混勻備用。

1.2.3 進樣方法的優(yōu)化試驗 選擇對提取揮發(fā)性成分影響較大的樣品量（2、4、6、8、10、12 mL）、平衡溫度（40、50、60、70、80、90 ℃）、平衡時間（10、20、30、40、50、60 min）、進樣時間（20、21、22、23、24、25 s）進行優(yōu)化分析，以總峰面積作為考察指標(biāo)進行單因素試驗。在此基礎(chǔ)上，采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗，因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Box-Behnken response surface test factors and levels

1.2.4 香氣化合物的檢測

1.2.4.1 SHS-GC條件 SHS條件：加壓-置換時間120 s，進樣時間23 s，放空時間20 s，平衡時間20 min，循環(huán)時間75 min；平衡溫度90 ℃，傳輸線溫度105 ℃；載氣壓力220 kPa。

GC條件：HP-INNOWAX毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣為高純氮氣（純度不小于99.999%）；進樣口溫度230 ℃，檢測器溫度240 ℃；恒流流量1 mL·min-1；分流進樣，分流比為1∶1。升溫程序：初始溫度60 ℃，保持2 min；以2.5 ℃·min-1速率升溫至220 ℃，保持5 min。

1.2.4.2 定性和定量方法 分別吸取10 mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液至頂空瓶中，檢測每種香氣化合物的保留時間，依據(jù)色譜保留時間進行定性分析；采用外標(biāo)法進行定量，按上述色譜條件對系列混合標(biāo)液進行測定，以單一香氣的濃度為橫坐標(biāo)、單一香氣的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3 樣品香氣的測定 取10 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液或樣品至頂空瓶中，將頂空瓶壓緊瓶蓋密封，放入頂空進樣器中按儀器工作條件進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均進行3次平行測定，使用Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制；使用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)單因素方差分析；使用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件進行響應(yīng)面試驗中的回歸分析；使用SIMCA-P 11.5軟件進行主成分分析；使用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空氣相色譜法的優(yōu)化

2.1.1 單因素優(yōu)化結(jié)果與分析 由圖1-A可知，隨著樣品量的增加，香氣的總峰面積呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)樣品量為10 mL時，總峰面積逐漸趨于平穩(wěn)，說明樣品量為10 mL時香氣的揮發(fā)量趨于飽和，頂空分析物的濃度較高。由圖1-B可知，隨著平衡溫度的升高，香氣的總峰面積逐漸增大，90 ℃時響應(yīng)值最大，說明在該溫度下從樣品中釋放到頂空的氣體較多，氣化較完全，定量結(jié)果也比較準(zhǔn)確。但將平衡溫度增加到90 ℃以上時，不僅會導(dǎo)致水揮發(fā)進色譜柱，影響色譜柱的使用壽命，還會引入過多雜質(zhì)而干擾峰形。綜合考慮，選擇平衡溫度為90 ℃效果最佳。由圖1-C可知，隨著平衡時間的增加，香氣總峰面積先上升后逐漸趨于平穩(wěn)，最后開始緩慢下降。該現(xiàn)象的出現(xiàn)，說明樣品在20～30 min時，兩相達到了平衡狀態(tài)，但30 min后平衡時間過長導(dǎo)致頂空瓶的氣密性變差，使目標(biāo)物定量的準(zhǔn)確性降低。由圖1-D可知，23 s后香氣總峰面積的變化趨于平穩(wěn)，說明被提取的揮發(fā)性香氣的量逐漸穩(wěn)定。根據(jù)試驗結(jié)果，初步選取樣品量10 mL、平衡溫度90 ℃、平衡時間20 min、進樣時間23 s為單因素最佳水平。

圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1 Single-factor test results

2.1.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析 響應(yīng)面試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。以香氣物質(zhì)的總峰面積（Y）為響應(yīng)值的二次多項式回歸方程如下：

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis

Y=7.744×106+64 583.330A+7.673×105B+2.832×105C+1.466+2.832×105D+4 230.000AB+250.000AC-4 750.000AD-2.260×105BC-1.902×105BD-3.739×105CD-4.199

由表4可知，該二次多項式回歸模型差異極顯著，失擬項不顯著。模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj為0.96，說明該模型的擬合度良好，可用于對模擬酒中的香氣物質(zhì)進行分析與預(yù)測。B、C、D的F值較大，表明平衡溫度、平衡時間以及進樣時間對香氣的揮發(fā)有較大影響。BC、BD和CD的F值較大且P＜0.05，表明平衡溫度與平衡時間和進樣時間之間的交互作用明顯，它們的等高線圖如圖2-D、E所示。圖2中所示結(jié)果與表4一致。

圖2 交互作用對揮發(fā)效果影響的等高線及響應(yīng)面圖Fig.2 Contour and response surface diagram of the interaction of various factors on volatilization effect

利用Design-Expert軟件對數(shù)據(jù)進行分析優(yōu)化，得到最佳進樣條件：樣品量10.15 mL、平衡溫度90 ℃、平衡時間21.91 min，進樣時間23.06 s。為方便實際操作，對試驗條件進行簡化，選取樣品量10 mL、平衡溫度90 ℃、平衡時間22 min、進樣時間23 s。根據(jù)響應(yīng)面試驗預(yù)測結(jié)果結(jié)合實際條件進行3次模型驗證試驗，香氣的總峰面積為7.71×106μV·s，與理論值基本相符。因此，該模型能較真實準(zhǔn)確地反映各因素對香氣揮發(fā)的影響。

2.1.3 方法評價 由表5可知，各目標(biāo)化合物在檢測范圍內(nèi)線性關(guān)系較強（R2≥0.992），且8種香氣成分都具有較低的檢出限和定量限，保證了對微量目標(biāo)化合物的靈敏度和可靠性，可以滿足對8種供試物質(zhì)的定量測定分析要求。

表5 線性范圍、檢出限、定量限測定結(jié)果Table 5 Determination results of linear range detection limit and quantitative limit

以市售葡萄酒為試驗對象，驗證該方法的準(zhǔn)確度。由表6可知，8種香氣物質(zhì)的回收率為70%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.7%～4.3%，說明方法準(zhǔn)確度和精密度良好［17-19］，能保證分析結(jié)果的可靠性，可滿足測試需求。

表6 加標(biāo)回收率和精密度測定結(jié)果Table 6 Determination of results of recovery rate and precision of standard addition

2.2 葡萄酒樣品的香氣差異

2.2.1 不同品種葡萄酒香氣差異 由圖3可知，無監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA）下兩個品種的葡萄酒分布略有差異，無法完全區(qū)分兩個釀酒葡萄品種的揮發(fā)性物質(zhì)，因此還需進行有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis，OPLS-DA）。

圖3 基于不同品種的散點圖（A）和雙標(biāo)圖（B）Fig.3 PCA-scatter plot （A） and PCA-biplot （B） based on different varieties

如圖4所示，OPLS-DA模型能將赤霞珠和美樂的葡萄酒樣品區(qū)分開來，且擬合模型預(yù)測成分的累計統(tǒng)計量R2X=0.977、模型解釋率參數(shù)R2Y=0.84、預(yù)測能力參數(shù)Q2=0.81，均大于0.5，表示OPLS-DA模型對葡萄酒揮發(fā)性香氣分析的預(yù)測能力較好。由圖4-A可知，赤霞珠葡萄酒酒樣位于PC1的負半軸，美樂葡萄酒酒樣位于PC1的正半軸。由圖4-B可知，正己醇、香茅醇、葉醇和β-大馬酮位于PC1的負半軸，說明其與赤霞珠葡萄酒香氣相關(guān)性較高，能賦予葡萄酒青草香、檸檬、柑橘香以及蜂蜜香。正己醛、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇和橙花醇位于PC1的正半軸，與美樂葡萄酒香氣相關(guān)性較高，賦予葡萄酒薰衣草香、玫瑰香、柑橘香和青草香。

圖4 基于不同品種的OPLS-DA模型分析Fig.4 OPLS-DA model analysis based on different varieties

2.2.2 不同地區(qū)葡萄酒香氣差異 不同地區(qū)赤霞珠葡萄的主成分分析結(jié)果如圖5-A和B所示，前2個主成分的累積貢獻率為91.3%，可反映較多的數(shù)據(jù)變化信息，且3個地區(qū)的葡萄酒可以得到較好的區(qū)分。由圖5-B可知，橙花醇位于PC1和PC2的正半軸，與武威地區(qū)的葡萄酒樣品相關(guān)性較強，為葡萄酒提供玫瑰花香和柑橘香［20］；順-3-壬烯-1-醇和正己醇位于PC1的正半軸和PC2的負半軸，與嘉峪關(guān)的葡萄酒有較強的相關(guān)性，賦予葡萄酒新鮮的青草香；而β-大馬酮、香茅醇、葉醇和正己醛位于PC1和PC2的負半軸，與張掖的葡萄酒相關(guān)性較高，賦予葡萄酒蜂蜜味、檸檬、柑橘香以及青草香［21］。

圖5 基于不同地區(qū)的PCA模型分析Fig.5 PCA model analysis based on different producing areas

不同地區(qū)美樂葡萄的主成分分析結(jié)果如圖5-C和D所示，前2個主成分的累積貢獻率為88.9%，并且3個地區(qū)的葡萄酒也得到較好的區(qū)分。由圖5-D可知，橙花醇和芳樟醇與武威產(chǎn)區(qū)的葡萄酒有較高的相關(guān)性，賦予葡萄酒薰衣草香、玫瑰香、柑橘香和青草香；正己醛與張掖的葡萄酒有較高的相關(guān)性，能賦予葡萄酒清新的青草香；而葉醇、順-3-壬烯-1-醇和正己醇與嘉峪關(guān)的葡萄酒有較高的相關(guān)性，能為葡萄酒提供青草香。

綜上所述，武威產(chǎn)區(qū)葡萄酒的特征香氣成分為橙花醇，賦予葡萄酒柑橘、檸檬和玫瑰香，而張掖和嘉峪關(guān)的葡萄酒的特征香氣成分分別為正己醛和正己醇，它們能為葡萄酒提供草藥香和植物香。

2.2.3 不同年份葡萄酒差異 由圖6-A可知，根據(jù)不同貯藏年份所在象限不同，將赤霞珠葡萄酒香氣輪廓分為3個階段：貯藏期1～2年、貯藏期2～3年和貯藏期4～6年。由圖6-B可知，正己醛和橙花醇與貯藏期1～2年的葡萄酒有較高的相關(guān)性，能帶給葡萄酒青草香、柑橘香和玫瑰香。葉醇、β-大馬酮和香茅醇與貯藏期2～3年的葡萄酒有較高的相關(guān)性，能帶給葡萄酒青草香、蜂蜜香以及檸檬、柑橘香。順-3-壬烯-1-醇和正己醇與貯藏期4～6年的葡萄酒有較高的相關(guān)性，能給葡萄酒帶來清新的青草香。

由圖6-C可知，根據(jù)不同貯藏年份所在象限的不同，將美樂葡萄酒香氣輪廓分為2個階段：貯藏期1～3年和貯藏期4～6年。由圖6-D可知，正己醛、橙花醇和芳樟醇與貯藏期1～3年的葡萄酒有較高的相關(guān)性，它們給葡萄酒帶來薰衣草香、玫瑰香、柑橘香、檸檬香以及青草香。順-3-壬烯-1-醇、葉醇和正己醇與貯藏期4～6年的葡萄酒有較高的相關(guān)性，它們能帶給葡萄酒較為濃郁的青草香。

綜上所述，在赤霞珠和美樂酒樣中，貯藏期較短的酒樣與C6/C9化合物、降異戊二烯類化合物和萜烯類化合物的相關(guān)性較強，而陳年的酒樣僅與C6/C9化合物呈現(xiàn)較好的相關(guān)性。

3 討論

葡萄酒香氣成分的組成與葡萄品種、產(chǎn)區(qū)環(huán)境以及葡萄酒的貯藏年份等因素相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同品種、不同地區(qū)和不同年份的葡萄酒呈現(xiàn)出不同的香氣特征。很多葡萄果實中特有的品種香在發(fā)酵過程中基本不受影響或僅發(fā)生細微變化，得以保留于葡萄酒中，可用于區(qū)分不同品種的葡萄酒。本研究基于正己醛、正己醇、葉醇、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇、香茅醇、橙花醇和β-大馬酮8種品種香建立的OPLSDA模型可以將赤霞珠和美樂葡萄酒樣品區(qū)分開，并且通過對不同品種酒樣的香氣差異分析，發(fā)現(xiàn)赤霞珠葡萄酒香與正己醇、香茅醇、葉醇和β-大馬酮有較高的相關(guān)性，這與夏鴻川等［22］的研究結(jié)果有較好的一致性，即赤霞珠葡萄酒中的品種香有正己醇、芳樟醇和β-大馬酮等，美樂葡萄酒香氣與正己醛、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇和橙花醇相關(guān)性較高。Zhang等［23］采用固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用（solid phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）技術(shù)對美樂葡萄酒的揮發(fā)性香氣進行了定性定量分析，發(fā)現(xiàn)美樂葡萄酒中芳樟醇和葉醇的氣味活性值（odour active value，OAV）＞1，對葡萄酒整體香氣貢獻率較大，此外，前人研究還發(fā)現(xiàn)美樂葡萄酒中的正己醛含量高于赤霞珠葡萄酒［24］。

然而，同一品種下不同地區(qū)和不同年份的葡萄酒也表現(xiàn)出較大差異。與Xie等［25］的研究類似，即C6/C9化合物、降異戊二烯類化合物和萜烯類化合物可以較好地區(qū)分不同地區(qū)的赤霞珠和美樂葡萄酒。通過對葡萄酒地區(qū)與香氣的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)武威產(chǎn)區(qū)葡萄酒的特征香氣成分為橙花醇，而張掖和嘉峪關(guān)葡萄酒的特征香氣成分分別為正己醛和正己醇，造成這種差異的原因可能是這三個地區(qū)的氣候條件不同。例如，萜烯類化合物含量與降水量呈正相關(guān)，而高溫和強光照下的C6/C9化合物含量較高［26］。同時近幾年的氣象資料表明，張掖的有效積溫高于嘉峪關(guān)和武威，武威的降水量大于張掖和嘉峪關(guān)。由此推測張掖地區(qū)葡萄酒的C6/C9化合物（正己醇）含量較高，武威產(chǎn)區(qū)葡萄酒的萜烯類化合物（橙花醇）含量較高。同一品種下的不同年份葡萄酒香氣也存在較大差異。這可能是因為C6醇很難被酵母代謝，其含量在酒精發(fā)酵過程中處于比較穩(wěn)定的狀態(tài)，而萜烯和C13-降異戊二烯類化合物含量在發(fā)酵結(jié)束和儲存期間呈現(xiàn)出減少的趨勢［27-28］，因此貯藏期較短的赤霞珠和美樂酒樣與萜烯類化合物、C13-降異戊二烯類化合物和C6/C9化合物相關(guān)性較高，而陳年的酒樣僅與C6/C9化合物密切相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，樣品量10 mL、平衡溫度90 ℃、平衡時間22 min、進樣時間23 s的組合SHS-GC進樣條件可提高葡萄酒香氣物質(zhì)定性定量結(jié)果的靈敏度與準(zhǔn)確性。赤霞珠葡萄酒香氣與正己醇、香茅醇、葉醇和β-大馬酮有較高的相關(guān)性，而美樂葡萄酒香氣與正己醛、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇和橙花醇相關(guān)性較高；不同地區(qū)干紅葡萄酒與香氣物質(zhì)顯示，武威、張掖和嘉峪關(guān)地區(qū)葡萄酒香氣分別與橙花醇、正己醛、正己醇密切相關(guān)；不同年份干紅葡萄酒與香氣物質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn)，貯藏期1～3年的產(chǎn)品與C6/C9化合物、降異戊二烯類化合物和萜烯類化合物相關(guān)性較強，貯藏期4～6年的酒樣僅與C6/C9化合物呈現(xiàn)較好的相關(guān)性。