馬若飛，蘇 苗，李金田，2＊＊，李 娟，張 毅，徐韋瑋，姜佳辰

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院 蘭州 730101；2.敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 蘭州 730101）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive Pulmonary disease，COPD），是一種常見的慢性氣道疾病，其特征是持續(xù)存在的氣流受限及相應(yīng)的呼吸系統(tǒng)癥狀[1]。COPD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，其中炎癥反應(yīng)是COPD 的重要發(fā)病機(jī)制，免疫失衡可導(dǎo)致慢性炎癥持續(xù)加重，肺部及氣道的炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫功能失衡是COPD 患者肺組織損傷甚至死亡的主要原因[2]。輔助性T 細(xì)胞1（helper T cells 1，Th1）和輔助性T 細(xì)胞2（helper T cells 2，Th2）失衡引起的促炎/抗炎因子失衡是COPD 重要發(fā)病機(jī)制之一，在免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[3]。TNF-α 是COPD 發(fā)病過程中重要的炎癥和免疫調(diào)節(jié)因子[4]。果蠅雙翅邊緣缺刻同源基因（Notch）通路的受體Notch1/2/3/4 與配體Delta1/3/4、Jagged1/2 均為表達(dá)于細(xì)胞表面的單跨膜蛋白，受體配體結(jié)合后引起信號(hào)活化，下游靶基因Hes 和Hey 家族被激活，從而影響T 淋巴細(xì)胞的分化、增殖、凋亡[5]。Notch 通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及免疫失衡與COPD 肺組織及氣道炎癥損傷關(guān)系密切[6]。因此，Notch 信號(hào)通路介導(dǎo)的Th1/Th2 細(xì)胞失衡是COPD 發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制。

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療COPD 的常規(guī)方法包括支氣管舒張劑、糖皮質(zhì)激素等藥物治療及呼吸支持等非藥物治療[1]，常伴有不良反應(yīng)及并發(fā)癥，且經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重，亟需探索更為安全有效的治療方法。芪蛭皺肺顆粒由導(dǎo)師李金田教授基于多年臨床經(jīng)驗(yàn)及COPD 本虛標(biāo)實(shí)的病機(jī)特點(diǎn)研治而成，諸藥共奏益氣活血祛痰、理肺除脹平喘之功。課題組前期基礎(chǔ)研究證實(shí)，芪蛭皺肺顆粒具有緩解氣道炎癥、增強(qiáng)免疫功能、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)等作用[7-9]；臨床研究表明，芪蛭皺肺顆粒聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)治療可有效改善AECOPD 患者痰瘀阻肺證癥狀[10]。

Th1、Th2、輔助性T 細(xì)胞17（Helper T cells 17，Th17）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Regulatory T cells，Treg）均由CD4+T 細(xì)胞分化而來(lái)，Notch 信號(hào)通路可通過調(diào)控CD4+T 細(xì)胞的分化水平從而影響Th 細(xì)胞比例平衡[11]。部分研究表明通過調(diào)節(jié)Notch 信號(hào)通路從而調(diào)控Th17/Treg 平衡可能是防治COPD 的有效方法[12-13]，但少有研究從調(diào)節(jié)Notch 信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控Th1/Th2 平衡的角度介入治療COPD?；诖?，本研究通過建立COPD 大鼠模型，進(jìn)一步闡明Notch 信號(hào)通路與Th1/Th2 免疫平衡間的關(guān)系，以及研究芪蛭皺肺顆粒調(diào)控Th1/Th2 免疫平衡是否與Notch 信號(hào)通路相關(guān)，進(jìn)一步明確芪蛭皺肺顆粒治療COPD的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)Wistar 大鼠70 只，雄性，體質(zhì)量200±20 g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度（24±1）℃，濕度55%±5%。動(dòng)物質(zhì)量證書許可證編號(hào)：SYXK（甘）2020-0001，動(dòng)物設(shè)施使用證編號(hào)：SYXK（甘）2020-0009。

1.2 藥物

芪蛭皺肺顆粒（生產(chǎn)批號(hào)：170501）：由黃芪、水蛭、黨參、丹參、麥冬等組成，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥制備室生產(chǎn)，1 g芪蛭皺肺顆粒相當(dāng)于原生藥材6 g。醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，藥品準(zhǔn)字號(hào)：H33020822）：0.75 mg/片。蘭州香煙（甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司）：焦油量14 mg，煙氣煙堿量1.1 mg，煙氣一氧化碳量14 mg。

1.3 試劑

脂多糖（LPS）、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Solarbio，貨號(hào)分別為707F031、20210310、20211118）；Alexa Fluor?647 anti-rat IFN-γAntibody、PE anti-rat IL-4 Antibody（Biolegend，貨號(hào)分別為 B311332、B332500）；Anti-Notch1 antibody（Abcam，貨號(hào)ab167441）；Hes1 antibody（GeneTex，貨號(hào)No.GTX108356）；Hey1 Rabbit Polyclonal antibody（Proteintech Group，Inc，貨號(hào)19929-1-AP）；Anti-β-actin，Goat Anti-Rabbit、Goat Anti-Mouse（Immunoway Biotechnology，貨號(hào)分別為YM3028、RS0002、RS0001）；Rat TNF-α ELISA KIT（武漢北鹿森生物科技有限公司，貨號(hào)0153320221011）；檸檬酸（pH=6.0）抗原修復(fù)液、EDTA 抗原修復(fù)液（pH=9.0）、EDTA 抗原修復(fù)液（pH=8.0）、蘇木素染液、蘇木素分化液、蘇木素返藍(lán)液、組化試劑盒DAB 顯色劑（Servicebio，貨號(hào)分別為G1202、G1203、G1206、G1004、G1309、G1340、G1211）；TRIeasyTMTotal RNA Extraction Reagent TRIeasyTM總RNA 提取試劑（YEASEN，貨號(hào)19926940）；Hyper ScriptⅢ RT Super Mix for qPCR with gDNA Remover、2×S6 Unlversal SYBR qPCR Mix（NovaBio，貨號(hào)分別為F2439、F3528）。

1.4 儀器

WPB PLT-UNR-RT-2 動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)（EMKA Beschlagteile）；RM2437 型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（Leica Biosystems）；組化筆（Servicebio）；顯微鏡，成像系統(tǒng)（Nikon）；FACSCANTO Ⅱ流式細(xì)胞儀（Becton，Dickinson and Company）；iQTM5型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）儀（Bio-Rad）；Mark1509 酶標(biāo)儀（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 COPD大鼠模型制備

70 只Wistar 大鼠，隨機(jī)選取10 只作為空白對(duì)照組，其余大鼠作為造模組，采用香煙煙霧（CS）聯(lián)合氣管滴注脂多糖（LPS）法建立COPD 模型[14]。分別于第1、14 天行氣管插管，氣管滴注0.2 mL LPS（1 g·L-1）；第2-13、15-28 天，每次將10 只左右大鼠放置在容積為150 L（60 cm×50 cm×50 cm）的自制有機(jī)玻璃染毒箱內(nèi)進(jìn)行被動(dòng)吸煙，每天1次，每次30 min，每只1支。造模結(jié)束后，空白對(duì)照組及造模組各隨機(jī)選取3 只大鼠進(jìn)行肺功能與肺組織病理檢測(cè)，以客觀評(píng)價(jià)本次模型。

2.2 分組及給藥

造模結(jié)束后，空白對(duì)照組常規(guī)喂養(yǎng)，造模組大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及芪蛭皺肺顆粒高、中、低劑量組。給藥劑量參照《實(shí)驗(yàn)藥理方法學(xué)》，大鼠給藥劑量=人臨床劑量/70 kg×6.3[15]。第29 天開始，按3.24、1.62、0.81 g·kg-1劑量分別給高、中、低劑量組大鼠灌胃芪蛭皺肺顆?；鞈乙海?yáng)性對(duì)照組給予醋酸地塞米松混懸液67.5 μg·kg-1，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積生理鹽水（10 mL·kg-1），持續(xù)給藥28天。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 觀察大鼠一般狀況

每日觀察大鼠呼吸情況，鼻腔分泌物，精神活動(dòng)狀態(tài)，毛色，進(jìn)食、飲水量等。每周稱量并記錄大鼠體質(zhì)量。

2.3.2 肺功能

最后一次灌胃治療結(jié)束后，從SPF 級(jí)動(dòng)物房取出大鼠。做好標(biāo)記，采用動(dòng)物肺功能測(cè)試系統(tǒng)，清醒狀態(tài)下檢測(cè)吸氣峰流速（PIF）和呼氣峰流速（PEF）。

2.3.3 肺組織病理

各組大鼠肺功能檢測(cè)完成后，禁食24 h，3%戊巴比妥鈉（45 mg·kg-1）腹腔注射麻醉。腹主動(dòng)脈取血，常溫，3500 r·min-1，離心15 min，制備血清。解剖出完整的肺和氣管，緩慢向氣管內(nèi)注入注射用生理鹽水1 mL，再緩慢吸出，重復(fù)2 次，回收支氣管肺泡灌洗液（BALF），無(wú)菌紗布過濾，置于離心管中，4℃，2000 r·min-1，離心5 min，取上清液。將血清、BALF 及部分肺組織置于-80冰箱中保存?zhèn)溆?，其余肺組織采用4%多聚甲醛固定，包埋，切片，脫蠟至水，蘇木素-伊紅（HE）染色，脫水，透明后中性樹膠封片，200 倍光鏡觀察肺組織病理變化。參考周勇等[16]的方法，根據(jù)支氣管壁破壞程度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度、支氣管腔內(nèi)物質(zhì)（“有無(wú)”及“多少”）、支氣管周圍肺泡病理改變等進(jìn)行評(píng)分，無(wú)病變?yōu)? 分、輕度病變?yōu)? 分、中度病變?yōu)? 分、重度病變?yōu)?分。

2.3.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)大鼠血清及BALF中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量

取出-80℃冰箱保存的血清及BALF，按ELISA 試劑盒說明書操作。

2.3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠脾臟Th1/Th2細(xì)胞比例

取脾臟，研磨，200 目濾網(wǎng)濾過，制成單細(xì)胞懸液，緩慢加入大鼠淋巴細(xì)胞分離液，2500 r·min-1，離心20 min，調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度為每毫升1×106個(gè)。加入CD4 抗體，4℃避光孵育30 min，用流式緩沖液洗滌，用破膜溶液對(duì)細(xì)胞固定破膜，分別加入藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的IL-4 及Alexa Fluor 647 標(biāo)記的IFN-γ 進(jìn)行染色，4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1、Th2 細(xì)胞表達(dá)水平，分析Th1/Th2亞群比例。

2.3.6 免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)肺組織Notch1蛋白表達(dá)

肺組織病理切片石蠟包埋，切片，脫蠟至水；枸櫞酸鹽緩沖液沖洗，高壓鍋煮沸，自然冷卻，PBS 沖洗，H2O2封閉；加Notch1 抗體（1:200 稀釋），室溫孵育；加二抗后37℃孵育30 min，DAB 顯色；自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染數(shù)秒；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固；光學(xué)顯微鏡（×400）下隨機(jī)選取1個(gè)視野，以棕黃色為陽(yáng)性染色，用Image-pro Plus 軟件測(cè)定總的光密度值（IOD）。

2.3.7 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)肺組織Notch1、Hes1、Hey1蛋白表達(dá)

取出-80℃冰箱保存的肺組織，4℃冰箱解凍后加入RIPA 裂解液，經(jīng)組織研磨儀研磨后，12000 r·min-1離心15 min，取上清液，用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。上樣，80 V 電泳30 min，110 V 電泳1 h，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜，設(shè)置電流25 mA、15 min。5%脫脂奶粉室溫下封閉4 h，加入鼠一抗Notch1（1∶1000 稀釋），兔一抗Hes1（1∶1000 稀釋）、Hey1（1∶2000 稀釋）和內(nèi)參β-actin（1∶5000 稀釋），4℃孵育過夜。分別加入羊抗小鼠二抗（1:5000）及羊抗兔二抗（1∶5000），室溫?fù)u床孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，并用Image J 軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2.3.8 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）檢測(cè)肺組織Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表達(dá)

取出-80℃冰箱保存的肺組織，4℃冰箱解凍后，用總RNA 提取試劑提取肺組織總RNA 并測(cè)定其濃度和純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按SYBR 試劑盒說明書和PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)變性95℃、30 s，PCR 擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，95℃變性10 s，60℃退火30 s；以β-actin 為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算Notch1、Hes1、Hey1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，序列如下：①Notch1 上游引物：5’-GCCAGCAAGAAGAAGCGGAGAG-3’，下游引物：5’-CCACTCGTTCTGATTGTCGTCCATC-3’（108 bP）；②Hes1 上游引物：5’-CTAACGCAGTGTCG CCTTCCAG-3’，下游引物：5’-AGAGAGGTGGGCTA GGGAGTTTATG-3’（116 bP）；③Hey1 上游引物：5’-C GGGAATGCCTGGCTGAAGTTG-3’，下游引物：5’-GGGATGCGTAGTTGTTGAGATGGG-3’（109 bP）；④β-actin 上游引物：5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTC CTA-3’，下游引物：5’-GACTCATCGTACTCCTGCT TGCTG-3’（150 bP）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

造模過程中空白對(duì)照組大鼠無(wú)死亡，造模組大鼠因氣管插管致2 只死亡，麻醉致2 只死亡，煙熏過程中4 只死亡，造模結(jié)束隨機(jī)選取空白對(duì)照組與造模組各3 只用于驗(yàn)證模型是否成功；灌胃給藥過程中無(wú)大鼠死亡。最終各組大鼠數(shù)量情況如下：空白對(duì)照組7只，模型對(duì)照組10 只，陽(yáng)性對(duì)照組10 只，芪蛭皺肺高劑量組10 只，芪蛭皺肺中劑量組10 只，芪蛭皺肺低劑量組9只。

空白對(duì)照組大鼠呼吸狀態(tài)平穩(wěn)，精神情況良好，皮毛顏色正常有光澤，體質(zhì)量勻速增長(zhǎng)。28 天造模過程中，造模組大鼠逐漸出現(xiàn)喘促、鼻中分泌物由稀薄變粘稠等呼吸系統(tǒng)癥狀，伴有不同程度的毛色萎黃，此外出現(xiàn)活動(dòng)力下降、體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢等。經(jīng)28天灌胃治療后，芪蛭皺肺高、中劑量組大鼠喘促等癥狀減輕，鼻腔分泌物逐漸減少，精神活動(dòng)狀態(tài)良好，皮毛逐漸恢復(fù)光澤；低劑量組大鼠一般狀況改善不明顯。

3.2 對(duì)COPD大鼠肺功能的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠PIF、PEF 顯著降低（P<0.05）；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及芪蛭皺肺高、中、低劑量組PIF、PEF 顯著升高（P<0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，芪蛭皺肺中、低劑量組PIF、PEF顯著降低（P<0.05）。見表1。

表1 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠肺功能的影（±s）

表1 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠肺功能的影（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，$P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，*P<0.05。

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組芪蛭皺肺高劑量組芪蛭皺肺中劑量組芪蛭皺肺低劑量組n PEF（mL·s-1）43.57±8.85 6.71±0.47$36.59±5.35#34.81±4.34#25.04±3.24#*15.46±2.06#*7 10 10 10 10 9 PIF（mL·s-1）37.45±3.38 5.84±0.64$32.80±3.76#30.51±2.05#24.14±2.60#*15.86±1.89#*

3.3 對(duì)COPD大鼠肺組織病理變化的影響

空白對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本完整，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管腔內(nèi)可見少量嗜酸性物質(zhì)，小面積肺組織出血，可能是灌胃生理鹽水時(shí)因操作不當(dāng)造成的損傷。模型對(duì)照組大鼠肺組織可見多灶性肺泡壁增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管可見上皮細(xì)胞壞死，核固縮，胞質(zhì)空泡化，管腔內(nèi)可見嗜酸性物質(zhì)。陽(yáng)性對(duì)照組可見中等面積肺泡壁增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管少量上皮細(xì)胞壞死，核固縮，胞質(zhì)空泡化，管腔內(nèi)可見少量壞死脫落的上皮細(xì)胞及嗜酸性物質(zhì)。芪蛭皺肺高劑量組可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管少量上皮細(xì)胞壞死，核固縮，胞質(zhì)空泡化，管腔內(nèi)少量壞死脫落的上皮細(xì)胞，未見明顯嗜酸性物質(zhì)。中劑量組多灶性肺泡壁增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管上皮細(xì)胞壞死，核固縮，胞質(zhì)空泡化。低劑量組可見肺泡擴(kuò)張，肺泡壁大面積增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管可見上皮細(xì)胞水樣變性，胞質(zhì)疏松淡染，管腔內(nèi)少量嗜酸性物質(zhì)（見圖1）。

圖1 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD模型大鼠肺組織病理學(xué)影響（HE，×200）

空白對(duì)照組肺組織病理半定量評(píng)分為（1.21±0.26）分，模型對(duì)照組為（2.65±0.52）分，陽(yáng)性對(duì)照組為（1.44±0.37）分，芪蛭皺肺高劑量組為（1.51±0.41）分，中劑量組為（1.70±0.45）分，低劑量組為（1.93±0.48）分。與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組半定量評(píng)分顯著升高（P<0.05）；與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及芪蛭皺肺顆粒高、中、低劑量組評(píng)分顯著降低（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 對(duì)COPD大鼠血清及BALF中TNF-α含量的影響

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠血清及BALF 中TNF-α 含量均顯著升高（P<0.05）。與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及芪蛭皺肺高、中、低劑量組血清及BALF 中TNF-α 含量均顯著降低（P<0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，芪蛭皺肺中、低劑量組血清及BALF 中TNF-α含量均顯著升高（P<0.05）（見表2）。

表2 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠血清及BALF中TNF-α含量的影響（±s）

表2 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠血清及BALF中TNF-α含量的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，$P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，*P<0.05。

n BALF（pg·mL-1）73.44±5.23 179.90±8.47$98.27±6.20#109.75±6.07#125.45±6.85#*153.33±7.50#*組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組芪蛭皺肺高劑量組芪蛭皺肺中劑量組芪蛭皺肺低劑量組7 10 10 10 10 9血清（pg·mL-1）55.38±5.08 153.51±6.83$83.61±5.69#96.56±5.22#118.85±5.78#*132.81±5.21#*

3.5 對(duì)COPD大鼠脾臟Th1/Th2細(xì)胞比例的影響

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠脾臟Th2 細(xì)胞水平明顯升高，Th1 水平明顯下降，Th1/Th2 細(xì)胞比例呈不均衡狀態(tài)（均為P<0.05）。與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及芪蛭皺肺高、中劑量組Th2 細(xì)胞水平明顯降低（均為P<0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組及芪蛭皺肺高、中、低劑量組Th1水平均明顯升高，Th1/Th2比例逐漸恢復(fù)平衡（均為P<0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，芪蛭皺肺高、中、低劑量組Th2 水平明顯升高，Th1 水平明顯降低（P<0.05）（見表3，圖2、圖3）。

圖2 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠脾臟中Th2細(xì)胞比例的影響

圖3 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠脾臟中Th1細(xì)胞比例的影響

表3 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠脾臟Th1/Th2細(xì)胞比例的影響（±s）

表3 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠脾臟Th1/Th2細(xì)胞比例的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，$P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，*P<0.05。

Th1/Th2 3.25±0.11 0.23±0.01$2.29±0.10#1.48±0.01#*0.58±0.01#*0.41±0.02#*組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組芪蛭皺肺高劑量組芪蛭皺肺中劑量組芪蛭皺肺低劑量組n 7 10 10 10 10 9 Th1（%）4.63±0.17 1.31±0.10$3.47±0.09#2.88±0.11#*2.31±0.12#*2.15±0.14#*Th2（%）1.42±0.05 5.70±0.71$1.52±0.10#1.95±0.09#*3.97±0.24#*5.19±0.11*

3.6 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD 大鼠肺組織Notch1 蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠肺組織Notch1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及芪蛭皺肺顆高、中劑量組Notch1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，芪蛭皺肺低劑量組Notch1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）（見表4，圖4）。

圖4 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠肺組織Notch1蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，×400）

表4 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠肺組織Notch1蛋白表達(dá)的影響（±s）

表4 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠肺組織Notch1蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，$P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，*P<0.05。

Notch1 0.02±0.01 0.22±0.04$0.11±0.02#0.10±0.01#0.14±0.01#0.18±0.02*組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組芪蛭皺肺高劑量組芪蛭皺肺中劑量組芪蛭皺肺低劑量組n 7 10 10 10 10 9

3.7 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD 大鼠肺組織Hes1、Hey1蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠肺組織Hes1、Hey1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及芪蛭皺肺高、中、低劑量組Hes1、Hey1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，芪蛭皺肺低劑量組Hes1蛋白表達(dá)水平顯著降低，中、低劑量組Hey1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）（見表5，圖5）。

圖5 各組大鼠肺組織Hes1、Hey1蛋白表達(dá)電泳

表5 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠肺組織Hes1、Hey1蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響（±s）

表5 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠肺組織Hes1、Hey1蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，$P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，*P<0.05。

Hey1/β-actin 0.38±0.03 0.81±0.04$0.56±0.03#0.56±0.02#0.68±0.02#*0.70±0.02#*組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組芪蛭皺肺高劑量組芪蛭皺肺中劑量組芪蛭皺肺低劑量組n 7 10 10 10 10 9 Hes1/β-actin 0.38±0.02 0.72±0.04$0.39±0.02#0.39±0.01#0.45±0.02#0.49±0.03#*

3.8 對(duì)COPD 大鼠肺組織Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肺組織Notch1、Hes1、Hey1 mRNA 表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及芪蛭皺肺高、中、低劑量組Notch1、Hey1 mRNA 表達(dá)明顯降低，陽(yáng)性對(duì)照組及芪蛭皺肺高、中劑量組Hes1 mRNA 表達(dá)明顯降低（均為P<0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，芪蛭皺肺中、低劑量組Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）（見表6）。

表6 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠肺組織Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表達(dá)的影響（±s）

表6 芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD大鼠肺組織Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表達(dá)的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，$P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，*P<0.05。

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組芪蛭皺肺高劑量組芪蛭皺肺中劑量組芪蛭皺肺低劑量組n Hey1 1.00±0.08 2.16±0.09$1.21±0.07#1.25±0.03#1.66±0.05#*1.88±0.06#*7 10 10 10 10 9 Notch1 1.00±0.06 2.51±0.10$1.46±0.05#1.52±0.03#1.85±0.13#*2.23±0.04#*Hes1 1.01±0.13 1.92±0.06$1.29±0.05#1.29±0.02#1.59±0.07#*1.83±0.05*

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為COPD 屬“肺脹”“咳嗽”“喘證”等范疇，以咳嗽咳痰、胸悶脹滿、氣促喘急等為主要癥狀，嚴(yán)重者有燥煩感，甚至出現(xiàn)驚厥、喘脫等危候[17]?！兜は姆āた人浴吩唬骸胺蚊浂取颂祾娥鲅K氣而病?！盵18]COPD 病機(jī)特點(diǎn)可概括為本虛標(biāo)實(shí)，肺脾腎三臟虛損，痰瘀交阻。COPD 穩(wěn)定期以虛為主兼見痰瘀，治療以補(bǔ)正扶虛為主。急性加重階段（Acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）以痰瘀為主兼見正虛，治療以宣肺祛邪為主，降氣化痰，活血化瘀[19]。COPD 的治療目前臨床尚無(wú)特效藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)療法常伴有并發(fā)癥及不良反應(yīng)，且經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重，亟需探索更為安全有效的治療方法。芪蛭皺肺顆粒根據(jù)COPD 本虛標(biāo)實(shí)的病機(jī)特點(diǎn)研制而成，組方中黃芪補(bǔ)氣固本益肺，水蛭破血逐瘀通經(jīng)；黨參益肺健脾，丹參、赤芍活血祛瘀；白芥子溫中散寒止咳，枳實(shí)破氣化痰，桔?；抵箍绕酱?；五味子納氣定喘、斂肺止咳，麥冬潤(rùn)肺養(yǎng)陰。諸藥共奏益氣活血逐痰、理肺除脹平喘之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪有效成分黃芪多糖、黃芪甲苷，可誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ），發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[20]，黃芪多糖可有效減輕COPD 大鼠炎癥反應(yīng)[21]；水蛭具有抗炎、抗凝血、抗血栓作用[22]，重組水蛭素可減輕COPD 大鼠氣道重塑[23]；黨參具有免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用[24]，可緩解COPD 小鼠氣道炎癥[25]；丹參具有抗血栓、抗腫瘤等作用[26]，丹參酮ⅡA 可減輕COPD 大鼠炎癥反應(yīng)等[27]。課題組前期研究表明，芪蛭皺肺顆粒能夠抑制COPD 大鼠白細(xì)胞介素4（Interleukin-4，IL-4）功能亢進(jìn)，同時(shí)促進(jìn)IFN-γ 的表達(dá)，恢復(fù)Th1/Th2 免疫平衡，從而減輕肺組織及氣道炎癥[8]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚未完全闡明COPD 發(fā)病機(jī)制，炎癥反應(yīng)及免疫紊亂是導(dǎo)致發(fā)病的重要原因之一，T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的過度免疫反應(yīng)在COPD 發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[28]。COPD 存在氣道及肺實(shí)質(zhì)的慢性炎癥，慢性炎癥狀態(tài)使得T淋巴細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)化和激活，造成免疫紊亂，激活的Th1、Th2、Th17、Treg 等細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎性介質(zhì)，對(duì)氣道及肺實(shí)質(zhì)進(jìn)行破壞[29]。T淋巴細(xì)胞可分化為Th1和Th2細(xì)胞，兩者在功能上相互拮抗，機(jī)體正常時(shí)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。COPD 發(fā)病階段Th1細(xì)胞在COPD穩(wěn)定期優(yōu)勢(shì)表達(dá)，而Th2細(xì)胞在AECOPD 階段優(yōu)勢(shì)表達(dá)，Th1/Th2 免疫失衡使得炎癥反應(yīng)加劇[30]?；謴?fù)Th1/Th2 免疫平衡對(duì)COPD 的治療尤為關(guān)鍵。Notch 信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞靠近接觸之后的活化效應(yīng)，4 個(gè)受體Notch1/2/3/4 和5 個(gè)配體Delta1/3/4、Jagged1/2均為表達(dá)于T淋巴細(xì)胞等成熟免疫細(xì)胞表面的單跨膜蛋白；當(dāng)受體與配體結(jié)合后，具有轉(zhuǎn)錄活性的胞內(nèi)段NICD 被釋放，與轉(zhuǎn)錄因子CSL 結(jié)合，從而激活下游靶基因Hes 和Hey 家族，最終影響T 淋巴細(xì)胞的分化與凋亡等[5,31]。有研究表明，2 型先天性淋巴樣細(xì)胞（ILC2s）可以通過激活Notch/GATA3 信號(hào)通路促進(jìn)AECOPD 階段Th2 細(xì)胞的分化[32]。Notch 信號(hào)通路在肺部疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。研究表明，Notch 信號(hào)通路激活介導(dǎo)的klotho 甲基化通過加重炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡促進(jìn)COPD 發(fā)展[33]。在未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞中，Notch1 是COPD 肺微血管再生的潛在標(biāo)志物[34]。COPD 發(fā)病前可在氣腫性肺組織中觀察到肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常凋亡，MiR-34a 通過調(diào)節(jié)Notch1 減輕CS 誘導(dǎo)的肺內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[35]。而Notch1在COPD 中還可通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）途徑調(diào)節(jié)CS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[36]。長(zhǎng)基因間非編碼RNA00612（LINC00612）可通過調(diào)節(jié)血清微小核糖核酸-31-5p（miR-31-5p）/Notch1 信號(hào)通路減輕人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞株（hpmec）凋亡，炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[37]。異硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate，AITC）可通過Notch1 信號(hào)通路上調(diào)多藥耐藥蛋白（MRP1）含量，從而減輕癥狀[38-39]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）是常用COPD 治療劑，Notch 信號(hào)通路通過磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）途徑緩解CS 誘導(dǎo)的BM-MSCs 功能障礙[40]。Notch 信號(hào)通路介導(dǎo)的Th1/Th2免疫失衡是COPD發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制。

肺功能及組織病理學(xué)是COPD 模型成功的金標(biāo)準(zhǔn)[41]。本研究根據(jù)采用香煙煙霧聯(lián)合氣管滴注LPS 法建立COPD模型，造模后給藥前空白對(duì)照組及造模組各隨機(jī)選取3只大鼠進(jìn)行肺功能及組織病理學(xué)檢測(cè)，肺功能及組織病理學(xué)結(jié)果均提示本次造模成功。經(jīng)給藥干預(yù)后，肺功能結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，造模組大鼠PIF、PEF值均明顯降低；肺組織病理切片顯示，造模組大鼠肺組織與氣道出現(xiàn)支氣管及其周圍肺泡的病變。經(jīng)給藥干預(yù)后，空白對(duì)照組大鼠及COPD模型大鼠肺功能及病理切片結(jié)果與造模后給藥前的結(jié)果相一致。

TNF-α 可放大COPD 炎癥過程，參與氣道炎癥狀態(tài)的形成，其表達(dá)伴隨氣道炎癥狀態(tài)加重而增加[42]。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清及BALF 中TNF-α 含量顯著升高，提示COPD 大鼠肺組織及氣道有慢性炎癥反應(yīng)。COPD 發(fā)病過程中存在免疫細(xì)胞分化及功能的紊亂[43]，Notch信號(hào)通路在調(diào)節(jié)呼吸系統(tǒng)疾病Th1/Th2 免疫失衡中發(fā)揮重要作用[44]，Notch 信號(hào)通路過度激活介導(dǎo)的Th1 和Th2 細(xì)胞失衡是COPD 重要發(fā)病機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組存在Th1/Th2 免疫失衡，平衡向Th2 方向移動(dòng)，提示COPD 發(fā)病過程中存在免疫紊亂。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肺組織Notch1、Hes1、Hey1蛋白及mRNA 表達(dá)顯著升高，提示Notch 信號(hào)通路在COPD大鼠體內(nèi)被激活，參與發(fā)病過程。

芪蛭皺肺顆?？赡芡ㄟ^抑制Notch 信號(hào)通路過度表達(dá)，進(jìn)而促使Th1/Th2 免疫平衡恢復(fù)，對(duì)COPD 發(fā)揮抗炎及保護(hù)肺功能的作用。研究結(jié)果表明，與模型對(duì)照組大鼠比較，芪蛭皺肺高、中、低劑量組大鼠血清及BALF 中TNF-α 含量顯著降低，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Th1/Th2 免疫平衡得到一定恢復(fù)，平衡向Th1 方向移動(dòng)，提示芪蛭皺肺顆粒通過調(diào)節(jié)Th1/Th2 免疫平衡從而減輕炎癥反應(yīng)；IHC、Western blot 及PCR 結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組大鼠比較，芪蛭皺肺高、中、低劑量組大鼠Notch1、Hes1、Hey1 蛋白及mRNA 表達(dá)顯著降低，提示芪蛭皺肺顆粒通過抑制Notch 信號(hào)通路激活發(fā)揮對(duì)COPD 的治療作用。芪蛭皺肺高、中、低劑量組支氣管及其周圍肺泡病變均有所改善，組織結(jié)構(gòu)逐漸趨于正常，各給藥組PIF、PEF 顯著升高，佐證了芪蛭皺肺顆粒對(duì)肺組織結(jié)構(gòu)及肺功能的保護(hù)作用。

綜上所述，芪蛭皺肺顆?？烧{(diào)節(jié)COPD 大鼠免疫功能，減輕肺組織及氣道炎癥，其作用機(jī)制可能是通過抑制Notch 信號(hào)通路的過度表達(dá)，進(jìn)而促使Th1/Th2恢復(fù)平衡。本研究從免疫炎癥角度為芪蛭皺肺顆粒治療COPD 提供了理論依據(jù)，但未對(duì)組成成分深入分析，今后需進(jìn)一步探索其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，完善藥效、毒理實(shí)驗(yàn)；此外，中醫(yī)藥治療COPD 靶點(diǎn)較多，需繼續(xù)探究芪蛭皺肺顆粒防治COPD 的干預(yù)靶點(diǎn)，為臨床應(yīng)用提供參考。