金嫻,邵振華,何梅,姜俊,王志安,任蕾

老年人因宿主免疫受損、吞咽功能障礙和伴有多種基礎(chǔ)疾病成為肺炎高發(fā)人群,且常因肺部炎性反應(yīng)得不到有效控制進(jìn)展為重癥肺炎[1]。急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是老年重癥肺炎最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致老年重癥肺炎患者死亡的重要因素[2]。因此及時評估老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后至關(guān)重要。炎性反應(yīng)參與ARDS發(fā)生發(fā)展[3],研究表明,微小核糖核酸(microRNA,miRNA)通過調(diào)控炎性反應(yīng)在ARDS過程中發(fā)揮重要作用[4]。miR-27a是一種炎性反應(yīng)相關(guān)miRNA[5],有學(xué)者通過miRNA篩選發(fā)現(xiàn)[6],miR-27a為重癥社區(qū)獲得性肺炎并發(fā)ARDS患者血清差異表達(dá)miRNA之一。叉頭框蛋白O3(forkhead box O3,FOXO3)是一種轉(zhuǎn)錄因子,參與細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等多種病理生理過程[7]。實驗報道[8],FOXO3在急性肺損傷/ARDS小鼠肺組織中高表達(dá)。本研究擬探討老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者血清miR-27a、FOXO3與疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系,以期為改善老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者預(yù)后提供更多參考依據(jù),報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2022年10月—2023年9月上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者108例為ARDS組,男67例,女41例,年齡60～89(73.12±6.75)歲;老年重癥肺炎未并發(fā)ARDS患者72例為非ARDS組,男44例,女28例,年齡60～88(74.17±6.90)歲;另選取醫(yī)院同期老年體檢健康志愿者60例為健康對照組,男36例,女24例;年齡60～89(73.03±7.14)歲。3組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[(2022)倫審第39號],受試者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥60歲;②初次確診為重癥肺炎或重癥肺炎并發(fā)ARDS;③重癥肺炎符合《中國急診重癥肺炎臨床實踐專家共識》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn);④ARDS符合《急性呼吸窘迫綜合征:柏林新定義》[10]診斷標(biāo)準(zhǔn);⑤臨床病歷資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)、先天性肺發(fā)育不良等其他肺疾病;②腦卒中、終末期腎病等重大疾病或疾病終末期;③惡性腫瘤患者;④自身免疫性疾病;⑤哺乳期、妊娠期婦女。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 資料收集:性別、年齡、肺炎類型(社區(qū)/醫(yī)院獲得性肺炎)、吸煙史、飲酒史、基礎(chǔ)疾病、機(jī)械通氣時間、白細(xì)胞計數(shù)、血肌酐、血尿素氮、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原等資料。

1.3.2 血清miR-27a、FOXO3水平檢測:患者于入院時和健康對照組體檢時采集空腹肘靜脈血4 ml,置于EDTA抗凝管中30 min,離心留取上層血清,保存于-80℃冰箱中待測。按照南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供的RNA提取試劑盒(編號 RC112-01)說明書提取總RNA,按照南京賽泓瑞生物科技有限公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(編號 DV807A)說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,miR-27a以U6為內(nèi)參,FOXO3以GAPDH為內(nèi)參,根據(jù)翌圣生物科技(上海)股份有限公司提供的實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒(編號 11203ES03)說明書進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系:2×Master Mix 10 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、cDNA 2.0 μl、加DEPC水至20 μl;反應(yīng)條件:預(yù)變性 95℃ 30 s 1次,變性95℃ 5 s 40次,退火延伸60℃ 40 s 40次。65～95℃繪制溶解曲線,用2-ΔΔCT法表示血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成,miR-27a上游引物5＇-AAGGAGCCCCACGAGAAAAA-3＇,下游引物5＇-ACCGAACTTGCATTGATTCC-3＇;U6上游引物5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇,下游引物5＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇;FOXO3上游引物5＇-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGA-3＇,下游引物5＇-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3＇;GAPDH上游引物5＇-CTCGCTTCGGCAGCACATATA-3＇,下游引物5＇- ACGAATTTGCGTGTCATCCT-3＇。

1.3.3 miR-27a與FOXO3的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測:通過TargetScan數(shù)據(jù)庫https://www.targetscan.org/vert_72/預(yù)測miR-27a與FOXO3的結(jié)合位點(diǎn)。

1.3.4 老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者病情和預(yù)后分組:老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者入院后,根據(jù)氧合指數(shù)(動脈血氧分壓/吸入氧濃度)分為輕度亞組(200 mmHg<氧合指數(shù)≤300 mmHg,26例)、中度亞組(100 mmHg<氧合指數(shù)≤200 mmHg,34例)、重度亞組(氧合指數(shù)≤100 mmHg,48例)。并根據(jù)老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者28 d預(yù)后情況分為死亡亞組33例和存活亞組75例。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平比較 健康對照組、非ARDS組、ARDS組血清miR-27a水平依次降低,FOXO3 mRNA水平依次升高(P均<0.01),見表1。

表1 3組血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平比較

2.2 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平在不同病情程度老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者中比較 輕度亞組、中度亞組、重度亞組血清miR-27a水平依次降低,FOXO3 mRNA水平依次升高(P均<0.01),見表2。

表2 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平在不同病情程度老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者中比較

2.3 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平與氧合指數(shù)的相關(guān)性 經(jīng)TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測,miR-27a與FOXO3的3＇-非翻譯區(qū)3257～3264處存在結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。Pearson相關(guān)性分析顯示,血清miR-27a與FOXO3 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.736,P<0.001);Spearman相關(guān)性分析顯示,血清miR-27a水平與氧合指數(shù)呈正相關(guān),FOXO3 mRNA水平與氧合指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(rs=0.751、-0.785,P均<0.001)。

圖1 miR-27a與FOXO3的結(jié)合位點(diǎn)圖

2.4 不同預(yù)后老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者臨床資料比較 老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者108例，28 d死亡33例(30.56%)。 死亡亞組患者年齡大于存活亞組,機(jī)械通氣時間長于存活亞組,氧合指數(shù)、miR-27a低于存活亞組,C反應(yīng)蛋白、FOXO3 mRNA高于存活亞組(P<0.05),2亞組其他資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 不同預(yù)后老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者臨床資料比較

2.5 多因素Logistic回歸分析影響老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者預(yù)后的因素 以老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者預(yù)后(死亡/存活=1/0)為因變量,以表3中P<0.05項目(年齡、機(jī)械通氣時間、氧合指數(shù)、C反應(yīng)蛋白、miR-27a、FOXO3 mRNA)為自變量,建立影響老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者預(yù)后的多因素Logistic回歸模型。結(jié)果顯示,年齡增加、機(jī)械通氣時間延長、FOXO3 mRNA升高為影響老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素,氧合指數(shù)升高、miR-27a升高為獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05),見表4。

表4 影響老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

2.6 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平對老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者死亡的預(yù)測價值 繪制血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平單獨(dú)與聯(lián)合預(yù)測老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者死亡的ROC曲線,結(jié)果顯示:血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平及二者聯(lián)合預(yù)測老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者死亡的曲線下面積(AUC)分別為0.784、0.786、0.879,二者聯(lián)合的AUC大于血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平單獨(dú)預(yù)測(Z=2.550、2.963,P=0.011、0.003),見表5、圖2。

表5 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平預(yù)測老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者死亡的價值

3 討 論

ARDS是一種由各種誘導(dǎo)因素引起的難以控制且危及生命的進(jìn)行性呼吸窘迫和急性呼吸衰竭,其特點(diǎn)是嚴(yán)重肺部炎性反應(yīng)、肺上皮和內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肺泡—毛細(xì)血管膜通透性增加、低氧血癥和非心源性肺水腫等[11]。老年重癥肺炎患者由于肺實質(zhì)(細(xì)支氣管、肺間質(zhì)、肺泡等)炎性反應(yīng)加重,誘發(fā)失控性炎性反應(yīng),加劇肺部損傷導(dǎo)致ARDS[12]。老年重癥肺炎并發(fā)ARDS具有全身器官功能減退、基礎(chǔ)疾病多、防御功能和呼吸免疫系統(tǒng)低下、頑固性低氧等特點(diǎn),截止目前尚無特效治療方法,治療難度大,常因并發(fā)多器官衰竭而死亡[13]。

炎性反應(yīng)被認(rèn)為是ARDS發(fā)生發(fā)展的核心機(jī)制,炎性反應(yīng)通過破壞肺上皮和內(nèi)皮細(xì)胞,增加肺泡—毛細(xì)血管膜通透性,引起大量液體滲漏而促進(jìn)ARDS發(fā)生發(fā)展[3]。miRNA是一種短鏈非編碼RNA,能與靶基因特異性位點(diǎn)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),從而參與ARDS進(jìn)程[14]。miR-27a定位于人染色體19p13.12,既往研究多關(guān)注其在惡性腫瘤中的作用,近年研究發(fā)現(xiàn)miR-27a還參與肺炎性反應(yīng)過程。王艷瓊等[15]實驗報道,miR-27a在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞損傷模型中低表達(dá),上調(diào)miR-27a能靶向抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕靶蛋白信號通路,下調(diào)白介素(interleukin,IL)-6等促炎細(xì)胞因子表達(dá),以緩解肺炎鏈球菌所致的細(xì)胞損傷,提示miR-27a參與肺炎過程。實驗報道,miR-27a過表達(dá)能靶向抑制Toll樣受體4/核因子κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor κB,TLR4/NF-κB)信號通路,改善肺結(jié)核大鼠肺部炎性反應(yīng)損傷[16]。脂多糖建立的膿毒癥小鼠模型中,抑制miR-27a能上調(diào)磷酸酯酶與張力蛋白同源物表達(dá),抑制肺部促炎細(xì)胞因子表達(dá),進(jìn)而加重膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷[17]。提示miR-27a還對多種原因所致肺損傷具有重要的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示,健康對照組、非ARDS組、ARDS組血清miR-27a水平依次降低,提示低血清miR-27a水平與老年重癥肺炎并發(fā)ARDS有關(guān)。結(jié)果還顯示,老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者血清miR-27a水平隨著病情加重而降低,miR-27a升高為影響老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素,這提示低血清miR-27a水平與老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者疾病加重和預(yù)后不良有關(guān)。其機(jī)制可能是,miR-27a能靶向抑制TLR4/髓樣分化因子88/NF-κB信號通路,減少促炎細(xì)胞因子和促血管通透性因子釋放,抑制肺部炎性反應(yīng)發(fā)展和肺微血管通透性增強(qiáng),減少肺上皮、肺內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,從而改善老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者病情和預(yù)后[18]。

FOXO3/FOXO3a是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子,具有調(diào)節(jié)脂代謝、炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、血管生成、DNA修復(fù)、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激抵抗等多種作用[19]。Chen等[20]實驗報道,FOXO3在腸缺血再灌注小鼠模型中表達(dá)上調(diào),體外敲低FOXO3能抑制炎性因子表達(dá),進(jìn)而減輕腸缺血再灌注所致的肺損傷。Zhou等[21]實驗報道,下調(diào)FOXO3能通過抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3炎性小體活化,減輕炭黑納米顆粒誘導(dǎo)的大鼠肺部炎性反應(yīng)。抑制FOXO3表達(dá)能改善慢阻肺大鼠肺組織IL-1β、IL-2等炎性因子表達(dá)[22]。這些研究提示FOXO3在肺部炎性反應(yīng)損傷中發(fā)揮重要作用。同時研究報道,下調(diào)FOXO3能減輕膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷[23]。本研究結(jié)果顯示,健康對照組、非ARDS組、ARDS組血清FOXO3 mRNA水平依次升高,提示高血清FOXO3 mRNA水平與老年重癥肺炎并發(fā)ARDS有關(guān)。結(jié)果還顯示,老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者血清FOXO3 mRNA水平隨著病情加重而升高,為影響老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素,這提示高血清FOXO3 mRNA水平與老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者疾病加重和預(yù)后不良有關(guān)。其機(jī)制可能是,FOXO3能通過結(jié)合NF-κB RelA(p65)激活NF-κB信號通路,通過增加炎性細(xì)胞因子釋放,加劇肺血管、肺上皮、肺內(nèi)皮等組織損傷,導(dǎo)致老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者病情加重和死亡風(fēng)險增加[24]。同時FOXO3作為介導(dǎo)線粒體自噬調(diào)控的關(guān)鍵途徑[25]。FOXO3升高還會增強(qiáng)Ⅱ型肺泡細(xì)胞自噬活性,導(dǎo)致肺泡細(xì)胞過度自噬,誘導(dǎo)肺泡細(xì)胞凋亡,進(jìn)而加重老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者病情和降低預(yù)后[26]。

本研究通過在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-27a與FOXO3存在結(jié)合位點(diǎn),相關(guān)性分析證實在老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者血清中二者水平呈負(fù)相關(guān),這提示miR-27a與FOXO3可能共同參與老年重癥肺炎并發(fā)ARDS發(fā)生發(fā)展。Shang等[27]通過雙熒光素酶報告實驗證實,miR-27a能靶向下調(diào)FOXO3,以減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)和凋亡。本研究結(jié)果還顯示,年齡、機(jī)械通氣時間和氧合指數(shù)為影響老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者預(yù)后的獨(dú)立因素,考慮原因如下:年齡越大的患者全身器官功能減退越嚴(yán)重,免疫力、防御力、抗應(yīng)激能力更差,因此死亡風(fēng)險更高;機(jī)械通氣時間延長說明患者低氧血癥更嚴(yán)重,因此死亡風(fēng)險更高;氧合指數(shù)作為評估ARDS患者病情嚴(yán)重程度的指標(biāo),其指數(shù)越高提示患者病情越輕,因此死亡風(fēng)險更低。最后本研究ROC曲線結(jié)果顯示,血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平預(yù)測老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者死亡的AUC為0.784、0.786,二者聯(lián)合預(yù)測的AUC為0.879,較單獨(dú)預(yù)測顯著增加。這提示血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平可能成為老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者預(yù)后輔助預(yù)測指標(biāo),而同時檢測能更好地判斷患者預(yù)后。但還需實驗驗證miR-27a與FOXO3參與老年重癥肺炎并發(fā)ARDS的機(jī)制,同時本結(jié)論也有待多中心研究進(jìn)一步驗證。

綜上,血清miR-27a水平降低和FOXO3 mRNA水平升高與老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者疾病加重和預(yù)后不良有關(guān),miR-27a與FOXO3可能共同參與老年重癥肺炎并發(fā)ARDS發(fā)生發(fā)展,二者聯(lián)合對老年重癥肺炎并發(fā)ARDS患者死亡具有較高的預(yù)測價值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

金嫻:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;邵振華、姜俊、王志安:實施研究過程,資料整理收集;何梅:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析;任蕾:課題設(shè)計,論文修改,論文審核