王洪鑫，張石宇，2，金 陽(yáng)，曹陶濤，秦 琴，劉 文，＊＊

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 貴陽(yáng) 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 貴陽(yáng) 550001；3.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴陽(yáng) 550004；4.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 貴陽(yáng) 550025）

中藥大黃源于蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L.）、唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或藥用大黃（Rheum officinale Baill.）的干燥根及根莖。大黃具“將軍”之稱(chēng)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃之功效，用于實(shí)熱積滯便秘，血熱吐衄，目赤咽腫，癰腫疔瘡，腸癰腹痛，瘀血經(jīng)閉，產(chǎn)后瘀阻，跌打損傷，濕熱痢疾，黃疸尿赤，淋證，水腫；外用還可治燒燙傷[1]。除傳統(tǒng)功效外，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明大黃還具有廣泛的抗腫瘤、抗菌抗炎與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用[2-5]。

隨著大黃在臨床上使用越來(lái)越廣泛，使得誤用和濫用情況屢見(jiàn)不鮮，尤其是長(zhǎng)期或大量使用大黃導(dǎo)致的不良反應(yīng)較為嚴(yán)重。隨著其不良反應(yīng)事件的增多，大黃越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注。一項(xiàng)針對(duì)187例中草藥相關(guān)肝損傷（Herb induced liver injury，HILI）的前瞻性研究報(bào)道稱(chēng)，在導(dǎo)致HILI的中藥湯劑及中成藥組方中，大黃排在第3位[6]。有學(xué)者對(duì)香港瑪麗皇后醫(yī)院的45名慢性乙型肝炎患者進(jìn)行入院前瞻性用藥調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其中7名患者的肝功能障礙是由于對(duì)大黃等肝毒性中藥使用不當(dāng)造成的[7]。還有研究顯示，使用較小劑量的大黃可對(duì)肝損傷的大鼠起到治療作用，且治療效果隨著劑量的增加而降低[8]；若大黃使用劑量過(guò)大，則會(huì)對(duì)正常大鼠的肝臟造成損傷，且大黃肝毒性和大鼠年齡呈正相關(guān)[9]。此外，有研究表明大黃中的部分蒽醌類(lèi)物質(zhì)能夠通過(guò)損害線粒體功能[10]、抑制谷胱甘肽合成[11]以及影響脂肪酸代謝[12]從而導(dǎo)致肝臟毒性。

目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不僅用于藥物和中藥活性化合物發(fā)現(xiàn)、整體作用機(jī)制闡釋、藥物組合和方劑配伍規(guī)律解析等，在預(yù)測(cè)中藥毒性成分與闡明毒理機(jī)制方面也被廣泛應(yīng)用。孫思彤等[13]應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)確定補(bǔ)骨脂中的補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂異黃酮等顯著毒性成分通過(guò)作用于AKT1、mTOR、SRC、Bcl-2 等主要靶點(diǎn)參與調(diào)節(jié)PI3K-Akt-mTOR、MAPK、VEGF 等信號(hào)通路致肝毒性作用。傅甜等[14]應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探明雷公藤腎上腺功能減退的毒理作用，可能通過(guò)雷公藤毒性化合物作用于133 個(gè)核心靶點(diǎn)與107 條信號(hào)通路而產(chǎn)生。余雪純等[15]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)得到黃藥子中8-表黃獨(dú)素E 乙酸酯和黃獨(dú)素B 與蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)中度值最高的靶點(diǎn)雌激素受體1（ESR1）均具有較好的結(jié)合力。曹站霞等[16]應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討補(bǔ)骨脂致肝毒性機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂主要成分可抑制MAPK1、PIK3CA、AKT1 和JAK2 的mRNA 的表達(dá)，引起肝臟的損傷?；诖?，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[17-18]分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)大黃致肝毒性的機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為臨床安全有效使用大黃提供參考。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

文中所用數(shù)據(jù)庫(kù)可見(jiàn)表1。

表1 文中所用數(shù)據(jù)庫(kù)

1.1.1 大黃潛在毒性成分預(yù)測(cè)及靶點(diǎn)獲取

應(yīng)用TCMSP 平臺(tái)[19]，獲取大黃化學(xué)成分信息，并依據(jù)Lipinski 五原則[20]，即分子量（MW）小于500，氫鍵供體數(shù)目（Hdonor）小于5，氫鍵受體數(shù)目（Hacceptor）小于10，脂水分配系數(shù)（AlogP）小于5以及口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30% 和類(lèi)藥性（Drug likeness，DL）≥0.18 作為指標(biāo)參數(shù)進(jìn)行篩選，再通過(guò)CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索其毒理學(xué)信息，篩選得到大黃潛在致毒成分。

應(yīng)用TCMSP 平臺(tái)可獲取部分靶點(diǎn)信息，將所得信息輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因名稱(chēng)簡(jiǎn)化修正。此外，利用TCMIP 數(shù)據(jù)庫(kù)也可得到部分成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息。最后，基于PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取成分對(duì)應(yīng)的SMILES 號(hào)，鍵入SwissTargetPrediction 平臺(tái)[21]，選擇物種屬性“Homo sapiens”，預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)，剔除Probability<0 的靶點(diǎn)。將上述三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶點(diǎn)信息去重整理，得到大黃潛在毒性成分靶點(diǎn)。

1.1.2 大黃致肝毒性靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以“l(fā)iver injury”、“hepatotoxicity”為關(guān)鍵詞，通過(guò)CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)[22]以及GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)查找疾病相關(guān)基因靶點(diǎn)，其中CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果保留推理分?jǐn)?shù)（Inference score）>200 的靶點(diǎn)，GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果保留相關(guān)系數(shù)（Relevance score）>7 的靶點(diǎn)。將上述3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶點(diǎn)信息去重整理，得到疾病相關(guān)基因靶點(diǎn)。將整理得到的成分靶點(diǎn)和肝毒性靶點(diǎn)導(dǎo)入微生信平臺(tái)制作韋恩圖，進(jìn)行可視化處理，得到交集靶點(diǎn)即為大黃致肝毒性靶點(diǎn)。

1.1.3 蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將大黃致肝毒性靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 平臺(tái)，限定物種為人源，設(shè)置最低互作分?jǐn)?shù)為0.900，隱藏離散節(jié)點(diǎn)，獲取靶點(diǎn)互作情況。利用Cytoscape 3.9.1 軟件中的CytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，以大于介?shù)中心性（Betweenness centrality，BC）、緊密中心性（Closeness centrality，CC）中位數(shù)和度值（Degree）均數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，得到核心靶點(diǎn)。

1.1.4 GO與KEGG富集分析分析

將大黃致肝毒性靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)[23]，選擇標(biāo)識(shí)符為OFFICAL-GENE-SYMBOL，物種限定為人源，列表類(lèi)型選擇為基因列表，保存GO 類(lèi)目下的BP、CC、MF 數(shù)據(jù)和KEGG 數(shù)據(jù)，設(shè)定閾值P<0.01，按P值排序，利用微生信平臺(tái)制作對(duì)應(yīng)的富集氣泡圖。

1.1.5 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

將得到的潛在致毒成分、PPI 互作得到的核心靶點(diǎn)與篩選出的前15 條信號(hào)通路及其相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF 級(jí)KM 小鼠，體質(zhì)量18-22 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010）。

大黃酸（Rhein，RH）、磺胺苯吡唑（Sulfamethazole，SFP）、1-氨基苯并三唑（1-Aminobenzotriazole，ABT）購(gòu)自美國(guó)Ark 公司；利福平（Rifampicin，RFP）購(gòu)自Innochem 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco 公司；鼠尾膠原蛋白Ⅰ型、HEPES、EDTA、Percoll 青霉素-鏈霉素、0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、快速封閉液、一抗稀釋液、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購(gòu)自Solarbio 公司；膠原酶Ⅳ購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；CCK-8 購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)marker 購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；β-actin 抗體、γ-H2AX抗體、PARP-1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；一抗稀釋液、苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白上樣緩沖液、快速封閉液裂解液、PVDF 膜購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純。

Nikon 倒置顯微鏡、TS100 倒置顯微鏡（Nikon 公司），CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱、Modle680 酶標(biāo)儀、超低溫冰箱、Fresco17 冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific 公司），HHS11-4 電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），SP-MiniPump 型蠕動(dòng)泵（保定申辰泵業(yè)有限公司），低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），超凈臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司），EL204型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）小鼠原代肝細(xì)胞的分離：依照經(jīng)典的Seglen門(mén)靜脈兩步灌注法分離小鼠原代肝細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行創(chuàng)新，采用Percoll單密度梯度離心法純化肝細(xì)胞[24]。小鼠術(shù)前12 h 禁食不禁水，麻醉小鼠，用75%乙醇胸腹部消毒后固定于手術(shù)臺(tái)上，上腹部開(kāi)腹，將腸胃移向右側(cè)，露出肝門(mén)靜脈，插入留置針，打開(kāi)泵灌注，調(diào)節(jié)流速為4 mL·min-1，當(dāng)肝變黃時(shí)，切開(kāi)下腔靜脈，直至整個(gè)肝變黃，且所沖出的溶液澄清時(shí)關(guān)泵，換后灌流液，繼續(xù)以4 mL·min-1的流速進(jìn)行灌流，并反復(fù)按壓下腔靜脈使肝臟膨脹，最后灌至肝臟表面出現(xiàn)裂隙，肝臟柔軟易碎，壓之凹陷不易恢復(fù)時(shí)關(guān)泵，將肝臟完整取下，放在裝有DMEM 的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌超凈臺(tái)。將細(xì)胞輕輕刮下，轉(zhuǎn)移懸液至200 目的篩網(wǎng)中過(guò)濾，充分混勻后轉(zhuǎn)移至15 mL 的離心管中，2000 r·min-1離心3 min，棄上清，加入35%細(xì)胞分離液，二次離心，即得小鼠原代肝細(xì)胞。向細(xì)胞沉淀中加入5 mL含1%雙抗、10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基計(jì)數(shù)；同時(shí)將0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液與細(xì)胞懸液以1∶9 比例混勻（終濃度為0.04%），染色3 min，計(jì)算細(xì)胞存活率。再將細(xì)胞懸液按照一定比例稀釋?zhuān)?.8×104個(gè)每孔的密度接種至0.012 mg·mL-1鼠尾膠原蛋白Ⅰ型包被的96 孔板，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

（2）光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：將小鼠原代肝細(xì)胞懸液以4×105的密度接種于6 孔板，在37℃和5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，加入按照梯度稀釋法配制的含有0，50，100，200 μmol·L-1RH 的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗細(xì)胞，加入適量PBS，在光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

（3）CCK-8 細(xì)胞毒性分析實(shí)驗(yàn)：加入按照梯度稀釋法配制的含有0、12.5、25、50、100、150、200 μmol·L-1RH 的培養(yǎng)基，每組5 個(gè)復(fù)孔，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h 后，棄去孔中原有培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8的細(xì)胞培養(yǎng)基100 μL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)的OD 值。重復(fù)3 次，計(jì)算各劑量組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。細(xì)胞存活率（%）=[(As-Ab]/(Ac-Ab)]×100%。其中：As：實(shí)驗(yàn)孔（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、藥物），Ac：對(duì)照孔（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒(méi)有藥物），Ab：空白孔（不含細(xì)胞和藥物的培養(yǎng)基、CCK-8）

（4）CYP2C9 抑制實(shí)驗(yàn)：將小鼠原代肝細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板中，在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，約4 h 后換液，再繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用PBS 溶液清洗細(xì)胞表面兩次，然后設(shè)置分組：空白溶劑組，ABT 200 μmol·L-1+RH（0-200 μmol·L-1）組，SFP 20 μmol·L-1+RH（0-200 μmol·L-1）組，每組5 個(gè)復(fù)孔。在給予細(xì)胞RH 前，先用對(duì)應(yīng)抑制劑預(yù)處理細(xì)胞2 h，給藥后培養(yǎng)24h。CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞存活率，具體操作同上。

（5）CYP2C9 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：將小鼠原代肝細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板中，在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，約4 h 后換液，再繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用PBS 溶液清洗細(xì)胞表面兩次，加入RFP 20 μmol·L-1，誘導(dǎo)72 h，期間每24 h 進(jìn)行換液，誘導(dǎo)結(jié)束后，加入培養(yǎng)基稀釋的RH（0-200 μmol·L-1），每組5 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞存活率，具體操作同上。

（6）Western blot 檢測(cè)PARP-1、γ-H2AX 蛋白表達(dá)水平：用不同濃度的RH 處理后再培養(yǎng)24 h，加入Ripa裂解細(xì)胞，離心取上清，采用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。已知濃度蛋白以1∶4的比例與蛋白上樣緩沖液完全混合，100℃條件下10 min使蛋白失活。冷卻后進(jìn)行恒壓電泳（低電壓80 V，20 min；高電壓120 V，90 min），轉(zhuǎn)膜（恒壓25 V，30 min），封閉1h。于4℃下用適量一抗（γ-H2AX：1∶1000、PARP-1∶1∶1000、β-actin∶1∶5000）孵育過(guò)夜，二抗（1∶1000）室溫孵育1 h，加入ECL 化學(xué)發(fā)光溶液，曝光，固定顯影，掃描拍照保存。利用Quantity-one 凝膠成像分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)的灰度值進(jìn)行分析，結(jié)果用目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 大黃潛在毒性成分預(yù)測(cè)及靶點(diǎn)獲取

參照Lipinski 五原則、OB≥30%和DL≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索成分毒理學(xué)信息，篩選得到大黃潛在致毒成分為大黃酸（rhein）、蘆薈大黃素（aloe-emodin）、(-)-兒茶素水合物[(-)-catechin]，經(jīng)過(guò)去重整理后得到對(duì)應(yīng)成分靶點(diǎn)106個(gè)。成分基本信息見(jiàn)表2。

表2 大黃潛在致毒成分

2.1.2 大黃致肝毒性靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

經(jīng)過(guò)去重整理得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)3063個(gè)，與成分靶點(diǎn)取交集，得到大黃致肝毒性靶點(diǎn)71 個(gè)。利用Venny 2.1.0 平臺(tái)制作韋恩圖，進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 成分靶點(diǎn)與肝毒性靶點(diǎn)韋恩圖

2.1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了獲得潛在靶點(diǎn)交互作用的信息，將71個(gè)潛在靶點(diǎn)上傳到STRING 平臺(tái)，獲得靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。靶蛋白用節(jié)點(diǎn)（node）表示，節(jié)點(diǎn)之間用邊（edge）表示，共有7個(gè)節(jié)點(diǎn)和570條邊。將結(jié)果的TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 進(jìn)行可視化和拓?fù)浞治?，以大于BC、CC 中位數(shù)和D 值均數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，得到核心靶點(diǎn)17個(gè)，按照度值大小排序，結(jié)果見(jiàn)表3。這17個(gè)核心靶點(diǎn)可能在大黃導(dǎo)致肝損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

圖2 交集靶點(diǎn)PPI互作圖

表3 核心靶點(diǎn)蛋白拓?fù)鋮?shù)信息

2.1.4 GO與KEGG富集分析

經(jīng)P<0.01 篩選后，得到233 條GO 結(jié)果，其中生物過(guò)程（Biological process，BP）162 條、細(xì)胞組成（Cellular component，CC）19 條、分子功能（Molecular function，MF）52 條，分別選取前10 條進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見(jiàn)圖3。BP 主要涉及正向細(xì)胞凋亡調(diào)控、外源代謝過(guò)程以及雌二醇響應(yīng)過(guò)程等；CC 主要涉及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)以及線粒體等；MF 主要涉及酶結(jié)合、芳香化酶活性以及血紅素結(jié)合等。經(jīng)P<0.01 篩選后，得到34 條通路結(jié)果，前15 名結(jié)果見(jiàn)圖4。其中包括化學(xué)物質(zhì)致癌作用-DNA 加合物通路（Chemical carcinogenesis-DNA adducts）、P450 酶藥物代謝通路（Drug metabolism-cytochrome P450）、癌癥通路（Pathways in cancer）、P450 酶外源性物質(zhì)代謝通路（Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）以及細(xì)胞凋亡通路（Apoptosis）等?？紤]到癌癥通路與肝毒性聯(lián)系不大，將其排除，前5 通路中其余4 條都與CYP450 酶相關(guān)，結(jié)合PPI 蛋白互作得到的核心靶點(diǎn)結(jié)果，排名靠前的與CYP450酶相關(guān)的只有CYP2C9酶，便將其作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)象。此外，KEGG 結(jié)果提示大黃致肝毒性與細(xì)胞DNA損傷以及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，后續(xù)選擇此機(jī)制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖3 GO通路富集分析

圖4 KEGG通路富集分析

2.1.5 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖5，該網(wǎng)絡(luò)中有58 個(gè)節(jié)點(diǎn)，129 條邊。按度值對(duì)涉及到的三個(gè)潛在毒性成分進(jìn)行排序，結(jié)果：rhein（RH）11.0>aloe-emodin（AE）5.0>(-)-catechin 1.0(CA)。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研與前期實(shí)驗(yàn)工作基礎(chǔ)，選擇RH作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證成分。

圖5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 RH對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察到未經(jīng)RH 處理的小鼠原代肝細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則多邊形，為典型的肝細(xì)胞形態(tài)，而用不同濃度的RH 處理24 h后，細(xì)胞形態(tài)會(huì)隨著RH濃度的增加，逐漸出現(xiàn)皺縮、變圓，甚至在處理濃度為200 μmol·L-1時(shí)大部分從底壁脫落，說(shuō)明RH 引起的細(xì)胞形態(tài)變化具有濃度效應(yīng)關(guān)系。具體結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 RH對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2.2 CCK-8分析細(xì)胞毒性結(jié)果

結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度的RH 處理6-48 h后，原代肝細(xì)胞活力具有顯著性差異：與空白組相比，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞活力明顯降低；隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，RH 對(duì)細(xì)胞抑制作用更為明顯。以上結(jié)果提示RH 的作用具有劑量與時(shí)間依賴(lài)性。具體結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 不同濃度RH作用小鼠原代肝細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞活力變化

2.2.3 CYP2C9抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制CYP2C9酶可以抑制RH對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞的毒性，與對(duì)照組相比，RH對(duì)細(xì)胞活力的抑制呈劑量依賴(lài)性，而ABT和SFP可減弱這種毒性效應(yīng)。當(dāng)暴露于不同濃度的RH時(shí)，與無(wú)ABT和SFP的處理組相比，ABT和SFP分別使細(xì)胞活力顯著增長(zhǎng)了3.52%-32.56%和2.26%-27.52%，其中CYP450廣譜抑制劑ABT抑制效果比CYP2C9專(zhuān)屬抑制劑SFP強(qiáng)。具體結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 RH對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞的毒性

2.2.4 CYP2C9誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)RFP 誘導(dǎo)CYP2C9，可增加RH 對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞的毒性。在25-100 μmol·L-1RH 處理的情況下，與不含RFP 的孵育組相比，20 μmol·L-1RFP 的引入導(dǎo)致了細(xì)胞活力顯著下降（下降2.01%-17.24%）。具體結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 RH對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞的毒性

2.2.5 RH誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞DNA損傷與凋亡

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨RH 濃度的升高，PARP-1 和γ-H2AX 表達(dá)呈濃度依賴(lài)性，提示RH 能夠誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞DNA 損傷，促使細(xì)胞凋亡。具體結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 γ-H2AX和PARP-1蛋白水平隨RH濃度的變化

3 討論

大黃多樣的藥理作用與其所含有的多樣的化合物密切相關(guān)，迄今為止，已從18 種大黃屬植物中分離得到約200 個(gè)具有6 種不同類(lèi)型骨架的化合物，包括蒽醌類(lèi)、蒽酮類(lèi)、二苯乙烯類(lèi)、黃酮類(lèi)、?；咸烟擒疹?lèi)和吡喃酮類(lèi)，這些化合物具有廣泛的藥理活性，包括瀉下、利尿、抗癌、保肝、抗炎以及鎮(zhèn)痛等作用[25]。然而，近年來(lái)其毒理作用研究報(bào)道也逐漸增多。鄧諾[26]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)大黃和大黃蒽醌高劑量均可下調(diào)腎臟組織的Clusterin mRNA 表達(dá)，這可能會(huì)抑制機(jī)體的抗凋亡能力和降低對(duì)腎臟的保護(hù)作用，從而使得腎臟損傷風(fēng)險(xiǎn)增大；同時(shí)大黃蒽醌高劑量可降低腎臟組織的OAT1 和OAT3 mRNA 表達(dá)，降低PAH 的清除率，這提示大黃蒽醌高劑量可能會(huì)抑制有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子的功能，從而導(dǎo)致有害的物質(zhì)在腎臟中蓄積，發(fā)生腎毒性反應(yīng)。王敏等[27]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，生大黃的鞣質(zhì)、總蒽醌及游離蒽醌含量分別為3.59%、1.96% 和1.03%，而經(jīng)過(guò)炮制后的熟大黃鞣質(zhì)、總蒽醌及游離蒽醌含量分別為0.33%、1.86%和1.27%，與對(duì)照組比較，生大黃呈現(xiàn)不同程度的肝臟變性，而相同濃度下的熟大黃給藥組，僅在高濃度條件下呈現(xiàn)輕微的肝臟變性。這提示生大黃肝毒性可能與鞣質(zhì)以及蒽醌類(lèi)物質(zhì)相關(guān)。

RH 作為大黃中主要的蒽醌類(lèi)成分之一，具有廣泛的藥理作用與毒理作用。RH 可增強(qiáng)亞胺培南-西司他丁對(duì)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠的抗菌活性，其機(jī)制是通過(guò)抑制OATs 減少了亞胺培南的腎臟清除[28]。此外，經(jīng)RH 預(yù)處理可改善膿毒癥小鼠整體代謝狀況，改善ALI，并通過(guò)調(diào)節(jié)代謝和抑制膿毒癥肺損傷早期過(guò)度炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞過(guò)度活化[29]。與此同時(shí)，大黃酸的毒理作用也不應(yīng)忽視。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期使用大黃可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥、結(jié)腸結(jié)構(gòu)的炎癥改變、潰瘍性結(jié)腸炎形成以及RH 在結(jié)腸的蓄積，而RH 蓄積可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，這可能與結(jié)腸毒性包括潰瘍性結(jié)腸炎形成有關(guān)[30]。經(jīng)RH 處理的大鼠心肌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)萎縮、變圓、管壁脫落現(xiàn)象，同時(shí)可誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞S 期阻滯，抑制細(xì)胞增殖從而表現(xiàn)出心臟毒性[31]。

細(xì)胞色素P450 酶是以硫醇鹽和血紅素為活性中心，能夠利用分子氧對(duì)底物進(jìn)行立體和區(qū)域選擇性氧化的一種氧化還原酶，其包含的主要蛋白質(zhì)為含鐵的血紅蛋白和黃素蛋白[32]。其基本的氧化過(guò)程為，將電子從NADPH 轉(zhuǎn)移到CYP 底物復(fù)合物中，底物與CYP的結(jié)合位點(diǎn)緊鄰血紅素-鐵復(fù)合物。鐵最初為Fe3+，通過(guò)細(xì)胞色素P450 酶從NADPH 轉(zhuǎn)移一個(gè)電子，將血紅素鐵從三價(jià)態(tài)還原為亞鐵態(tài)，同時(shí)一個(gè)氧原子被插入底物中，另一個(gè)氧原子形成H2O[33]。有研究報(bào)道，RH可通過(guò)CYP2C9 代謝活化，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的毒性。研究表明，RH（50 μmol·L-1）通過(guò)產(chǎn)生活性氧（ROS）、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+、降低線粒體膜電位和耗竭細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）含量，最終導(dǎo)致大鼠原代肝細(xì)胞凋亡，且100 nmol·L-1的環(huán)孢素A 可有效緩解這種凋亡作用[34]。而Koramagazi 等[35]通過(guò)膜聯(lián)蛋白-V/PI 雙染色分析和Hoechst 33258 染色發(fā)現(xiàn)RH 可引發(fā)原代人肝HL-7702細(xì)胞凋亡，使用鈣蛋白酶抑制劑I 預(yù)處理可有效降低其對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)和JNK 激活的影響，提示RH 通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和提高細(xì)胞內(nèi)鈣水平誘導(dǎo)HL-7702 細(xì)胞凋亡。Xu等[36]在給予RH 的大鼠尿液和膽汁中檢測(cè)到1 個(gè)單羥基化代謝產(chǎn)物，同樣地，在RH 暴露后的大鼠和人肝微粒體孵育產(chǎn)物中也觀察到對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RH 在胞漿GSTs 存在的情況下可與GSH 結(jié)合反應(yīng)，且CYP 2C9 是負(fù)責(zé)RH 代謝活化的主要酶，這與本研究結(jié)論一致。

DNA 作為遺傳信息的載體，其中任何位置出現(xiàn)損傷，都可能會(huì)引起遺傳信息的突變。DNA 的損傷大致可分為單個(gè)堿基突變和結(jié)構(gòu)扭曲兩個(gè)大類(lèi)。H2AX 組蛋白是染色體核小體組蛋白核心成員之一，當(dāng)DNA 雙鏈損傷（DSBs）時(shí)，組蛋白H2AX 的第139 位絲氨酸磷酸化形成γ-H2AX 簇集，因此對(duì)γ-H2AX 蛋白的定量可以反應(yīng)DSBs的發(fā)生程度[37]。當(dāng)然，生物也進(jìn)化出一系列修復(fù)基因的方法，其中DNA損傷的識(shí)別主要由聚腺苷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（PARPs）家族酶來(lái)完成，同時(shí)還參與了多種細(xì)胞活動(dòng)，包括DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)、能量代謝和細(xì)胞內(nèi)信息傳遞等。當(dāng)DNA損傷激活PARP 后，PARP 可通過(guò)自身修復(fù)作用，形成DNA 損傷激發(fā)的PARP活性循環(huán)，不過(guò)PARP過(guò)渡的活化也會(huì)引起細(xì)胞能量耗盡而死亡。PARP-1 作為PARP 酶家族的最重要的成員，至少占據(jù)了細(xì)胞PARP 酶總活性的80%以上，且PARP-1參與了細(xì)胞凋亡的過(guò)程，然后在Caspases 依賴(lài)的凋亡途徑中被激活，因此PARP-1在細(xì)胞凋亡中顯得尤為重要。因此選擇對(duì)PARP-1、γ-H2AX進(jìn)行了Western blot驗(yàn)證。

參照《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》[38]，結(jié)合《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》解讀[39]兩篇文章，本文收集了肝毒性疾病表型數(shù)據(jù)與大黃化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)，得到疾病表型-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)與藥物-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，構(gòu)建了疾病表型-標(biāo)靶-藥物網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了可視化分析，功能富集分析，確定了活性成分RH，關(guān)鍵靶點(diǎn)CYP2C9 以及關(guān)鍵通路細(xì)胞凋亡，最后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，符合《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》的要求。然而此文也有缺點(diǎn)，首先是驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)僅有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證據(jù)不夠充分。此外，文中TCMSP 等數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)來(lái)源主要是從科學(xué)文獻(xiàn)和公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取的。這些數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的篩選和驗(yàn)證，包括驗(yàn)證化合物的結(jié)構(gòu)、活性和藥物相互作用的真實(shí)性等。因此，來(lái)源數(shù)據(jù)具有較高的準(zhǔn)確性和查全性。然而，依賴(lài)于文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)仍然會(huì)受到文獻(xiàn)本身的限制，如實(shí)驗(yàn)條件的不一致、樣本量等問(wèn)題，加之中藥的復(fù)雜性和多樣性，TCMSP 等數(shù)據(jù)庫(kù)可能無(wú)法包含所有中藥活性成分和相關(guān)的靶點(diǎn)信息，這可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。藥物與靶標(biāo)之間的相互作用涉及多個(gè)層次和復(fù)雜性，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也無(wú)法完全捕捉所有相互作用的細(xì)節(jié)和動(dòng)態(tài)過(guò)程，也忽視了藥物在整個(gè)生物系統(tǒng)中的其他非特定作用和相互影響，不能全面評(píng)估藥物的整體效應(yīng)。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)RH 導(dǎo)致肝毒性與CYP450 酶密切相關(guān)，文中選擇排名靠前的CYP2C9作實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表明其是大黃導(dǎo)致肝毒性的原因之一。然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)暴露于不同濃度的RH 時(shí)，CYP450 廣譜抑制劑ABT 抑制效果比CYP2C9 專(zhuān)屬抑制劑SFP 強(qiáng)，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是能夠誘導(dǎo)RH 代謝活化的CYP450 酶不僅僅只有CYP2C9，可能還存在其它酶系，后續(xù)考慮對(duì)這一部分內(nèi)容進(jìn)行挖掘。

綜上所述，本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步篩選大黃潛在致肝毒性機(jī)制，得到大黃潛在活性毒性成分RH，尋找到核心靶點(diǎn)17 個(gè)，綜合分析之下選擇CYP2C9 作為驗(yàn)證靶點(diǎn)，通過(guò)原代肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)出的通路信息進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果證明大黃中RH 能夠顯著抑制小鼠原代肝細(xì)胞活力，其對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞的毒性可能是CYP2C9 對(duì)RH 代謝活化所致；RH 可激活PARP-1，使H2AX 磷酸化，誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞DNA 損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)肝臟毒性。