楊宇琦,吳麗娜,孫克,邢偉園,侯越,張麗文

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是女性最常見(jiàn)的生殖內(nèi)分泌疾病,也是育齡期女性不孕的重要原因[1]。PCOS發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,其治療方法具有局限性。因此,尋找有效的治療藥物至關(guān)重要。黃連素(berberine,BBR)是一種天然異喹啉生物堿,具有降糖、降脂和抗炎等有益作用。據(jù)報(bào)道,BBR對(duì)PCOS顯示出良好的臨床療效[2],但其具體機(jī)制尚未可知。研究表明,腸道菌群及其代謝產(chǎn)物失調(diào)與PCOS的生殖和代謝表型存在聯(lián)系[3-4],靶向調(diào)節(jié)腸道菌群可改善PCOS[5-6]。由于BBR吸收率低,其分解代謝主要集中在胃腸道,可能有效調(diào)節(jié)腸道菌群和腸道黏膜屏障[7]。因此,本研究采用來(lái)曲唑誘導(dǎo)的PCOS小鼠模型,利用16S rDNA基因測(cè)序技術(shù),研究BBR對(duì)PCOS腸道菌群的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物:清潔級(jí)健康雌性C57BL/6J小鼠24只,6～8周齡,體質(zhì)量15～20 g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,合格證號(hào):SCXK(京)2020-0004。飼養(yǎng)在特定的無(wú)菌條件下,標(biāo)準(zhǔn)溫度(22±2)℃,相對(duì)濕度45%～70 %,光暗周期12/12 h,并給予自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)飲食。屏障環(huán)境適應(yīng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)試藥試劑:來(lái)曲唑(貨號(hào)H199991001)購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥公司;達(dá)英-35(貨號(hào)j20140114)購(gòu)自德國(guó)拜耳公司;黃連素(批號(hào)B21449)購(gòu)自上海源葉生物公司;睪酮(T,貨號(hào)H090-1-1)、雌二醇(E2,貨號(hào)H102-1-1)和促黃體生成素(LH,貨號(hào)H206-1-2)購(gòu)自南京建成公司;空腹胰島素(FINS,貨號(hào)ml060484)和卵泡刺激素(FSH,貨號(hào)ml059034)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司;HE檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)G1003)購(gòu)自武漢塞維爾生物公司;抗Occludin(GB111401)、Claudin-1(GB14066)抗體購(gòu)自美國(guó)Servicebio公司;抗PI3K(4255S)和PI3K-p85(4292S) 抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;抗AKT(ab8805)和AKT-pT30磷酸化抗體(ab32445)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。(3)儀器設(shè)備:離心機(jī)(AXTGL16M)購(gòu)自江蘇恒諾儀器制造有限公司;切片機(jī)(RM2235)和石蠟包埋機(jī)(G1150H)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司;I-Sanger生信云平臺(tái)(https://www.i-sanger.com/)。

1.2 PCOS模型構(gòu)建及分組處理 2021年6月—2022年6月在復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只雌鼠分為正常對(duì)照組、模型(PCOS)組、陽(yáng)性藥達(dá)英-35(0.2 mg·kg-1·d-1)組和BBR(100 mg·kg-1·d-1)組,每組6只。除正常對(duì)照組外,其余小鼠均予以來(lái)曲唑(1 mg·kg-1·d-1,溶于1%羧甲基纖維素)灌胃誘導(dǎo)PCOS模型,連續(xù)21 d,正常對(duì)照組給予等容積0.9%氯化鈉溶液。以第1次給來(lái)曲唑?yàn)榈?天計(jì)算,第8天開(kāi)始連續(xù)每日取小鼠陰道上皮細(xì)胞涂片觀察脫落細(xì)胞改變,分析動(dòng)情周期變化,以陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化者為造模成功。造模成功后,第22天開(kāi)始給予相應(yīng)劑量藥物連續(xù)灌胃治療14 d,正常對(duì)照組和PCOS組給予等容積0.9%氯化鈉溶液。實(shí)驗(yàn)期間,每周監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,禁食10 h后過(guò)量麻醉處死,收集血清、雙側(cè)卵巢和結(jié)腸作進(jìn)一步分析。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 16S rDNA基因測(cè)序檢測(cè)各組小鼠腸道菌群變化:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,收集各組小鼠糞便樣本,按照文獻(xiàn)[8]報(bào)道方法,從小鼠糞便樣本中提取微生物基因組DNA。PCR擴(kuò)增方法如下:98℃ 2 min,隨后在98℃ 15 s,55℃ 30 s, 72℃ 30 s下循環(huán)25次,最后在72℃延伸5 min。使用正向引物338 F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和反向引物806 R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')在72℃下進(jìn)行最終延長(zhǎng)5 min,制備文庫(kù)(連接接頭和指示劑)和純化。微生物組生物信息學(xué)采用QIIME2 2019.4進(jìn)行,并根據(jù)官方教程(https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/)進(jìn)行輕微修改?；诓僮鞣诸?lèi)單元(OTU)注釋,結(jié)合門(mén)、綱、目、科、屬等分類(lèi)水平,生成相對(duì)豐度譜。采用Pearson相關(guān)系數(shù)矩陣進(jìn)行UPGMA聚類(lèi),并在R統(tǒng)計(jì)軟件包中開(kāi)發(fā)自定義腳本生成熱圖,對(duì)差異較大的每個(gè)類(lèi)群或OTU進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2 血清激素水平測(cè)定:各組小鼠末次給藥后,于眼眶后靜脈叢采血0.5～1.0 ml,室溫靜置2 h后,4℃離心收集上層血清。利用酶聯(lián)免疫吸附法并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清激素水平:T、E2、FSH、LH和FINS。

1.3.3 胰島素代謝相關(guān)指標(biāo)測(cè)定:上述血液以 Hitachi-7600自動(dòng)生化分析儀測(cè)量空腹血糖(FPG);分別根據(jù)公式[FINS(μIU/ml)×FPG (mmol/L)/22.5]和1/[FPG (mmol/L) × FINS(μIU/ml)]計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島素敏感系數(shù)(ISI)。

1.3.4 HE染色檢測(cè)小鼠卵巢病理結(jié)構(gòu):取各組小鼠卵巢組織,4℃下以4%多聚甲醛固定48 h,常規(guī)石蠟包埋,切片厚5 μm。利用HE染色試劑盒,并按照說(shuō)明書(shū)步驟行HE染色。光鏡下評(píng)估創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.5 結(jié)腸Occludin、Claudin-1表達(dá):將結(jié)腸組織切片放入65℃烤箱烘烤30 min后,二甲苯脫蠟,酒精梯度復(fù)水。在0.01 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中煮沸20 min,抗原修復(fù)。3% H2O2封閉切片5 min后,室溫下山羊血清封閉15 min,分別用緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的特異性一抗(1∶200)4℃下孵育過(guò)夜;次日,用生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG和辣根過(guò)氧化物酶在室溫下各孵育15 min。3,3'二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5 min,蘇木精復(fù)染。使用光學(xué)顯微鏡獲得圖像,陽(yáng)性結(jié)果呈棕褐色,并進(jìn)行蛋白定量分析。

1.3.6 Western-blot檢測(cè)小鼠卵巢組織PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá):各組小鼠卵巢組織在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中進(jìn)行裂解,并利用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。20 μg卵巢蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離,并在100 V下轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上60～80 min。非特異性結(jié)合點(diǎn)在室溫下用 5%脫脂牛奶在三相緩沖鹽水(TBS-T)中阻斷1 h后,用 PI3K(1∶500)、p-PI3K(1∶300)、AKT(1∶500)、p-AKT(1∶300)和 β-actin(1∶5 000)的一抗孵育PVDF膜。次日,用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)作為二抗,以β-actin為內(nèi)參,采用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腸道菌群豐度和多樣性比較

2.1.1 OUT分析及物種組成分析:正常對(duì)照組、PCOS組、達(dá)英-35組和BBR組特有的OTU數(shù)分別為9 499(25.04%)、6 534(17.32%)、7 089(18.79%)和7 212(19.11%)。根據(jù)OUT聚類(lèi)的結(jié)果,可獲得4組小鼠在門(mén)、綱、目、科、屬、種水平的豐度信息,見(jiàn)表1。

表1 4組小鼠腸道各級(jí)微生物分類(lèi)群的數(shù)量

2.1.2 α多樣性分析:正常對(duì)照組、PCOS組、達(dá)英-35組和BBR組小鼠腸道菌群的Simpson指數(shù)分別為0.986 2、0.472 3、0.887 6和0.978 4,Shannon指數(shù)分別為9.089 2、3.234 1、8.672 8和8.423 6,4組間Simpson和Shannon指數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.1.3 β多樣性分析:剔除遠(yuǎn)離總體的部分樣本后,非加權(quán)主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)果表明,4組腸道菌群組成有明顯差異。Axis 1和Axis 2軸對(duì)結(jié)果的解釋度分別為7.3%和5.5%,見(jiàn)圖1。

圖1 4組小鼠PCoA分析結(jié)果

2.1.4 物種差異分析:

2.1.4.1 門(mén)水平菌群豐度比較 4組小鼠腸道門(mén)水平菌群豐度比較(前20位),菌群組成以厚壁桿菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為主。正常對(duì)照組、PCOS組、達(dá)英-35組和BBR組厚壁桿菌門(mén)占比分別為(72.54±2.36)%、(72.58±2.28)%、(76.81±3.23)%和(74.23±2.98)%,擬桿菌門(mén)占比分別為(25.87±1.67)%、(27.13±1.89)%、(21.67±1.62)%和(24.13±1.87)%。4組間厚壁桿菌門(mén)和擬桿菌門(mén)豐度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F/P=0.173/0.894,0.241/0.812)。

2.1.4.2 屬水平菌群豐度比較 在屬水平上,與正常對(duì)照組比較,PCOS組小鼠中布勞特氏菌屬(Blautia)、韋永氏球菌屬(Veillonella)、孿生球菌屬(Gemella)和梭形桿菌屬(Fusobacterium)的豐度增加,顫螺旋菌屬(Helicobacter)、糞球菌屬(Coprococcus)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)的豐度減少(P均<0.05);與PCOS組比較,BBR組普氏菌屬(Prevotell)、韋永氏球菌屬(Veillonella)、孿生球菌屬(Gemella)和梭形桿菌屬(Fusobacterium)的豐度降低,而布勞特氏菌屬(Blautia)、顫螺旋菌屬(Helicobacter)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、糞球菌屬(Coprococcus)、副桿菌屬(Parabacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、羅氏菌屬(Roseburia)、酪酸菌屬(Butyricicoccus)、鏈球菌屬(strecoccus)和帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)等有益菌屬的豐度均增加(P均<0.05)。前15位有豐度差異的屬水平菌群見(jiàn)圖2。

圖2 4組小鼠屬水平腸道菌群豐度比較

2.2 各組小鼠體質(zhì)量比較 正常對(duì)照組、PCOS組、達(dá)英-35組和BBR組小鼠末次給藥時(shí)體質(zhì)量分別為(16.23±0.87) g、(22.76±3.23)g、(18.45±0.96)g和(17.88±0.43)g。與正常對(duì)照組小鼠比較,PCOS組小鼠體質(zhì)量增加(t/P=4.782/0.013);與PCOS組比較,達(dá)英-35組和BBR組小鼠體質(zhì)量明顯降低(t/P=3.133/0.011,3.668/0.004)。

2.3 各組小鼠發(fā)情周期比較 小鼠月經(jīng)周期呈現(xiàn)動(dòng)情前期(P)、動(dòng)情期(E)、動(dòng)情間期(M)和動(dòng)情后期(D),4～5 d為1個(gè)性周期且規(guī)律出現(xiàn);陰道涂片細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn),正常對(duì)照組小鼠月經(jīng)周期正常,PCOS組小鼠D期延長(zhǎng),提示無(wú)排卵;達(dá)英-35組和BBR組小鼠發(fā)情周期在治療后逐漸恢復(fù)規(guī)律,見(jiàn)圖3。

注:P.動(dòng)情前期;E.動(dòng)情期;M.動(dòng)情間期;D.動(dòng)情后期。

2.4 各組小鼠血清性激素水平比較 與正常對(duì)照組比較,PCOS組小鼠血清T、LH和LH/FSH水平升高,E2和FSH水平降低(t/P=4.626/0.001,5.703/<0.001,2.578/0.028,2.847/0.017,3.079/0.012)。與PCOS組比較,達(dá)英-35組小鼠血清T、LH和LH/FSH水平降低,E2和FSH水平升高(t/P=3.416/0.007,4.596/0.001,2.327/0.042,2.389/0.038,3.354/0.007),BBR組血清T、LH和LH/FSH水平亦降低(t/P=4.602/0.001,6.101/<0.001,2.535/0.030),但PCOS組和BBR組E2和FSH水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=1.031/0.327,1.623/0.136),見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清性激素水平比較

2.5 各組小鼠胰島素代謝相關(guān)指標(biāo)水平比較 與正常對(duì)照組比較,PCOS組小鼠FPG、FINS和HOMA-IR水平升高,ISI降低(t/P=4.156/0.002,3.255/0.009,7.439/<0.001,3.541/0.005);與PCOS組比較,BBR組FPG、FINS和HOMA-IR水平明顯下調(diào),ISI上調(diào)(t/P=5.950/<0.001,2.914/0.015,7.630/<0.001,3.198/0.010);達(dá)英-35組和PCOS組比較,FINS和HOMA-IR水平亦降低,ISI升高(t/P=2.908/0.016,6.096/<0.001,3.194/0.010),而FPG差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=0.906/0.386),見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠胰島素代謝水平比較

2.6 各組小鼠卵巢組織病理形態(tài)比較 HE染色結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,PCOS組小鼠的卵巢形態(tài)發(fā)生了改變,卵巢皮質(zhì)增厚,結(jié)構(gòu)不均勻,無(wú)黃體或黃體數(shù)量極少,囊性卵泡體積增大,卵巢呈典型的多囊性改變,原始卵泡和初級(jí)卵泡數(shù)量明顯減少。與PCOS組比較,達(dá)英-35組鏡下可見(jiàn)卵巢皮質(zhì)層略有變薄,黃體數(shù)量增多,卵泡體積變小;BBR組小鼠卵巢皮質(zhì)層顯著變薄,黃體數(shù)量明顯增多,卵泡形態(tài)完整,排列整齊,見(jiàn)圖4。

注:黑色箭頭所示為卵泡,紅色箭頭所示為黃體。

2.7 各組小鼠結(jié)腸組織Claudin-1和Occludin表達(dá)水平比較 免疫組化結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,PCOS組小鼠結(jié)腸組織Claudin-1和Occludin蛋白水平下降(t/P=3.806/0.003,3.795/0.004);與PCOS組比較,達(dá)英-35組和BBR組小鼠結(jié)腸組織Claudin-1和Occludin表達(dá)均升高(t/P=2.390/0.038,2.247/0.048;3.799/0.003,3.185/0.010),見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠結(jié)腸組織Claudin-1、Occludin表達(dá)水平比較

2.8 各組小鼠卵巢組織PI3K/AKT相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較,PCOS組小鼠卵巢組織p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低(t/P=13.474/<0.001,17.285/<0.001);與PCOS組比較,達(dá)英-35組和BBR組小鼠卵巢組織p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(t/P=7.323/<0.001,7.564/<0.001;7.473/<0.001,8.187/<0.001),見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠結(jié)腸組織PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討 論

PCOS是育齡婦女常見(jiàn)的內(nèi)分泌紊亂性疾病,患者面臨排卵障礙引起的不孕癥等疾病的更高風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前西醫(yī)治療PCOS的藥物長(zhǎng)期使用效果不佳,甚至?xí)a(chǎn)生諸多不良反應(yīng)。開(kāi)發(fā)既能有效治療PCOS且不良反應(yīng)小的藥物,并探索其作用機(jī)制,已成為當(dāng)今PCOS研究的重要方向和熱點(diǎn)。

根據(jù)PCOS臨床及病理特征,Kafali等[9]首創(chuàng)的利用非甾體類(lèi)芳香化酶抑制劑來(lái)曲唑構(gòu)建雌鼠PCOS模型,是目前公認(rèn)的、較為全面的、能夠反映PCOS臨床患者內(nèi)分泌狀態(tài)和卵巢病理改變的良好動(dòng)物模型,表現(xiàn)出無(wú)排卵、性激素紊亂、體質(zhì)量增加和胰島素抵抗(IR)等一系列代謝特征。高雄激素血癥是PCOS的重要病理特征之一,T水平受P450芳香化酶的影響,較高雄激素可引起PCOS卵泡發(fā)育異常,卵泡壁無(wú)法破裂,導(dǎo)致卵泡閉鎖和排卵障礙[10]。此外,高雄激素血癥會(huì)誘導(dǎo)前卵泡堆積,FSH減少和功能下降。依賴FSH的P450芳香化酶合成受到抑制,卵巢T向E2的轉(zhuǎn)化減慢,導(dǎo)致高T低E2。同時(shí),高LH/FSH比率被認(rèn)為是PCOS的診斷標(biāo)志,提高FSH水平可促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)[11]。因此,本研究利用來(lái)曲唑誘導(dǎo)PCOS小鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PCOS小鼠表現(xiàn)出體質(zhì)量逐漸下降,性激素代謝紊亂,卵巢呈典型的多囊性改變,提示模型構(gòu)建成功。

BBR是中草藥黃連、黃柏和小檗皮的主要活性成分,已被用于治療腹瀉、代謝紊亂和不孕癥。最近證據(jù)表明BBR有望治療PCOS,Mishra等[12]研究發(fā)現(xiàn),BBR對(duì)臨床癥狀、激素水平和血脂參數(shù)方面的調(diào)節(jié)作用比二甲雙胍更有效,可有效降低PCOS患者的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究亦顯示,BBR可通過(guò)抑制炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡對(duì)PCOS大鼠發(fā)揮保護(hù)作用,促進(jìn)PCOS大鼠排卵,改善其代謝紊亂和子宮內(nèi)膜容受性[13]。本研究評(píng)估了BBR對(duì)PCOS小鼠生殖和代謝特征的影響,發(fā)現(xiàn)BBR不僅能顯著緩解卵巢結(jié)構(gòu)和功能障礙,還能通過(guò)調(diào)節(jié)血清性激素和胰島素代謝發(fā)揮保護(hù)作用,這與以往的文獻(xiàn)結(jié)果相一致[13],表明BBR可能在PCOS的治療中發(fā)揮重要作用,但其調(diào)節(jié)血清激素水平和代謝異常的機(jī)制仍不清楚。

近年來(lái)大量研究表明,腸道菌群在人類(lèi)多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,提出了通過(guò)干預(yù)腸道菌群以防治疾病新的臨床策略。由于PCOS患者高水平的循環(huán)胰島素刺激卵巢細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量雄激素已得到體內(nèi)和體外研究的支持,一種關(guān)于PCOS發(fā)展的微生物學(xué)假說(shuō)認(rèn)為,腸道菌群失調(diào)可促進(jìn)卵巢產(chǎn)生雄激素,引發(fā)慢性炎性反應(yīng)和IR干擾卵泡正常發(fā)育[14]。多個(gè)臨床研究發(fā)現(xiàn),與正常者比較,PCOS女性腸道菌群α多樣性降低,而且PCOS高雄激素血癥與腸道菌群α多樣性呈負(fù)相關(guān)[15]。Li等[16]將PCOS小鼠糞便菌群移植到無(wú)菌小鼠中,發(fā)現(xiàn)腸道菌群與其宿主的性激素水平、發(fā)情周期和卵巢形態(tài)變化密切相關(guān)。因此,通過(guò)對(duì)腸道菌群的檢測(cè)和靶向治療,可能對(duì)PCOS的預(yù)測(cè)和療效有一定的指導(dǎo)意義。本研究通過(guò)16S rDNA基因測(cè)序發(fā)現(xiàn),PCOS小鼠腸道菌群發(fā)生了整體改變,且BBR治療可顯著改善PCOS小鼠腸道菌群α和β多樣性。嚙齒類(lèi)動(dòng)物和人類(lèi)的腸道菌群門(mén)水平十分相似,均以厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為主(約占80%)[17],與本結(jié)果類(lèi)似。Torres等[18]發(fā)現(xiàn),來(lái)曲唑誘導(dǎo)小鼠腸道菌群中多類(lèi)菌屬平均相對(duì)豐度發(fā)生顯著變化,而B(niǎo)BR治療可使這些菌屬豐度降低。這些結(jié)果提示,PCOS小鼠存在腸道菌群失調(diào),而B(niǎo)BR治療可能通過(guò)調(diào)整小鼠腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)影響激素水平,從而改善PCOS。

腸道屏障功能受損往往是PCOS發(fā)病機(jī)制中一個(gè)重要的加重因素[19],上調(diào)腸黏膜中Claudin-1和Occludin的表達(dá)可減少腸黏膜損傷,為預(yù)防腸屏障功能障礙提供了新的方向。本研究發(fā)現(xiàn),BBR干預(yù)后,結(jié)腸組織中Claudin-1和Occludin的表達(dá)明顯增加,糞球菌屬、顫螺旋菌屬和羅氏菌屬豐度上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌可通過(guò)抑制TLR-NF-κB通路減輕炎性反應(yīng),有助于調(diào)節(jié)腸道平衡,維持腸道屏障功能,促進(jìn)受損組織的修復(fù)和再生[20]。此外,補(bǔ)充BBR后,鏈球菌、布勞特氏菌和乳酸菌等產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFA)的菌屬有所增加,可為上皮細(xì)胞提供能量,增加緊密連接蛋白表達(dá),促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)[7]。研究表明,羅氏菌屬和顫螺旋菌屬可參與產(chǎn)生丁酸鹽和丁酸鹽樣物質(zhì),以保護(hù)腸道屏障功能的完整性[21]。這些結(jié)果提示,BBR通過(guò)影響腸道菌群的組成或產(chǎn)生SCFA、丁酸鹽和丁酸鹽樣物質(zhì)來(lái)改善腸道屏障功能。

IR是PCOS的典型特征,其中經(jīng)典的PI3K/AKT信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)并抑制糖元合成來(lái)調(diào)節(jié)代謝。Alaaeldin等[22]通過(guò)建立IR體外模型證實(shí),IR與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān),胰島素受體激活后,誘導(dǎo)胰島素受體底物(IRS)磷酸化,與PI3K蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞的葡萄糖攝入量。與此結(jié)果一致, BBR治療后,PCOS小鼠血清FPG、FINS和HOMA-IR水平顯著下降,卵巢組織PI3K/AKT通路磷酸化明顯增多。此外,PI3K/AKT在維持腸道屏障功能方面發(fā)揮著重要作用,如在缺氧時(shí)調(diào)節(jié)Occludin和Claudin-1的表達(dá),以及刺激腸道干細(xì)胞在腸道中的擴(kuò)增[23]。因此,經(jīng)BBR干預(yù)后,Claudin-1和Occludin顯著下調(diào),PCOS的病理狀態(tài)得到改善。

綜上所述,BBR可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群并激活PI3K/AKT信號(hào)通路,降低PCOS小鼠體質(zhì)量和胰島素抵抗,改善激素水平,減輕卵巢功能障礙,增強(qiáng)腸道通透性和腸道屏障功能。然而,BBR如何影響PCOS小鼠腸道菌群的確切機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

楊宇琦:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫(xiě);吳麗娜:提出研究方向,論文審核;孫克:實(shí)施研究過(guò)程,資料搜集整理;邢偉園:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;侯越:實(shí)施研究過(guò)程,數(shù)據(jù)收集、分析整理;張麗文:實(shí)施研究過(guò)程,論文修改