趙藍,李鎮(zhèn)文,鐘振通,詹麗英,高文蔚

腦缺血再灌注損傷是指腦組織在恢復血流后損傷不但未能減輕反而會加速誘導細胞死亡的現(xiàn)象[1-3]。已有研究表明當原代神經(jīng)元被給予缺氧1 h復氧6 h處理,模擬腦缺血再灌注損傷早期時,核受體共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4, NCOA4)介導的鐵自噬—死亡可加重細胞損傷[4]。前期實驗亦表明再灌注早期cGAS-STING通路激活后NCOA4介導的鐵自噬能導致神經(jīng)損害[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes, STING)具有與鐵自噬蛋白NCOA4直接作用的結合位點,可促進游離鐵的釋放誘發(fā)鐵死亡[6-7]。同時STING還可通過構象變化與自噬相關蛋白LC3作用介導細胞自噬并放大氧化應激損傷[8]。因此新近觀點認為鐵自噬—死亡是一個動態(tài)連續(xù)變化過程,其中氧化應激是誘導機體鐵自噬—死亡的始動因素,而鐵死亡則是一種自噬依賴的細胞死亡方式[9-11]。前期研究已證實再灌注早期鐵自噬可加重腦損傷,本研究旨在探討在復氧后期環(huán)鳥苷酸—腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)-STING(cGAS-STING)通路調控NCOA4介導的鐵自噬在HT22細胞缺氧復氧損傷中的作用,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)HT22細胞系:HT22細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司(CL-0697); (2) 試藥試劑:NCOA4慢病毒購自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司;活性氧(ROS)檢測試劑盒(編號:S0033S)、細胞計數(shù)法(CCK-8)試劑盒(編號:C0037)、乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒(編號:C0016)及丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(編號:S0131S)均購自碧云天生物技術有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(編號:A001)購自南京建成生物工程研究所;鐵含量檢測試劑盒(編號:MAK025)購自Sigma-Aldrich;(3)儀器設備:酶標儀(PerkinElmer, EnSight)、熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS, IX71)、化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD, ChemiDoc)。

1.2 實驗方法 2020年9月—2022年12月于武漢大學人民醫(yī)院中心實驗室進行實驗。細胞分組及處理:將HT22細胞系隨機分為4組(n均=6),對照組(Ctrl組)、缺氧復氧組(HR組)、缺氧復氧+RU.521組(HR+RU組)、缺氧復氧+RU.521+NCOA4過表達組(HR+RU+NCOA4組)。除Ctrl組外其他3組均需在無糖缺氧條件下培養(yǎng)6 h再復糖復氧培養(yǎng)24 h構建缺氧復氧模型(對照組在常氧培養(yǎng)箱中使用含糖培養(yǎng)液,培養(yǎng)時間相同),HR+RU組及HR+RU+NCOA4組提前給予cGAS抑制劑RU.521(美國MCE公司)3.0 μmol/L處理24 h后構建缺氧復氧模型,HR+RU+NCOA4組于缺氧復氧前5 d給予NCOA4慢病毒轉染(上海吉凱公司)。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 免疫熒光檢測ROS:根據(jù)說明書要求配置DCFH-DA工作液(上海碧云天公司),提前1 d取各組處理后細胞接種于6孔板中,37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),觀察細胞生長情況至其匯合度適宜后去除培養(yǎng)基,并用PBS緩沖液洗滌以減少培養(yǎng)基等物質對實驗結果的干擾,吸除洗滌緩沖液后添加工作液,37℃培養(yǎng)箱內孵育30 min,隨后吸去工作液,用 PBS 緩沖液洗滌 2～3 次,最后用 PBS 覆蓋細胞,熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 ELISA法檢測CCK8、LDH釋放量、MDA、SOD 及亞鐵離子含量:不同處理組細胞復糖復氧培養(yǎng)24 h后將細胞樣品處理并收集裂解后的細胞上清液,根據(jù)實驗需求準備并配制所需工作液,將細胞上清液與工作液混勻并孵育,反應充分后應用酶標儀于不同波長處檢測樣品吸光度,根據(jù)吸光度值計算樣品中目標物質的濃度或含量,具體包括細胞活力CCK8、LDH釋放量、MDA、SOD及亞鐵離子含量。

1.3.3 Western blot檢測cGAS-STING通路及鐵自噬相關蛋白:不同處理組細胞復糖復氧培養(yǎng)24 h后胰酶消化取樣提取蛋白,根據(jù)蛋白濃度確定適宜上樣量隨即進行電泳分離,應用電轉儀將分離的蛋白轉移到PVDF膜上,并使用封閉液進行處理。隨后在4℃搖床上用一抗(各檢測指標相應一抗的稀釋比例為:cGAS(1∶500,武漢愛博泰克)、STING(1∶1 000,武漢三鷹)、NCOA4(1∶500,上海愛必信)、LC3B(1∶1 000,美國CST)、鐵蛋白(1∶1 000,英國Abcam))孵育過夜, TBST洗滌掉未結合的抗體,并用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育60 min后再次用TBST洗滌,使用顯影液顯影并觀察蛋白的表達水平。

2 結 果

2.1 各組HT22細胞氧化應激指標比較 與Ctrl組比較,HR組細胞中ROS、MDA升高,SOD降低(P<0.05);與HR組比較,HR+RU組ROS、MDA降低,SOD升高(P<0.05);與HR+RU組比較,HR+RU+NCOA4組ROS、MDA升高,SOD降低(P<0.05),見表1。

表1 各組HT22細胞氧化應激指標比較

2.2 各組細胞活力與LDH含量比較 與Ctrl組比較,HR組HT22細胞中CCK8降低,LDH增多(P<0.05);與HR組比較,HR+RU組CCK8升高、LDH降低(P<0.05);與HR+RU組比較,HR+RU+NCOA4組CCK8降低,LDH升高(P<0.05),見表2。

表2 4組HT22細胞活力與LDH含量比較

2.3 各組HT22細胞中鐵自噬蛋白表達比較 與Ctrl組比較,HR組細胞中NCOA4、LC3B表達升高(P<0.05);與HR組比較,HR+RU組NCOA4、LC3B降低(P<0.05);與HR+RU組比較,HR+RU+NCOA4組NCOA4、LC3B表達升高(P<0.05),見表3。

表3 4組HT22細胞鐵自噬蛋白的表達比較

2.4 各組HT22細胞中鐵蛋白及亞鐵離子的表達比較 與Ctrl組比較,HR組細胞鐵蛋白、亞鐵離子升高(P<0.05);與HR組比較,HR+RU組鐵蛋白升高、亞鐵離子降低(P<0.05);與HR+RU組,HR+RU+NCOA4組鐵蛋白降低,亞鐵離子升高(P>0.05),見表4。

表4 各組HT22細胞中鐵蛋白及亞鐵離子的表達比較

2.5 各組HT22細胞cGAS-STING通路的表達比較 與Ctrl組比較,HR組細胞中cGAS、STING表達升高(P<0.05);與HR組比較,HR+RU組cGAS、STING表達降低(P<0.05);與HR+RU組比較,HR+RU+NCOA4組cGAS、STING表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表5。

表5 各組HT22細胞cGAS-STING通路的表達變化

3 討 論

在應激、壓力等條件刺激下機體通過啟動細胞程序性死亡以應對傷害,其中cGAS-STING為經(jīng)典的通路,其研究主要集中在天然免疫方面,該通路的激活既能識別來自病毒、細菌等外源性的DNA,又能鑒別自身線粒體、腫瘤或死亡細胞的DNA,從而引起廣大學者的關注[12-14]。新近發(fā)現(xiàn)cGAS-STING通路參與了DNA的損傷修復,并能調控NF-κB參與炎性反應,還可介導自噬溶酶體依賴的細胞死亡[15-18]。另有研究指出在巨噬細胞和外周血單核細胞中,活化的STING與NCOA4結合,啟動了STING驅動的以鐵蛋白為目標的細胞吞噬過程,這一級聯(lián)過程會導致脂質過氧化,并最終引發(fā)鐵死亡[19-20]。在本研究中,課題組全面探索了在氧糖剝奪/復糖復氧(OGD/R)損傷背景下cGAS-STING通路激活、NCOA4介導的鐵自噬,以及隨之而來的對鐵代謝、自噬過程和氧化應激反應的影響之間錯綜復雜的相互作用。

早期研究認為鐵死亡在形態(tài)學、生物學和遺傳學等方面均不同于凋亡、自噬和壞死[21]。但越來越多的證據(jù)表明選擇性自噬有助于鐵死亡的進展[22-23]。新近發(fā)現(xiàn)鐵自噬具有調控鐵死亡的作用,其可通過釋放亞鐵離子促進氧化應激導致ROS大量生成進而啟動鐵死亡;同時有研究指出鐵死亡啟動所需的ROS源于鐵自噬產(chǎn)生的活性氧[24-25]。以上結果提示鐵自噬—死亡是一個動態(tài)連續(xù)變化的過程,鐵自噬是始動因素,而鐵死亡則是結局指標。在神經(jīng)退行性疾病中,NCOA4介導的鐵自噬過度激活已被證實可以啟動鐵死亡進一步誘導不可逆的腦損傷[26-28]。此外,鐵自噬作用的增強會增加神經(jīng)元對缺血和缺氧的敏感性,破壞正常的腦代謝和功能,從而加劇再灌注損傷[29]。本研究同樣表明HT22細胞缺氧復氧后cGAS-STING通路激活,進而NCOA4介導的鐵自噬增多,同時氧化應激指標升高;而給予cGAS抑制劑后鐵自噬降低,抗氧化應激指標升高,損傷減輕。這與以往研究相符,強調了cGAS-STING通路激活后啟動鐵自噬對腦缺血再灌注損傷的不利影響。

亞鐵離子作為鐵自噬通過自噬溶酶體降解釋放出的物質,其可通過芬頓反應導致脂質過氧化進而引起損傷[30-31]。而NCOA4可通過鐵自噬有效調控鐵蛋白水平進而維持全身鐵平衡,機體缺鐵時NCOA4上升促進鐵蛋白降解釋放亞鐵離子,但亞鐵離子增多時NCOA4泛素化降解增多抑制亞鐵離子釋放[32-33]。但在病理、應激等條件下,鐵蛋白的調控會有更多機制參與。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧復氧后鐵蛋白與亞鐵離子升高,可能與機體自我保護機制啟動有關,通過增加鐵蛋白提高對亞鐵離子的儲存以減少亞鐵離子對機體的損傷;抑制cGAS表達后鐵蛋白進一步增加而此時亞鐵離子顯著下降,表明抑制cGAS-STING通路激活可增強機體的保護作用;但過表達NCOA4時由于其可促進鐵蛋白降解進而呈現(xiàn)出下降趨勢,同時大量亞鐵離子釋放導致?lián)p傷加重。

綜上,在HT22細胞缺氧復氧后期cGAS-STING通路上調,進而氧化應激增強,鐵自噬過度激活導致?lián)p傷加重。抑制cGAS-STING通路可減輕HT22細胞缺氧復氧損傷,該保護作用可被過表達的NCOA4逆轉。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

趙藍:實施研究過程,論文撰寫;李鎮(zhèn)文:數(shù)據(jù)獲取,參與撰寫;鐘振通:統(tǒng)計學分析;詹麗英:論文審核;高文蔚:研究構思,課題設計