宗時(shí)宇，狄志彪，劉琪琪，黃壯壯，張 紅，李 曄，劉 峰，劉 洋＊＊

（1.陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所 西安 710003；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 咸陽(yáng) 712046；3.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司 西安 710075）

參仙升脈口服液是我國(guó)第一個(gè)專門治療緩慢性心律失常的專利中成藥，具有溫補(bǔ)心腎、活血化瘀的作用[1]?，F(xiàn)代臨床上常用于治療輕、中度竇房結(jié)心動(dòng)過(guò)緩（心率>50次）和輕度病態(tài)竇房結(jié)綜合征不合并有室上性快速心律失常的心腎陽(yáng)虛，寒凝血脈證。全方由紅參、淫羊藿、補(bǔ)骨脂（鹽炙）、枸杞子、麻黃、細(xì)辛、丹參、水蛭等八味中藥組成。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，僅發(fā)現(xiàn)參仙升脈口服液中單味藥材的化學(xué)成分研究報(bào)道[2-5]。其中，紅參是經(jīng)人參蒸制干燥而成，主要有效成分為人參皂苷[6]，其特有成分為人參皂苷Rg3[2]；淫羊藿有效成分主要為淫羊藿總黃酮和淫羊藿多糖[7]；補(bǔ)骨脂主要成分為補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮等[8]；枸杞子活性成分主要為多糖類[9]；麻黃主要成分為生物堿，含有麻黃堿、偽麻黃堿等[10]；細(xì)辛、丹參、水蛭的主要成分分別為木脂素類、丹參酮類、水蛭素[11-13]。

中藥復(fù)方藥味多，化學(xué)成分復(fù)雜，其療效是藥物中多種成分協(xié)同作用的結(jié)果[14]，單一中藥成分的分析并不能夠體現(xiàn)中藥復(fù)方的整體性和化學(xué)成分的復(fù)雜多樣性。盡管參仙升脈口服液的臨床療效顯著，但缺乏系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，其發(fā)揮藥效的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明晰。且有個(gè)案報(bào)道服用參仙升脈口服液數(shù)天后患者出現(xiàn)肝功異常，而引起這一不良反應(yīng)的機(jī)制也未明確[15-16]。超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS）具有高分辨率、高精度及快速分析等特點(diǎn)，可以提供可靠的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定信息，是目前復(fù)雜中藥體系中化學(xué)成分快速鑒別的主要技術(shù)之一。本研究借助UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS 技術(shù)，闡明參仙升脈口服液的整體化學(xué)組分，為其進(jìn)一步藥效成分的明確、全面質(zhì)量控制及安全性評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000 型超高效液相色譜系統(tǒng)和Q Exactive Focus 型質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Mill-Q 超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）；SQP 型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

1.2 藥物與試劑

參仙升脈口服液（批號(hào)181202）由陜西步長(zhǎng)制藥有限公司提供；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-201811）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，補(bǔ)骨脂苷對(duì)照品（批號(hào)CHB-B-163）、異補(bǔ)骨脂苷對(duì)照品（批號(hào)CHB-Y-280）、補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品（批號(hào)CHB-B-099）購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司，補(bǔ)骨脂素（批號(hào)110739-200310）、異補(bǔ)骨脂素（批號(hào)0738-200108）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，所有對(duì)照品純度均>98%；甲醇為色譜級(jí)，甲酸為質(zhì)譜級(jí)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

稱取蘆丁、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品約10 mg，精密稱定，分別置于10 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，作為對(duì)照品貯備液；再取各對(duì)照品貯備液用甲醇稀釋至適宜濃度，即得各對(duì)照品溶液。

2.1.2 樣品溶液的制備

取1 mL 參仙升脈口服液內(nèi)容物于10 mL 容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 檢測(cè)條件

2.2.1 色譜條件

Thermo Accucore aQ C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相采用甲醇（A）和0.1%甲酸水（B）梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?-13 min，5%-60% A；13-27 min，60%-95% A；27-30 min，95% A。流速0.3 mL?min-1；進(jìn)樣量2 μL；柱溫30℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件

離子源為加熱電噴霧離子源（H-ESI），噴霧電壓為3.5 kV，鞘氣（N2）流量40 arb，輔助氣流量10 arb，輔助加熱器溫度350℃，毛細(xì)管溫度320℃，S-lens射頻水平50，自動(dòng)增益控制（AGC）106。離子檢測(cè)模式采用正、負(fù)離子切換，掃描模式Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS 分辨率為70000，dd-MS2分辨率為35000；掃描范圍m/z120-1800，碰撞能量30 eV、50 eV、70 eV。

2.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)質(zhì)譜精確相對(duì)分子量信息，選擇一級(jí)準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比實(shí)測(cè)值與理論值誤差小于5 ppm 的分子與自建的參仙升脈口服液化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行匹配，初步推測(cè)化合物信息。采用Xcalibur 2.0軟件進(jìn)一步對(duì)目標(biāo)化合物色譜峰及其二級(jí)碎片離子信息進(jìn)行提取，并結(jié)合相關(guān)化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)信息對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行鑒定和確證。

3 結(jié)果

利用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS，通過(guò)對(duì)不同離子模式下的供試品基峰總離子流圖（圖1）對(duì)比可以看出，參仙升脈口服液在正負(fù)離子模式下響應(yīng)均較好，在0-30 min 內(nèi)均有密集的響應(yīng)信號(hào)，大部分化合物均有出峰，隨著流動(dòng)相極性的降低，化合物出峰變少，表明參仙升脈口服液中主要以極性化合物為主。從參仙升脈口服液中共檢測(cè)到160 種化學(xué)成分，其中響應(yīng)度高，具有二級(jí)碎片離子的化學(xué)成分有62 種，其他成分因自身含量低或離子化能力弱，從而未發(fā)生裂解產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子，具體化合物信息見(jiàn)表1。

表1 參仙升脈口服液化學(xué)成分的UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS 鑒定結(jié)果

圖1 參仙升脈口服液UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS 總離子流圖

續(xù)表

3.1 黃酮類

絕大多數(shù)植物體內(nèi)都含有黃酮類化合物，本研究從參仙升脈口服液中鑒定的黃酮類成分共有29種，主要包括淫羊藿苷、寶藿苷Ⅶ、朝藿定A 和大豆苷等。以114 號(hào)代表性化合物淫羊藿苷質(zhì)譜裂解過(guò)程為例，在正離子模式下可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z677.24 [M+H]+，擬合其分子式為C33H39O15，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級(jí)碎片離子m/z531.19 [M+H-C6H9O4]+，m/z369.13 [M+H-C6H9O4- C6H10O5]+，相應(yīng)質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖2。

圖2 淫羊藿苷可能裂解途徑

3.2 有機(jī)酸類

從參仙升脈口服液中鑒定的有機(jī)酸類成分有24 種，主要包括丹參素、咖啡酸、異亮氨酸、煙酸和琥珀酸等。以44 號(hào)代表性化合物丹參素質(zhì)譜裂解過(guò)程為例，在負(fù)離子模式下可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z197.05[M-H]-，擬合其分子式為C9H10O5，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級(jí)碎片離子m/z135.05 [M-H-H2OCO2]-，m/z123.05 [M-H-C2H2O3]-，相應(yīng)質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖3。

圖3 丹參素可能裂解途徑

3.3 生物堿類

從參仙升脈口服液中鑒定的生物堿類成分有21種，主要包括麻黃堿、甲基麻黃堿、木蘭花堿、肌苷和腺苷等。以47 號(hào)代表性化合物麻黃堿質(zhì)譜裂解過(guò)程為例，在正離子模式下可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z166.12[M+H]+，擬合其分子式為C10H15NO，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級(jí)碎片離子m/z121.06 [M+HC2H7N]+，m/z103.05 [M+H-C2H7N-H2O]+，相應(yīng)質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖4 麻黃堿可能裂解途徑

3.4 萜類

從參仙升脈口服液中鑒定的萜類成分有19種，主要包括丹參酮IIA、表丹參隱螺內(nèi)酯和α-蒎烯等。以147號(hào)代表性化合物丹參酮IIA 質(zhì)譜裂解過(guò)程為例，在正離子模式下可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z317.11 [M+Na]+，擬合其分子式為C19H18O3，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級(jí)碎片離子m/z69.07 [M+Na-C14H9O3Na]+，m/z67.05 [M+Na-C14H9O3Na-H2]+，相應(yīng)質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖5。

圖5 丹參酮ⅡA可能裂解途徑

3.5 苯丙素類

從參仙升脈口服液中鑒定的苯丙素類成分有15種，主要包括補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素等。以65 號(hào)代表性化合物補(bǔ)骨脂苷質(zhì)譜裂解過(guò)程為例，在正離子模式下可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z389.08 [M+Na]+，擬合其分子式為C17H18O9，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級(jí)碎片離子m/z227.03 [M+Na-C6H10O5]+，m/z185.04 [M+Na-C11H8O4]+，相應(yīng)質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖6。

圖6 補(bǔ)骨脂苷可能裂解途徑

3.6 皂苷類

從參仙升脈口服液中鑒定的皂苷類成分有12種，主要包括人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 和人參皂苷Rb1等。以105 號(hào)代表性化合物人參皂苷Rg1 質(zhì)譜裂解過(guò)程為例，在正離子模式下可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z823.48 [M+Na]+，擬合其分子式為C42H72O14，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級(jí)碎片離子m/z643.42 [M+Na-C6H12O6]+，m/z203.05 [M+Na-C36H60O8]+，相應(yīng)質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖7。

圖7 人參皂苷Rg1可能裂解途徑

3.7 其他類

此外，本研究還從參仙升脈口服液中鑒定出了多種其他類化合物，包括10 種酯類、9 種糖類、8 種揮發(fā)油類、7種酚類和6種酮類，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

4 討論

參仙升脈口服液由八味中藥組成，化學(xué)組分十分復(fù)雜，其藥效與不良反應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)均不明晰。本研究采用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS 技術(shù)，正負(fù)離子切換掃描，較為全面地對(duì)參仙升脈口服液中的化學(xué)成分進(jìn)行了快速、系統(tǒng)的分析，首次從中鑒定出160個(gè)化學(xué)成分。參仙升脈口服液的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類型主要包括黃酮類、皂苷類、生物堿類、有機(jī)酸類、苯丙素類、萜類等。其中，黃酮類、皂苷類、生物堿類和萜類化合物主要?dú)w屬于藥材淫羊藿、紅參、麻黃和丹參。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃酮[38]、生物堿和皂苷類化合物[39]對(duì)心血管疾病具有顯著的藥理活性；某些苯丙素[40]和有機(jī)酸類成分如咖啡酸、綠原酸、原兒茶酸等能抑制血小板聚集、抗血栓[41]；萜類化合物可能具有一定的強(qiáng)心作用[42]。已有研究表明紅參、淫羊藿和丹參具有保護(hù)心血管、抗心律失常作用，景雅婷等[43]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1可通過(guò)抑制TGF-β通路和Periostin蛋白表達(dá)，有效防治心力衰竭；劉守義等[44]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿總黃酮苷可以阻滯β 受體，減少Na+、Ca2+內(nèi)流，從而降低自律性；Maione 等[45]研究表明丹參酮ⅡA 是潛在的改善血液微循環(huán)，預(yù)防腦血管疾病的有效藥物，丹參酮ⅡA 能升高心型脂肪酸結(jié)合蛋白水平，降低心肌組織缺血修飾白蛋白水平，對(duì)心肌缺血再灌注損傷及心律失常具有良好的防治作用[46]。補(bǔ)骨脂中香豆素類成分也具有保護(hù)心血管系統(tǒng)作用，補(bǔ)骨脂素能夠減少TNF-α 誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的組織因子釋放，降低血栓形成風(fēng)險(xiǎn)[47]。此外，研究表明，組方藥材細(xì)辛的主要化學(xué)成分黃樟醚，可致肝臟毒性[48]。以上提示參仙升脈口服液發(fā)揮治療緩慢性心律失常的作用和引發(fā)不良反應(yīng)與這些成分有著密切的聯(lián)系。本研究初步闡明了參仙升脈口服液的化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)，為其進(jìn)一步藥效物質(zhì)的明確及全面的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。