張?zhí)m蘭，施文婷，陳偉媚，楊 贊，黃醒鵬，田清清，張 正

（廣東一方制藥有限公司廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 佛山 528244）

板藍(lán)根藥用部位為干燥根，取自十字花科植物菘藍(lán)（拉丁名為Isatis indigoticaFort.），具苦寒之性，有清熱解毒、涼血利咽的功效，可用于瘟疫時(shí)毒、發(fā)熱咽痛等病癥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根具有豐富的藥理作用，包括抗菌、抗病毒、抗內(nèi)毒素和增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等[2]，具有重要的臨床價(jià)值。板藍(lán)根主要化學(xué)成分有核苷類、木脂素類和生物堿類[3-4]，其中生物堿類是其抗病毒作用的關(guān)鍵成分，核苷類可干擾病毒核酸的合成達(dá)到抗病毒效果[5-6]。板藍(lán)根配方顆粒是由板藍(lán)根飲片經(jīng)現(xiàn)代工藝加工而成，陳諾[7]利用薄層色譜法和高效液相色譜法驗(yàn)證了板藍(lán)根配方顆粒及其飲片在化學(xué)成分上的一致性及等效性，早年亦有學(xué)者研究了不同干燥方式對(duì)板藍(lán)根水提物有效成分的影響，證明了噴霧干燥的優(yōu)勢(shì)[8-10]，但尚未出現(xiàn)有關(guān)板藍(lán)根配方顆粒噴霧干燥工藝的系統(tǒng)研究報(bào)道。

中藥制劑工藝包括提取、分離純化、干燥、制劑成型等環(huán)節(jié)，各工藝單元對(duì)中間體及制劑成品的質(zhì)量均會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響。因此，本文基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（Quality by design，QbD）理念對(duì)板藍(lán)根配方顆粒成型過(guò)程中的噴霧干燥工藝進(jìn)行研究，結(jié)合信息熵賦值法，以得粉率、尿苷含量、腺苷含量、鳥苷含量和(R,S)-告依春含量的綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[11]，通過(guò)Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)（PBD）篩選關(guān)鍵工藝參數(shù)，再通過(guò)中心點(diǎn)復(fù)合設(shè)計(jì)（Center Point Composite design，CCD）優(yōu)化關(guān)鍵工藝參數(shù)，建立板藍(lán)根配方顆粒噴霧干燥工藝的數(shù)學(xué)模型和設(shè)計(jì)空間，最后進(jìn)行工藝驗(yàn)證[12]，以期為板藍(lán)根配方顆粒的生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

本研究所用儀器詳見(jiàn)表1。

表1 研究所用儀器

1.2 試藥

本研究所用試藥詳見(jiàn)表2，其中板藍(lán)根藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定正品，同時(shí)經(jīng)質(zhì)量部門檢驗(yàn)合格，可供本研究使用。

表2 研究所用試藥

2 方法與結(jié)果

2.1 板藍(lán)根清膏的制備

按照2020 版《中國(guó)藥典》一部板藍(lán)根項(xiàng)下飲片炮制方法[1]，將板藍(lán)根藥材制成板藍(lán)根飲片，再依據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》的相關(guān)規(guī)定[13]，確定板藍(lán)根浸膏的制備方法為：取板藍(lán)根飲片1.6 kg，第1 次加飲片量8 倍水，加熱煎煮30 min，第2 次加飲片量6 倍水，加熱煎煮30 min，提取液均趁熱用350 目篩網(wǎng)濾過(guò)，減壓濃縮（70℃，-0.1 MPa）至相對(duì)密度為1.12（70℃）的清膏樣品，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 噴干粉得粉率計(jì)算

每組試驗(yàn)取板藍(lán)根清膏適量，控制每組試驗(yàn)所用清膏含固量約為30 g，置于磁力攪拌器上，按各試驗(yàn)組要求調(diào)節(jié)所需工藝參數(shù)進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥結(jié)束后，在相對(duì)濕度為40%以下的環(huán)境中收集噴干粉，計(jì)算每組試驗(yàn)得粉率，計(jì)算公式為：噴干粉得粉率（%）=噴干粉量/清膏含固量×100[11]。

2.3 四種成分含量測(cè)定方法

2.3.1 色譜條件

采用Agilent TC(2) C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇、0.1%磷酸溶液構(gòu)成的雙相溶劑系統(tǒng)按表3 所示進(jìn)行梯度洗脫[14]；每分流速為0.8 mL；色譜柱溫度為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

表3 梯度洗脫表

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春對(duì)照品適量，加水制成質(zhì)量濃度分別為79.6204、63.1798、68.8744、142.9000 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

精密稱取板藍(lán)根噴干粉1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入50 mL 水，密塞，稱定重量，設(shè)定數(shù)控超聲波清洗器的功率為600 W、頻率為40 kHz，進(jìn)行20 min的超聲處理，取出，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取空白溶劑、混合對(duì)照品溶液及供試品溶液，依法測(cè)定，記錄色譜圖[15]，如圖1 所示，在相應(yīng)的保留時(shí)間處，供試品溶液與混合對(duì)照品溶液色譜均被洗脫出相同的色譜峰，空白溶劑對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明色譜條件具有良好的專屬性。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖[11,16]。以對(duì)照品質(zhì)量濃度（μg?mL-1）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到各待測(cè)組分的回歸方程及線性范圍見(jiàn)表4。結(jié)果表明各成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

表4 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次[17]，計(jì)算尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春色譜峰峰面積的RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份板藍(lán)根噴干粉，按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定[11]。計(jì)算尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春含量的RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.3.3”項(xiàng)下同一份供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定[11]，計(jì)算尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春色譜峰峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的板藍(lán)根噴干粉適量，精密稱取9份，每份約0.5 g，置具塞錐形瓶中，分為3 組，每組分別按高、中、低濃度精密加入混合對(duì)照品溶液。按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積[18]，計(jì)算加樣回收率及RSD，見(jiàn)表5。結(jié)果表明尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春的平均加樣回收率分別為99.96%、99.61%、97.42%、98.20%，RSD 分別為1.74%、2.75%、2.18%、1.24%。表明該方法準(zhǔn)確度良好。

TCP協(xié)議的通信過(guò)程為：服務(wù)器端必須首先通過(guò)指定IP地址以及端口名建立偵聽(tīng)，等待客戶端響應(yīng)連接；然后客戶端向?qū)?yīng)的服務(wù)器所設(shè)定的IP地址和端口發(fā)出連接請(qǐng)求；待服務(wù)器與客戶端成功建立連接后，雙方方可通過(guò)讀寫函數(shù)控件收發(fā)數(shù)據(jù)，完成數(shù)據(jù)傳輸時(shí)，需先從客戶端斷開(kāi)連接后服務(wù)器才能斷開(kāi)連接。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n = 9）

2.5 數(shù)據(jù)處理

熵值法是一種基于差異驅(qū)動(dòng)的客觀賦權(quán)法，即根據(jù)各個(gè)指標(biāo)在總體中的變異程度賦予權(quán)重[19]。指標(biāo)變異程度越大，則信息熵越小，能提供的有效信息就越多，其賦予的權(quán)重也就越大[20]。

①數(shù)據(jù)無(wú)量綱處理：由于不同指標(biāo)之間數(shù)量級(jí)不同，需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。本文根據(jù)公式：無(wú)量綱化值（Yij）＝（實(shí)測(cè)值－最小值）/（最大值－最小值）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，即

式（1）中Xij表示第i次試驗(yàn)中j項(xiàng)指標(biāo)所得試驗(yàn)值。

②消零處理：原始數(shù)據(jù)無(wú)量綱化處理后數(shù)據(jù)的最小值為0，為了使數(shù)據(jù)有意義，本文對(duì)Yij的最小值0 取0.001。

③數(shù)據(jù)歸一化處理：根據(jù)公式對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，即計(jì)算第i次試驗(yàn)在j項(xiàng)指標(biāo)下的概率，計(jì)算公式：

式（2）中n表示試驗(yàn)組數(shù)。

④各指標(biāo)信息熵計(jì)算：根據(jù)公式：

⑥各指標(biāo)熵權(quán)系數(shù)計(jì)算：根據(jù)公式：

式（5）中Wj表示第j項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重值，m 表示試驗(yàn)指標(biāo)個(gè)數(shù)。

2.6 板藍(lán)根噴霧干燥工藝優(yōu)化

2.6.1 確定關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPPs）和關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）

中藥噴霧干燥過(guò)程的影響因素主要包括：工藝參數(shù)、藥液、環(huán)境、設(shè)備[21-22]，見(jiàn)圖2。根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)及文獻(xiàn)查閱[22-24]，初步選取藥液相對(duì)密度、藥液溫度、進(jìn)液速度、進(jìn)風(fēng)溫度和霧化壓力作為影響板藍(lán)根噴霧干燥工藝的CPPs。2020 年版《中國(guó)藥典》一部板藍(lán)根項(xiàng)下對(duì)(R,S)-告依春成分進(jìn)行定量控制[1]，國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的《關(guān)于中藥配方顆粒國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（第一批）的公示》項(xiàng)下“008.板藍(lán)根配方顆粒（編號(hào)：YBZ-PFKL-2021008）”同樣對(duì)(R,S)-告依春進(jìn)行定量控制，同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)中的特征圖譜中以尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春作為特征峰[14]。研究表明，核苷類成分是板藍(lán)根抗病毒作用的主要活性成分[25]，選取以上4 個(gè)成分進(jìn)行含量測(cè)定對(duì)板藍(lán)根配方顆粒質(zhì)量控制具重要意義。板藍(lán)根噴干粉的得粉率直接影響生產(chǎn)產(chǎn)量，因此將得粉率和尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春的含量作為板藍(lán)根噴霧干燥工藝的CQAs。

圖2 板藍(lán)根配方顆粒噴霧干燥工藝參數(shù)篩選魚骨圖

2.6.2 PBD試驗(yàn)篩選CPPs

Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)可通過(guò)較少的試驗(yàn)從眾多影響因素中快速、準(zhǔn)確、高效地篩選出顯著因素[26]。以藥液相對(duì)密度（A）、藥液溫度（B）、進(jìn)液速度（C）、進(jìn)風(fēng)溫度（D）、霧化壓力（E）為自變量，以得粉率（Y1）和尿苷（Y2）、腺苷（Y3）、鳥苷（Y4）、（R,S）-告依春（Y5）的含量作為CQAs，采用Minitab 16.0 軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)由五因素兩水平組成，共12 組試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6、表7。

表6 PBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

表7 PBD試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)PBD 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表8，可知藥液相對(duì)密度（A）和進(jìn)液速度（C）對(duì)OD值的影響顯著（P<0.05），其它三個(gè)因素對(duì)OD 值無(wú)顯著影響，故下一步選擇藥液相對(duì)密度和進(jìn)液速度作為優(yōu)化試驗(yàn)的關(guān)鍵工藝參數(shù)。

表8 PBD試驗(yàn)的方差分析結(jié)果

2.6.3 CCD試驗(yàn)優(yōu)化關(guān)鍵工藝參數(shù)

基于上述PBD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用CCD進(jìn)一步優(yōu)化板藍(lán)根配方顆粒噴霧干燥工藝。以藥液相對(duì)密度（A）和進(jìn)液速度（C）為關(guān)鍵考察因素，控制其余3個(gè)不顯著影響因素的水平分別為進(jìn)風(fēng)溫度175℃，藥液溫度50℃，霧化壓力0.5 Mpa，采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表9、表10。

表9 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

表10 CCD試驗(yàn)結(jié)果

采用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)表10 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以藥液相對(duì)密度（A）、進(jìn)液速度（C）為自變量，Y1-Y5的總評(píng)OD 值為因變量，進(jìn)行多元回歸分析，并進(jìn)行方差分析和擬合優(yōu)度分析。由模型擬合結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二次多項(xiàng)式模型擬合方程有顯著意義，回歸方程為OD=-93.09408+165.51492A+0.31313C-0.24187AC-73.58594A2-0.000742375C2，其方差分析見(jiàn)表11，藥液相對(duì)密度（A）、進(jìn)液速度（C）對(duì)OD 值影響的三維效應(yīng)面圖和等高線圖，見(jiàn)圖3。

圖3 藥液相對(duì)密度和進(jìn)液速度對(duì)OD值影響的響應(yīng)面圖與等高線圖

表11 回歸模型的方差分析及擬合優(yōu)度分析

由表11可知，回歸模型P<0.05，失擬項(xiàng)P>0.05，表明該方程模型顯著性高，擬合度良好，失擬項(xiàng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未知因素對(duì)試驗(yàn)干擾較小，可用于板藍(lán)根配方顆粒噴霧干燥工藝參數(shù)優(yōu)化過(guò)程的預(yù)測(cè)?；貧w模型中A、C、AC、A2、C2的P值均小于0.05，說(shuō)明均對(duì)OD值影響顯著。由圖3 可知，當(dāng)藥液相對(duì)密度一定時(shí)，OD 值隨進(jìn)液速度的增加而增大；當(dāng)進(jìn)液速度一定時(shí)，OD值隨藥液相對(duì)密度的增加而增加。

2.7 設(shè)計(jì)空間建立

在設(shè)定的參數(shù)空間內(nèi)搜索滿足OD 值大于0.65 的所有因素組合，同時(shí)設(shè)置α=0.05 水平的置信區(qū)間，即構(gòu)成設(shè)計(jì)空間，結(jié)果用Overlay polt 展示，見(jiàn)圖4。圖中亮黃色區(qū)域?yàn)榧尤?5%置信區(qū)間后的設(shè)計(jì)空間，在此設(shè)計(jì)空間所有的點(diǎn)都符合工藝目標(biāo)的期望值，暗黃色區(qū)域?yàn)樵O(shè)計(jì)空間內(nèi)不可靠的部分，在此空間的所有點(diǎn)有5%的概率無(wú)法滿足工藝目標(biāo)。因設(shè)計(jì)空間并不規(guī)則，不便對(duì)二者進(jìn)行嚴(yán)格控制[12]，為了便于操作，推薦的操作空間范圍藥液相對(duì)密度為1.05-1.08，進(jìn)液速度為30%-40%。

圖4 板藍(lán)根配方顆粒噴霧干燥工藝設(shè)計(jì)空間

2.8 設(shè)計(jì)空間驗(yàn)證試驗(yàn)

在設(shè)計(jì)空間內(nèi)隨即選取6個(gè)工藝設(shè)計(jì)參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，用來(lái)檢驗(yàn)所建模型的預(yù)測(cè)能力[27]。1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)為95%置信區(qū)間內(nèi)的點(diǎn)（亮黃色區(qū)域），4 號(hào)、5 號(hào)、6 號(hào)為原設(shè)計(jì)空間內(nèi)，95%置信區(qū)間外的點(diǎn)（淺黃色區(qū)域）[12]，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表12。對(duì)表12中OD 值的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果P值大于0.05，表明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異，可見(jiàn)模型具有良好的預(yù)測(cè)能力。

表12 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念正在推動(dòng)制藥生產(chǎn)模式的轉(zhuǎn)變，并獲得了廣泛的關(guān)注[28]，QbD 理念在中藥制劑工藝設(shè)計(jì)的各個(gè)方面均有應(yīng)用，包括飲片炮制、提取、分離純化、干燥、制劑等，旨在提高工藝穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量可控性[25]。QbD 理念的核心是設(shè)計(jì)空間的建立，設(shè)計(jì)空間是能保證工藝品質(zhì)的關(guān)鍵物料屬性和工藝參數(shù)的范圍組合[29-30]。本文便是基于QbD 理念，在Plackett-Burman 試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)CCD 構(gòu)建了板藍(lán)根噴霧干燥過(guò)程中CQA 與工藝CPPs 的回歸模型及工藝設(shè)計(jì)空間，并進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明工藝參數(shù)在該設(shè)計(jì)空間內(nèi)能保證板藍(lán)根配方顆粒噴霧干燥過(guò)程和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。