朱金燕，胡華鵬，云艷嬌，劉明

1 云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南昆明 650500

2 昆明市中醫(yī)醫(yī)院 云南昆明 650011

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）簡稱慢阻肺，是一種復(fù)雜的呼吸系統(tǒng)疾病，以氣流受限不完全可逆、氣道慢性炎癥及肺氣腫破壞為主要特征，且與吸入有害顆粒或氣體及異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]?，F(xiàn)COPD以藥物治療為主，如糖皮質(zhì)激素、祛痰藥及支氣管擴(kuò)張藥等，然而臨床療效并未令人滿意，且具有容易引起不良反應(yīng)，如感染和免疫抑制[2]，故進(jìn)一步明確發(fā)病機(jī)制，尋找新的干預(yù)手段是必要的。COPD屬于中醫(yī)“肺脹”范疇，作為一種進(jìn)行性發(fā)展疾病，中醫(yī)中藥在改善患者肺功能、減輕臨床癥狀、控制炎癥反應(yīng)、提高生活質(zhì)量等方面有較好的療效與優(yōu)勢(shì)[3-4]。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化失衡的一種狀態(tài)，以氧化為主導(dǎo)，可導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和組織損傷[5]。吸煙作為引起COPD最常見的危險(xiǎn)因素，香煙煙霧是誘發(fā)患者氣道內(nèi)氧化應(yīng)激的主要原因。煙霧中的氧化劑會(huì)分解肺部結(jié)締組織，致肺泡支架結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)肺氣腫[6]；此外氧化劑還可通過損害肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬能力來延遲炎癥的消退[7]。近年來越來越多的研究強(qiáng)調(diào)了氧化應(yīng)激在各種疾病發(fā)生發(fā)展中的重要性[8-10]。但針對(duì)COPD中的氧化應(yīng)激差異基因的研究較少，基于此本研究綜合運(yùn)用生物信息學(xué)分析，探索氧化應(yīng)激對(duì)COPD的發(fā)展作用，同時(shí)鑒定中心基因和治療中藥，以對(duì)疾病的診療提供新的見解。

材料與方法

1 數(shù)據(jù)下載與預(yù)處理

從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載COPD系列矩陣文件及平臺(tái)文件，選取基因集GSE10006作為實(shí)驗(yàn)組，基因集GSE76925作為驗(yàn)證組。數(shù)據(jù)集具體信息見表1。

表1 GEO數(shù)據(jù)集具體信息

2 獲取氧化應(yīng)激差異表達(dá)基因

使用R語言中的“l(fā)imma”包，設(shè)置adj.P value＜0.05，|logFC|>1.0，篩選疾病組與正常組間的差異表達(dá)基因（DEG）。同時(shí)，從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取氧化應(yīng)激基因，保留Relevance score≥7的基因。最后，計(jì)算兩者交集確定氧化應(yīng)激差異表達(dá)基因（DEOSGs）。

3 富集分析

使用R語言的“org.Hs.eg.db”及“clusterProfiler”包對(duì)1.2中得到的DEOSGs分別進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。選擇從MSigDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.gseamsigdb.org/gsea/downloads.jsp）下載的“c2.cp.kegg.v7.5.1.entrez.gmt”和“c5.bp.v7.5.1.entrez.gmt”子集合作為參考基因集進(jìn)行基因集變異分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）分析，設(shè)置排列檢驗(yàn)1000次，P＜0.05。

4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將DEOSGs導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/）構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。使用Cytoscape軟件（版本3.9.1）中的CytoHubba插件、MCODE插件獲得候選中心基因；其中CytoHubba采用MCC算法，MCODE使用了默認(rèn)參數(shù)（Degree Cutoff=2、Node Score Cutoff=0.2、K-Core=2和Max Depth=100）。

5 中心基因鑒定

基于驗(yàn)證組評(píng)估候選中心基因的準(zhǔn)確性；使用“l(fā)imma”包對(duì)候選基因進(jìn)行差異分析，結(jié)果以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)使用R中“pROC包”分析受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC），評(píng)估候選基因在COPD診斷中的作用，以曲線下面積（Areas Under Curve，AUC）>0.65為標(biāo)準(zhǔn)。評(píng)估兩者結(jié)果確定中心基因。

6 免疫浸潤分析

運(yùn)用CIBERSORT（https：//cibersort.stanford.edu/）進(jìn)行分析，采用反卷積算法處理標(biāo)記基因表達(dá)值，設(shè)置P＜0.05，評(píng)估正常和COPD肺組織中22種免疫細(xì)胞的比例。

7 中心基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步明確中心基因與免疫細(xì)胞的關(guān)系，我們運(yùn)用R語言中的 “ggExtra”和“ggpubr”包，設(shè)置P＜0.05，進(jìn)行中心基因的表達(dá)與免疫細(xì)胞相對(duì)比例的相關(guān)性研究。

8 中藥預(yù)測

通過Coremine（https：//coremine.com/medical/）數(shù)據(jù)庫對(duì)中心基因進(jìn)行中藥預(yù)測，設(shè)置P＜0.05。并用Cytoscap 3.9.1構(gòu)建“靶點(diǎn)-中藥”網(wǎng)絡(luò)。使用《中國藥典》2020年版對(duì)預(yù)測中藥進(jìn)行性味、歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)整理，并將結(jié)果使用雷達(dá)圖展示。

結(jié)果

1 DEGs與DEOSGs獲取

共獲得104個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因65個(gè)，下調(diào)基因39個(gè)，根據(jù)校正后的P值，將差異程度較大的前25個(gè)上調(diào)和下調(diào)基因用熱圖展示（圖1A），并通過火山圖展示所有差異基因（圖1A）。從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得824個(gè)氧化應(yīng)激基因，通過韋恩分析得到13個(gè)氧化應(yīng)激差異表達(dá)基因（圖1C），其中上調(diào)基因9個(gè)，下調(diào)基因4個(gè)（圖1D）。

圖1 DEGs與DEOSGs相關(guān)結(jié)果A：DEGs的聚類熱圖；B：DEGs分布火山圖；C：維恩圖，顯示DEOSGs；D：DEOSGs分布火山圖

2 富集分析結(jié)果

為了分析差異表達(dá)的氧化應(yīng)激基因的潛在生物學(xué)功能，我們進(jìn)行了GO、KEGG富集分析?？偣哺患?16個(gè)生物過程（BPs），21個(gè)細(xì)胞成分（CCs），81個(gè)分子功能（MFs）和24個(gè)KEGG途徑。GO結(jié)果表明DEOSGs主要參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂多糖、血液微粒子、質(zhì)膜等（圖2A、B）；KEGG結(jié)果提示DEOSGs與動(dòng)脈硬化、利什曼病及AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用等通路相關(guān)（圖2C、D）。為進(jìn)一步探索DEOSGs與COPD相關(guān)的關(guān)鍵生物學(xué)信息途徑，我們進(jìn)行了GSEA分析，最終在吞噬體、急性炎癥反應(yīng)、乳腺癌、Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑等通路上得到富集（圖4）。

圖2 GO與KEGG富集結(jié)果（A和B：GO分子功能富集結(jié)果；C和D：KEGG通路富集結(jié)果）

3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析與候選中心基因的鑒定

將DEOSGs導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫后，得到由13個(gè)節(jié)點(diǎn)和25條連線組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖3A所示。通過Cytoscape軟件的CytoHubba插件提取了網(wǎng)絡(luò)中中介值排名前10的基因（圖3B），分別為：CCL2、PPARG、ITGAM、FN1、FOS、EGR1、ALOX5、NOS2、TREM2、CYP1A1，圖中基因顏色越深，代表該基因中介值越高，在網(wǎng)絡(luò)中越處于核心位置。使用MCODE插件尋找關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，選取網(wǎng)絡(luò)分?jǐn)?shù)最高（5.600）的模塊作為目標(biāo)子網(wǎng)絡(luò)，其由6個(gè)節(jié)點(diǎn)和28條連線組成（圖4），包含基因是：FN1、FOS、PPARG、ITGAM、EGR1、CCL2。因此CCL2、PPARG、ITGAM、FN1、FOS、、EGR1為候選中心基因。

圖3 GSEA富集分析結(jié)果

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)

4 中心基因的鑒定

GSE76925作為驗(yàn)證數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析及ROC曲線分析，設(shè)置P＜0.05，AUC≥0.65，結(jié)果見圖5，可見FN1及PPARG通過了兩種驗(yàn)證方式，將其納入中心基因，表明它們對(duì)COPD患者診斷能力具有較強(qiáng)特異性和敏感性。

圖5 通過驗(yàn)證的2個(gè)中心基因相對(duì)表達(dá)量和ROC曲線

5 免疫細(xì)胞浸潤分析

利用CIBERSORT算法，我們首先計(jì)算了COPD組和正常組樣品在22種免疫細(xì)胞浸潤的比例（圖6A）。其中，活化的肥大細(xì)胞與中性粒細(xì)胞之間正相關(guān)性最強(qiáng)（r＝0.54）；活化的肥大細(xì)胞與未活化的肥大細(xì)胞之間負(fù)相關(guān)性最強(qiáng)（r＝-0.49）（圖6B）。差異表達(dá)顯示，與正常組相比，未活化的肥大細(xì)胞在COPD組織中的浸潤程度明顯增高；活化的肥大細(xì)胞浸潤較低（圖6C）。因此，活化的肥大細(xì)胞與未活化的肥大細(xì)胞可能是潛在的核心免疫細(xì)胞，參與COPD的發(fā)生發(fā)展。

圖6 CIBERSORT分析結(jié)果

6 中心基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析

將得到的兩個(gè)中心基因與22種免疫細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)，中心基因與9種免疫細(xì)胞存在相關(guān)性。其中M0巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞與FN1呈正相關(guān)；初始B細(xì)胞、漿細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞與FN1呈負(fù)相關(guān)。嗜酸性粒細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞與PPARG呈正相關(guān)；未活化的肥大細(xì)胞、未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、漿細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與PPARG呈負(fù)相關(guān)。具體見圖7。

圖7 2個(gè)中心基因的表達(dá)水平與9種免疫細(xì)胞相對(duì)比例的相關(guān)性（P＜0.05）

7 中藥及化合物預(yù)測與分子對(duì)接

通過檢索Coremine數(shù)據(jù)庫，預(yù)測具有潛在干預(yù)COPD氧化應(yīng)激的中藥，符合P＜0.05的有桑葉、天南星、人參、澤瀉、木香、蓖麻子、丹參、大黃等43味中藥，見表2，根據(jù)P值的大?。≒值越小則關(guān)聯(lián)性越強(qiáng)），排名前5的有人參、大黃、天南星、木香、蘄蛇，見表2、圖8。將43味中藥導(dǎo)入Cytoscape3.9.1構(gòu)建“靶點(diǎn)-中藥”網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)其進(jìn)行性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，其中四氣以溫、寒、微溫、微寒為主；五味以甘、苦、辛為主；主要?dú)w肝、肺、脾、胃、腎經(jīng)，見圖9。

圖8 基因-中藥網(wǎng)絡(luò)圖

圖9 性味、歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)圖

表2 預(yù)測中藥匯總表

討論

COPD是全球第三大死因，盡管過去十年在診斷和治療選擇方面取得了重大進(jìn)展，但每年仍有24多萬人死于這種使人衰弱的疾病[11]。鑒于缺乏有價(jià)值的生物標(biāo)志物，早期診斷COPD非常困難的，這種現(xiàn)象進(jìn)一步導(dǎo)致不良的臨床結(jié)果。最近愈來愈多的文獻(xiàn)表明，氧化應(yīng)激和多種肺系疾病相關(guān)，如急性肺損傷、肺癌和肺囊性纖維化等[12-14]。然而有關(guān)氧化應(yīng)激與COPD的生物信息學(xué)研究并不突出。在本文章中，我們獲取了13個(gè)DEOSGs，證實(shí)了COPD中確實(shí)存在氧化應(yīng)激，并與免疫反應(yīng)有關(guān)。

富集分析提示，DEOSGs主要與激素水平的調(diào)節(jié)、活性氧代謝過程、對(duì)缺氧的反應(yīng)等生物學(xué)過程有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)與先前發(fā)現(xiàn)的COPD相關(guān)因素一致。先前的研究已經(jīng)注意到氧化應(yīng)激是COPD的主要發(fā)病驅(qū)動(dòng)機(jī)制之一，由于香煙煙霧和空氣污染中的外源性活性氧以及肺部炎癥和結(jié)構(gòu)細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性活性氧增多，會(huì)造成氣道上皮細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增生，致肺功能下降[15]。涉及通路“脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化”、“糖尿病并發(fā)癥中的AGE信號(hào)通路”、“IL-17信號(hào)通路” 等，動(dòng)脈粥樣硬化和COPD作為相互影響的全身性炎癥性疾病，有研究表明COPD在動(dòng)脈粥樣硬化性動(dòng)脈疾病患者中非常普遍，脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路可能是干預(yù)兩者的核心通路[16]。GSEA分析從整體上提示，Wnt信號(hào)通路在COPD中起重要作用。有研究[17]發(fā)現(xiàn)使用GSK3抑制劑激活Wnt通路，可以減弱香煙煙霧誘導(dǎo)的肺部炎癥和損傷從而治療COPD。

通過進(jìn)一步差異分析和ROC曲線分析，確定了2個(gè)中心基因。纖維連接蛋白1（FN1）屬于FN家族的成員，是一種存在于細(xì)胞外中的糖蛋白，參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程[18-19]。近年來，有研究表明FN1可影響人體免疫微環(huán)境，可以作為早期檢測氣道重塑的生物標(biāo)志物[20]。Pei[21]等觀察到FN1與香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素抵抗密切相關(guān)。PPARG是一類由配體調(diào)節(jié)的核激素受體[22]。Zhao[23]等研究發(fā)現(xiàn)PPARG在肺腺癌患者體內(nèi)表達(dá)下調(diào)，激活PPARG可能是治療肺腺癌的有效治療策略；且有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明PPARG細(xì)胞具有顯著的活性氧，提示PPARG會(huì)參與體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]。此前鮮有FN1、PPARG與COPD之間的相關(guān)報(bào)道，這些研究增加了中心基因的可信度，并提示FN1、PPARG可作為COPD的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。此外，我們發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞在COPD與普通人群中存在差異，而PPARG與肥大細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，這為進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。

COPD屬于中醫(yī)“肺脹”“喘證”“咳嗽”等范疇，病位在肺，與脾腎相關(guān)，本虛、肺氣郁結(jié)或復(fù)感外邪是其發(fā)病的主要機(jī)制。通過對(duì)COPD氧化應(yīng)激相關(guān)的中心基因進(jìn)行中藥預(yù)測，結(jié)果提示人參、大黃、天南星、木香、蘄蛇等5味中藥可能是針對(duì)COPD患者具有突出治療作用的靶向中藥。Sun等[25]通過體外實(shí)驗(yàn)證明人參的活性成分人參皂苷Rg1可減輕氧化應(yīng)激損傷；薛偉棟等[26]發(fā)現(xiàn)木香的有效成分木香烴內(nèi)酯可通過抑制p53 信號(hào)通路從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。四氣五味結(jié)果提示，藥物多寒溫并用，甘苦互施，COPD患者在穩(wěn)定期、后期以本虛為主，而甘能補(bǔ)能緩，主入脾經(jīng)，補(bǔ)后天之本。歸經(jīng)主歸肝、肺、脾經(jīng)，由于COPD患者咳嗽咳痰經(jīng)久不愈，致使肺臟虛損，子盜母氣，則脾臟受累，運(yùn)化失職，致痰飲內(nèi)生，病久則累及至腎，致腎不納氣。《丁甘仁醫(yī)案》指出：“肺若懸鐘，撞之則鳴，水虧不能涵木，木叩金鳴”，日久腎病及肝，母病及子，則肝腎陰虛，虛火上炎犯肺發(fā)為病?？梢姳狙芯克A(yù)測中藥與受廣泛認(rèn)可的COPD的中醫(yī)治療用藥基本相符，為臨床選藥提高新的配伍。

綜上，本研究肯定了氧化應(yīng)激在COPD中的作用，通過相關(guān)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了13個(gè)DEOSGs，最終鑒定了2個(gè)中心基因，并預(yù)測了相關(guān)治療中藥。然而本研究仍存在一定的局限性，首先本研究樣本量較小，且沒有考慮種族差異和細(xì)胞多樣性，其次受回顧性分析的限制，我們?nèi)狈?duì)研究數(shù)據(jù)中重要臨床信息的分析。未來需要更大規(guī)模的前瞻性研究來驗(yàn)證我們的結(jié)論。